تحليل دورة الخلية: تقييم تكاثر الخلايا التائية CD4 و CD8 بعد التحفيز باستخدام تلطيخ CFSE وقياس التدفق الخلوي

p class = "jove_title" >1. التحضير

1. قبل البدء ، ارتد قفازات المختبر والملابس الواقية المناسبة.
2. عقم جميع أدوات التشريح ، أولا بمنظف ثم باستخدام 70٪ إيثانول ثم امسحها حتى تجف جيدا.
3. تحضير 50 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) الذي يحتوي على 2٪ مصل عجل الجنين (FCS).

2. تشريح

1. باستخدام نظام توصيل ثاني أكسيد الكربون ، قم بالقتل الرحيم للفأر عن طريق نقص الأكسجة. قم بتأمين الفأر القتل الرحيم على لوحة تشريح في وضع الاستلقاء وقم بإجراء بضع البطن الطولي باستخدام المقص والملقط.
2. باستخدام الملقط ، حرك الأمعاء والمعدة على الجانب الأيمن من البطن لكشف المعدة والطحال. يرتبط الطحال بالمعدة.
3. باستخدام الملقط ، افصل الطحال بعناية عن المعدة وضعه في طبق بتري يحتوي على 5 مل من HBSS 2٪ FCS.

1. ضع الطحال على مصفاة خلية 40 ميكرومتر فوق نفس طبق بتري. سحق الطحال بمكبس لفصله.
2. انقل الطحال المنفصل والسائل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
3. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 × جم لمدة 7 دقائق عند 10 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية لتجنب الحبيبات.
4. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من أسيتات البوتاسيوم لتحلل كريات الدم الحمراء. انتظر لمدة دقيقتين ثم قم بتعويض الحجم حتى 15 مل باستخدام HBSS 2٪ FCS.
5. قم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى عند 370 × جم لمدة 7 دقائق عند 10 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من HBSS 2٪ FCS.
6. عد الخلايا باستخدام مقايسة تلطيخ الأزرق واضبط التركيز النهائي للخلية على 10⁷ خلايا / مل باستخدام حجم مناسب من HBSS 2٪ FCS.

1. توزيع 10⁷ خلايا / أنبوب طحال معزول في 4 أنابيب (أنابيب 15 مل ، تحمل علامة 1 إلى 4)
2. أضف 3 مل HBSS 2٪ FCS لكل أنبوب.
3. أضف 1 ميكرولتر من CSFE في كل أنبوب (التركيز النهائي - 5 ميكرومتر).
4. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO₂ لمدة 10 دقائق.
5. في الأنبوبين 3 و 4 ، أضف 12 مل من HBSS 2٪ FCS + الجسم المضاد ل CD3 بتركيز نهائي قدره 2.5 ميكروغرام / مل. يتم تحفيز الأنبوبين 3 و 4 باستخدام الجسم المضاد ل CD3 ، لمراقبة التأثير على دورة الخلية.
6. في الأنبوبين 1 و 2 ، أضف 12 مل من HBSS 2٪ FCS. لن يتم تحفيز الخلايا الموجودة في الأنبوبين 1 و 2.
7. جهاز الطرد المركزي جميع الأنابيب عند 370 × جم لمدة 7 دقائق عند 10 درجات مئوية.
8. أعد تعليق الكريات في 2 مل من HBSS 2٪ FCS.
9. انقل المحاليل الناتجة إلى آبار منفصلة على صفيحة من 6 آبار.
10. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 3 أيام.

1. في اليوم 3 ، أضف 2 مل HBSS 2٪ FCS في البئر 1 و 3.
2. Pipet بقوة ونقل العينات إلى أنابيب FACS سعة 5 مل.
3. استمر في احتضان الخلايا المتبقية من الآبار 2-4 عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. سيتم تحليلها في اليوم الخامس للتحقيق في الآثار طويلة المدى للتحفيز على دورة الخلية.
قم
4. بالطرد المركزي للأنابيب عند 370 × جم لمدة 7 دقائق عند 10 درجات مئوية.
5. أضف 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة (انظر الجدول 1) إلى كل أنبوب.