التقنيات القائمة على الترسيب المناعي: تنقية البروتينات الذاتية باستخدام حبات الاغاروز

الترسيب المناعي ، أو IP ، هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لعزل بروتين ذي أهمية من خلية أو أنسجة محللة أو سائل الجسم لتوصيف البروتين أو للتحقيق في تفاعلات البروتين والبروتين.

تبدأ العملية بجسم مضاد له تقارب وخصوصية عالية للبروتين المستهدف. يتم خلط هذا الجسم المضاد مع العينة ، مما يسمح بتكوين مجمعات الأجسام المضادة المستهدفة. يرتبط أي بروتين مرتبط بالبروتين المستهدف أيضا بشكل غير مباشر بالجسم المضاد في هذه العملية. بعد ذلك ، يتم تحضين المحلول بحبات الاغاروز ، المترافقة مع بروتين بكتيري ، له تقارب قوي مع المنطقة الثابتة من الأجسام المضادة. يرتبط البروتين البكتيري بالجسم المضاد ويربط مجمعات الجسم المضاد المستهدفة بالخرز. بعد ذلك ، يتم طرد المحلول لترسيب الخرزات ، وبالتالي استخراج المركب بأكمله الذي يحتوي على الجسم المضاد المرتبط والبروتين المستهدف وأي بروتينات متفاعلة. أخيرا ، يتم استخراج البروتينات المرتبطة من الخرز وإطلاقها من بعضها البعض وتستخدم لمزيد من التحليل بتقنيات مثل النشاف الغربي.

يتم استخدام العديد من الاختلافات في أجزاء مختلفة من هذه التقنية بشكل شائع ، مثل المقاصة المسبقة ، أو استخدام علامات الببتيد أو الخرز المغناطيسي ، أو تحليل شركاء الربط الآخرين غير البروتينيين. يمكن أن يسبق IP خطوة المسح المسبق ، لإزالة البروتينات غير المحددة المرتبطة بالأجسام المضادة في العينة وتقليل الخلفية. يتضمن ذلك أولا احتضان العينة بأجسام مضادة للتحكم في النمط المتماثل ، مما يسمح لها بالارتباط بهذه البروتينات ، ثم استخدام حبات الاغاروز لترسيب المجمعات. ثم تكون العينة جاهزة للانتقال إلى IP الفعلي.

تكون علامات الببتيد مفيدة إذا لم يكن الجسم المضاد المحدد متاحا ل IP. هنا ، يمكن تعديل البروتين المستهدف وراثيا لاحتواء علامة حاتمة الببتيد والجسم المضاد ضد العلامة قادر على سحب البروتين محل الاهتمام. غالبا ما تستخدم الخرزات المغناطيسية بدلا من الاغاروز لتسريع الهدف. بعد الارتباط بمركب الجسم المضاد المستهدف ، يتم وضع أنبوب العينة في مجال مغناطيسي قوي ، والذي يستخرج الخرز من المحلول. هذا يلغي الحاجة إلى الطرد المركزي ويحسن السرعة والراحة.

يستخدم الترسيب المناعي أيضا لدراسة بروتينات ربط الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ويعرف باسم الترسيب المناعي للكروماتين والترسيب المناعي للحمض النووي الريبي ، على التوالي. هذه الاختلافات مفيدة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتكييف الطريقة للتطبيقات التجريبية المختلفة. في هذا الفيديو ، ستلاحظ كيفية التنظيف المسبق لمحللة الخلية وإجراء الترسيب المناعي لاستخراج بروتين ذي أهمية ، متبوعا بتحليل اللطخة الغربية للتحقق من صحة التجربة.

للبدء ، ضع الخلايا المجمعة مسبقا في جهاز طرد مركزي دقيق وقم بالدوران بسرعة 13 ألف دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية ثم أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول التحلل RIPA مع PMSF. الآن ، قم بتعطيل الخلايا باستخدام بضع نبضات سريعة مع دوامة ثم شفط المحللة عدة مرات بإبرة قياس 25 متصلة بحقنة ، مع الحرص على تجنب تكوين فقاعات. ضع الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد احتضان العينات على الجليد ، قم بالطرد المركزي للمحللات لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

قم بتسمية أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. بعد الدوران ، انقل المادة الطافية إلى الأنبوب الملصق حديثا وتخلص من الحبيبات. بعد ذلك ، قم بمسح المحللة مسبقا من الملوثات التي ترتبط بشكل غير محدد إما بخرز الاغاروز أو الجسم المضاد الأساسي عن طريق إضافة 20 ميكرولترا من حبات البروتين A / G PLUS-AGAROSE وميكروغرام واحد من الجسم المضاد للتحكم في النمط المتماثل إلى المحللة ، والذي في هذا المثال هو التحكم في النمط المتماثل IgG1 للفأر. احتضان الأنبوب على دوار في غرفة باردة لمدة 30 دقيقة. بعد تدوير المحللة في الغرفة الباردة لمدة 30 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 3200 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة الأنبوب من جهاز الطرد المركزي وانقل المادة الطافية التي تم تطهيرها مسبقا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. تخلص من الحبيبات.

الآن ، حدد تركيز البروتين في محللة الخلية عن طريق إجراء اختبار برادفورد. التسمية سبعة 1. أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 5 ملليلتر من واحد إلى ستة وأخذ عينة و 1000 ميكرولتر من كاشف برادفورد في كل أنبوب. سيتم استخدام ستة من الأنابيب لعمل منحنى قياسي عن طريق إضافة كميات مختلفة من الكميات المعروفة من BSA إلى كل أنبوب. المبالغ المطلوب إضافتها مدرجة في هذا الجدول. في أنبوب العينة السابع ، أضف ميكرولتر واحد من المحللة التي تم تطهيرها مسبقا. ضع 200 ميكرولتر من كل أنبوب من الأنابيب السبعة في آبار فردية لصفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا ، وكرر كل عينة في ثلاث نسخ بحيث يكون هناك ثلاثة أعمدة من سبع عينات. اقرأ اللوحة على قارئ اللوحة باستخدام طول موجي يبلغ 595 نانومتر. بعد إنشاء منحنى قياسي في Excel ، احسب تركيز البروتين في المحللة التي تم تطهيرها مسبقا.

بعد ذلك ، قم بتسمية أنبوبين من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر - أحدهما كعنصر تحكم والآخر كاختبار ، والذي سيكون في هذا المثال الجسم المضاد c-myc. ضع 500 ميكروغرام من المحللة التي تم تطهيرها مسبقا في كل من هذه الأنابيب ثم ارفع الحجم الإجمالي لكل أنبوب إلى 500 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت للتحلل. بعد ذلك ، أضف ميكروغرامين من الجسم المضاد ل c-myc إلى أنبوب مجموعة الاختبار. للتحكم ، أضف ميكروغرامين من الجسم المضاد للتحكم في النمط المتساوي IgG1 للفأر. بمجرد إضافة الأجسام المضادة إلى الأنابيب ، ضع العينات على دوار في غرفة باردة واحتضنها لمدة ساعتين. الآن ، أضف حبات الاغاروز. للقيام بذلك ، يوصى بقطع نهاية طرف الماصة ثم إضافة 200 ميكرولتر من حبات البروتين A / G PLUS-AGAROSE إلى كل أنبوب. احتضان الأنابيب على دوار في الغرفة الباردة طوال الليل.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الأنابيب من الدوار وقم بتدوير المحللات في جهاز الطرد المركزي الدقيق لسحب الخرز. بعد اكتمال الدوران ، قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي وشفط المادة الطافية من كل أنبوب. بعد ذلك ، اغسل الخرزات باستخدام 500 ميكرولتر من 1X Dulbecco's PBS. ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي دقيق وقم بالدوران لأسفل لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية. كرر خطوات الغسيل والطرد المركزي مرة أخرى ليصبح المجموع مرتين. قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الدقيق واستنشاق المخزن المؤقت من كل أنبوب. باستخدام أطراف تحميل الجل ، قم بإزالة أي مخزن مؤقت متبقي من الخرز ، مع الاحتفاظ بالخرز على الجليد لتصفية البروتين المرتبط.

في هذا المثال ، يتم تصريف البروتين في المخزن المؤقت الذي يعمل SDS-PAGE عن طريق الغليان لتحليل اللطخة الغربية. للقيام بذلك ، قم بتعليق الخرزات في 20 ميكرولترا من صبغة تحميل SDS-PAGE التي تحتوي على بيتا ميركابتو إيثانول ، أو BME. اغلي العينات على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لفصل المجمعات المناعية عن الخرز. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للحبات بأقصى سرعة لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الدقيق واحتفظ بها في رف في درجة حرارة الغرفة. باستخدام أطراف تحميل الهلام، قم بسحب العينات من الخرزات بعناية وتحميلها في آبار من جل SDS-PAGE متدرج بنسبة 4 إلى 15٪. بالإضافة إلى العينات ، قم بتحميل ممر بسلم بروتين بالإضافة إلى ممر به المحللة التي تم تطهيرها مسبقا لتكون بمثابة عنصر تحكم في التحميل. بمجرد تحميل الجل ، قم بتشغيل الجل عند 100 فولت.

بعد أن تصل واجهة الصبغة إلى قاع الجل ، والذي يجب أن يستغرق حوالي ساعة واحدة ، أوقف الجل واصنع شطيرة لطخة غربية ، مع التأكد من أن غشاء PVDF بين الجل والكاثود. ضع شطيرة اللطخة الغربية في جهاز النقل وانقل البروتينات الموجودة على الجل إلى الغشاء لمدة ساعة واحدة عند 100 فولت. بعد اكتمال النقل ، ضع الغشاء في خمسة ملليلتر من الكتلة لمنع الأجسام المضادة من الارتباط بالغشاء بشكل غير محدد. صخور في مكان منخفض لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. عندما يصدر صوت المؤقت ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر. أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت المانع مع الجسم المضاد للكشف إلى الغشاء. هنا ، يتم استخدام جسم مضاد مضاد ل c-myc ، يختلف عن الجسم المستخدم في السحب لأسفل.

احتضن اللطخة طوال الليل ، عند أربع درجات مئوية على هزاز في مكان منخفض. بعد الحضانة ، قم بإزالة الجسم المضاد وانسداد المخزن المؤقت. اغسل البقعة باستخدام خمسة ملليلتر من TBST لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة على كرسي هزاز في درجة حرارة منخفضة. يجب تكرار خطوة الغسيل هذه مرتين إلى خمس مرات ليصبح المجموع من ثلاث إلى ست غسلات ، باستخدام TBST طازج لكل غسلة. أضف خمسة ملليلتر من واحد إلى 1000 جسم مضاد ثانوي ومانع المخزن المؤقت للبقعة. في هذه الحالة ، يكون الجسم المضاد الثانوي هو سلسلة خفيفة مضادة للأرانب تحمل علامة HRP. احتضان اللطخة على الروك في إعداد منخفض لواحد في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت واغسل اللطخة بخمسة ملليلتر من TBST. احتضن هذا الغسول على كرسي هزاز في إعداد منخفض لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذا الغسيل لما مجموعه ستة إلى 12 غسلة ، كل منها يحتوي على خمسة ملليلتر من TBST. قم بإزالة الغسيل النهائي عن طريق سكب السائل أولا من اللطخة. بعد ذلك ، باستخدام ملاقط ، امسح حافة اللطخة على منديل مختبري لإزالة أي سائل زائد ثم ضع اللطخة في وعاء جديد. بعد ذلك ، قم بتغطية اللطخة بكاشف الكشف عن التلألؤ الكيميائي 1X واحتضانه لمدة دقيقة واحدة.

العمل بسرعة، امسح حافة اللطخة على منديل مختبري لإزالة أي كاشف كشف زائد ثم ضع اللطخة على سطح التصوير في درج التصوير. صور باستخدام برنامج Chemiluminescent لالتقاط نقاط زمنية متعددة من 10 إلى 30 ثانية. بعد تصوير اللطخة، اختر صورة ذات رؤية مثالية للنطاق ثم قم بتصدير تلك الصورة. قبل تحريك اللطخة، استخدم أداة التصوير لالتقاط صورة للبقعة لالتقاط موقع السلم. ثم قم بتصدير تلك الصورة أيضا. أخيرا ، باستخدام برنامج إعداد الشرائح ، مثل PowerPoint ، قم بمحاذاة النطاقات وصور السلم لتشكيل صورة واحدة.

توضح هذه الصورة نتيجة اللطخة الغربية للترسيب المناعي لبروتين c-myc من خلايا الخلايا الزعترية. من اليسار إلى اليمين ، تمثل الممرات التحكم في النمط المتماثل ، و c-myc IP ، ومدخلات المحللة التي تم مسحها مسبقا. الممر الموجود في أقصى اليمين هو صورة مدمجة لسلم الوزن الجزيئي. النطاق القوي ، الذي يبلغ حوالي 25 كيلوڈالتون ، هو من السلسلة الخفيفة والنطاق البالغ 50 كيلوڈالتون من السلسلة الثقيلة للجسم المضاد الملزم وغير محدد ب IP أو العينات. يمتد C-myc حوالي 67 كيلوڈالتون على البقع الغربية وعادة ما يكون مرئيا أسفل نطاق السلم 75 كيلودالتون. في هذه اللطخة ، يكون نطاق c-myc مرئيا في الممر الثاني ولكنه غائب في الممر الأول ، مما يشير إلى أن الجسم المضاد IP نجح في سحب c-myc. لا يوجد نطاق مرئي في ممر الليزات الذي تم تطهيره مسبقا ، مما يشير إلى أن هذا البروتين يحتوي على مستويات تعبير داخلية منخفضة.