الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر: تقنية لتحديد توطين البروتينات في الخلايا الليفية للفئران

الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر هو تقنية تصوير متخصصة لتوطين بروتين أو مستضد محل اهتمام في عينة خلية أو أنسجة عن طريق تسمية المستضد بصبغة فلورية مترافقة بالأجسام المضادة واكتشاف إشارة الفلورسنت. إنه يوفر دقة مكانية أعلى من الفحص المجهري الفلوري واسع المجال ، بمساعدة فتحتين موضوعتين في المستوى البؤري للعدسة الشيئية ، مما يمنحها الاسم الكونفوكيالي. إنه يمكن المستخدمين من تصور التلوين على المستوى تحت الخلوي ، مثل التمايز بين تلطيخ الغشاء السطحي من التلوين داخل الخلايا.

يتبع المجهر متحد البؤر مبدأ أساسيا مشابها للمجهر الفلوري الكلاسيكي. ينعكس الشعاع من مصدر الضوء ، وعادة ما يكون ليزر للكونفوكال ، بواسطة مرآة ثنائية اللون ويركز بواسطة عدسة موضوعية على العينة. يثير هذا الضوء الفلوروفورات لتنبعث منها طول موجي مختلف ، والذي ينتقل مرة أخرى عبر العدسة الموضوعية والمرآة ثنائية اللون إلى الكاميرا أو العدسة.

ترجع الدقة المحسنة للمجهر متحد البؤر بشكل أساسي إلى وجود فتحتين ، وهما فتحات صغيرة جدا لمرور الضوء على مسارات ضوء الإثارة والانبعاث. يتم وضع الثقوب بشكل استراتيجي في المستوى البؤري للعدسة الشيئية. الآن ، دعنا ننتقل إلى مخطط العرض الجانبي لترتيب المجهر لمراجعة مسار الضوء. بعد المرور عبر ثقب الإثارة ، يكون لشعاع ضوء الإثارة تأثير النشأة من نقطة محورية ، مما يمكن العدسة الموضوعية من تركيز الضوء بعد ذلك على نقطة على العينة أيضا. تتلاقى حزمة الانبعاث من هذه النقطة المحورية عند ثقب الانبعاث ، مما يسمح لها بالمرور. الآن أثناء الإثارة ، تكون الفلوروفورات داخل مسار الضوء ، أعلى وأسفل النقطة المحورية ، متحمسة قليلا أيضا. بينما يمر ضوء الانبعاث الناشئ من النقطة المحورية عبر الثقب ، تتلاقى الانبعاثات من النقاط الخارجة عن التركيز قبل أو بعد ثقب الانبعاث ، وبالتالي يتم حظرها ، مما يؤدي إلى تقليل تألق الخلفية.

يجب تكرار دورة اكتشاف الإثارة والانبعاثات لكل نقطة تصوير في المنطقة محل الاهتمام ، والتي يمكن إجراؤها بعدة طرق مختلفة. على سبيل المثال ، يستخدم المسح بالليزر متحد البؤر مرايا مسح الجلفانومتر ، والتي تحرف ضوء الإثارة بزوايا مختلفة. ومن ثم ، كنس شعاع الضوء عبر العينة في المستوى XY. يستخدم قرص الغزل متحد البؤر قرصا به مجموعة من الثقوب ، والتي تدور لتغيير ترتيب الثقوب. يتيح ذلك للمستخدمين إضاءة نقاط تصوير صغيرة متعددة في العينة في كل مرة ، وتغطية المنطقة بأكملها تدريجيا أثناء دوران القرص. نتيجة للثقوب ، تمثل صورة XY في الكاشف مستوى Z ضيقا. لذلك ، يمكن جمع الصور من سلسلة من مستويات Z المتتالية ، والتي يشار إليها غالبا باسم مكدس Z. من هذه الصور ، يمكن للبرنامج المناسب إنشاء تصوير ثلاثي الأبعاد لنمط إشارة التألق في العينة.

في هذا البروتوكول ، ستلاحظ تلغينا مناعيا للأرومات الليفية للفأر ، متبوعا بالتصوير على مجهر متحد البؤر لتصور بروتين سطح الخلية والبروتين الليزوزومي بشكل تفاضلي.

للبدء ، باستخدام تقنيات معقمة ، قم بتعليق الخلايا ذات الأهمية في 500 ميكرولتر من وسائط النمو لكل بئر ، ثم قم بزرعها في آبار شريحة غرفة من أربعة آبار. هنا ، نستخدم الخلايا الليفية للفئران التي تم نقلها للتعبير عن الجزيء المقدم للمستضد ، CD1d. للسماح للخلايا بالالتصاق بالزجاج ، ضع شريحة الغرفة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية ، واحتضانها طوال الليل. في الصباح ، قم بشفط الوسائط من كل بئر ، ثم اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 500 ميكرولتر من PBS لبضع ثوان.

لإصلاح الخلايا ، أضف 500 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهيد بنسبة 1٪ في كل بئر ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اجمع بارافورمالدهيد في حاوية نفايات سائلة خطرة مناسبة ، ثم قم بإزالة أي بقايا من المثبت عن طريق غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لبضع ثوان.

للسماح باختراق الأجسام المضادة في الخلايا ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن النفاذية إلى كل بئر ، واحتضنه على المقعد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد النفاذية ، اغسل الخلايا لفترة وجيزة ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب إلى كل بئر ، واحتضنه لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

تحضير الأجسام المضادة الأولية ، المضادة ل CD1d ومضادة ل LAMP-1 ، بتركيزات عمل مناسبة. بعد ذلك ، قم بشفط المخزن المؤقت من الآبار وقم بتغطية الخلايا في كل بئر ب 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية المخففة ثم احتضان الشريحة على سطح مستو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية ، في هذه الحالة جسم مضاد مضاد للفئران والفئران بعلامات فلورية مميزة ، في منع المخزن المؤقت لتركيزات العمل المناسبة. بعد ذلك ، قم بشفط محلول الجسم المضاد الأساسي من الآبار ثم اغسل الخلايا أربع مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية المخففة إلى كل بئر ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد الحضانة ، قم بشفط محلول الجسم المضاد الثانوي واغسل الآبار أربع مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS لإزالة أي جسم مضاد ثانوي غير مرتبط.

لتركيب العينات بعد الغسيل النهائي ، افصل الغرف بعناية وقم بإزالتها من الشريحة. لإزالة PBS المتبقي ، أمسك الشريحة بزاوية فوق مسح مهمة دقيقة ، وقم بإزالة السائل من الحواف دون لمس الخلايا. بمجرد إزالة PBS الزائد ، أضف قطرة واحدة من وسط التركيب المضاد للبهتان ، الذي يحتوي على البقعة النووية DAPI ، على كل قسم من الخلايا. بعد ذلك ، خذ غطاء مقاس 20 × 60 ملم ، وباستخدام أطراف الأصابع فقط ، ابدأ في خفض الغطاء ببطء على أي من الحافتين ، مع الحرص على تجنب تكوين الفقاعات فوق الخلايا. امسح أي وسيط تثبيت إضافي على الشرائح بمسح دقيق للمهمة وقم بتخزين الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع.

لبدء تصوير الخلايا ، انقر أولا على أيقونة برنامج NIS على سطح المكتب. بمجرد دخولك إلى نافذة التحكم ، انقر فوق علامة التبويب TiPad في الأعلى ، واختر الهدف المطلوب للتصوير. بعد ذلك ، قم بتحميل الشريحة بالخلايا على المسرح ، وقم بتوسيطها أسفل العدسة. بعد ذلك ، في علامة التبويب A1plus Compact GUI بجوار علامة التبويب TiPad ، قم بإعداد أشعة الليزر المناسبة للفلوروفورات المستخدمة. انقر فوق رمز الترس لفتح قائمة إعدادات الصبغة والطيف. بمجرد فتح قائمة إعدادات الصبغة والطيف ، حدد القنوات المطلوبة واضبط الليزر لكل قناة. ثم حدد الانبعاثات المناسبة في القائمة المنسدلة أسفل المرآة الأولى ثنائية اللون. بعد ذلك ، ضمن نافذة A1plus Compact GUI ، انقر فوق Ch.Series لإعداد سلسلة قنوات الخط ، والتي تحدد ما إذا كانت أشعة الليزر المستخدمة ستطلق على العينة في وقت واحد أو بالتتابع.

بعد ذلك ، ابدأ المسح بالنقر فوق رمز طرف السهم في الأعلى. في هذه المرحلة ، أثناء تشغيل التصوير ، ضمن نافذة A1plus Compact GUI ، انقر فوق المقياس المنزلق ، وقم بتعديل حجم الثقب لضمان الحد من الضوء خارج نطاق التركيز البؤري. بعد ذلك ، اضبط إعدادات الجهد العالي والإزاحة تحت كل ليزر إلى المستويات المناسبة باستخدام المقاييس المنزلقة لتمكين اكتشاف تلطيخ محدد مع الحد من أي تلطيخ محتمل في الخلفية. إذا توفرت عينة تلطيخ إيجابية ، فابدأ بتصوير هذه العينة لكل قناة للتأكد من أن إعدادات الليزر تنتج نسب إشارة إلى ضوضاء مثالية. بعد تعيين قيم الجهد العالي والإزاحة المثلى لكل ليزر ، انقر فوق علامة التبويب اكتساب الكثافة المحايدة ، ثم حدد أيقونة Z لإعداد المعلمات للسلسلة z.

بعد ذلك ، أثناء الحصول على صورة حية للعينة ، قم أولا بتعيين الجزء السفلي عن طريق العثور على الجزء السفلي من الصورة والنقر فوق الزر السفلي. ثم ابحث عن الموضع العلوي للعينة وانقر فوق الزر العلوي. قم بتعيين حجم الخطوة إما عن طريق كتابة حجم الخطوة المفضل بالميكرون لكل خطوة على وجه التحديد أو عن طريق تحديد عدد الخطوات الإجمالية المطلوبة. لتحديد الحجم / دقة البكسل المطلوبة للصورة ، انقر فوق نافذة واجهة المستخدم الرسومية Aiplus Compact ، وتحت رمز الحجم ، حدد الدقة المطلوبة.

لتقليل تشويش الصورة ، يمكنك تحديد القائمة المنسدلة بجوار رمز ثيتا لمتوسط عدد الصور المحدد. بعد ذلك ، انقر فوق علامة التبويب تشغيل الآن في قائمة اكتساب ND لبدء تصوير العينة. بعد اكتمال التصوير ، احفظ الصورة بالنقر فوق ملف ، ثم احفظ باسم ، والذي سيؤدي إلى تصدير ملف الصورة بالامتداد dot-nd2. أخيرا ، كرر العملية لكل عينة من العينات الأخرى.

في هذه التجربة ، تم إصلاح الخلايا الليفية للفأر التي تعبر عن جين البروتين السكري السطحي CD1d ، وصبغها المناعي ، وتصويرها على مجهر متحد البؤر. تظهر هذه الصورة قسما واحدا من مكدس Z بتكبير 40X، حيث يكون CD1d ملطخا باللون الأحمر. تم تلبيس العينة ب LAMP-1 ، وهي علامة ليزوزومية ، باللون الأخضر. تم استخدام البقعة النووية DAPI لإظهار نوى الخلايا.

في صورة مركبة حيث يتم دمج القنوات الثلاث المختلفة ، ينتج ظهور اللون الأصفر عن تداخل القناتين الحمراء والخضراء ، ويشير إلى منطقة يتم فيها توطين CD1d و LAMP-1 في الجسيمات الحالة. تشير المناطق التي يوجد بها لون واحد فقط إلى وجود CD1d أو LAMP-1 بدون توطين مشترك. تعرض هذه الصورة عرضا ثلاثي الأبعاد للخلايا التي تم إنشاؤها من الصور الملتقطة في z-stack ومكنت هذه الطريقة من إنشاء عرض جانبي لهذه المجموعة من الخلايا. تظهر هذه الصورة التالية شريحة من المكدس z بتكبير 100X ، مما يوضح أنماط التعبير لهذين البروتينين بمزيد من التفصيل. يعرض المربع المخطط باللون الوردي على الجانب الأيمن من الصورة المقطع العرضي للإحداثيات x المحددة بالخط الوردي في الصورة ، والذي يمثل المنظر الجانبي عند الخط الوردي. وبالمثل ، يظهر المربع الأزرق المحدد في أسفل الصورة المقطع العرضي للإحداثي y المحدد بالخط الأزرق في الصورة ، والذي يمثل المنظر الأمامي عند الخط الأزرق. يتيح العرض ثلاثي الأبعاد لصورة z-stack للمستخدمين عرض الصورة في 3D ، وتصور جميع مستويات x و y و z. يمكن استخدام هذا لدراسة التوطين المشترك للبقع المختلفة في مناطق مختلفة داخل الخلية.