What is adoptive cell transfer and why is it used in research?

Adoptive cell transfer is a method for introducing cells into an organism to study biological mechanisms or treat disease. It enables researchers to examine specific immune cell functions, study hematopoiesis, and test novel therapies like cancer treatments where patient T-cells are extracted, modified to recognize tumors, and returned to fight cancer. Animal models allow detailed investigation of transferred cell behavior and efficacy.

Why are CD45.1 Rag gamma-c knockout mice used in adoptive transfer studies?

CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental cytokine receptors essential for normal lymphocyte development, resulting in compromised immune systems without natural killer cells, T-cells, or B-cells. These immunocompromised mice serve as ideal recipients for adoptive transfer because they allow researchers to study how donor immune cells establish and function in a lymphocyte-deficient host.

How are splenocytes isolated and purified from donor tissue?

The spleen is dissociated using a cell strainer and plunger to release cells into suspension. Unwanted erythrocytes are lysed using ammonium chloride potassium lysing buffer, and centrifugation separates white blood cells from debris. The resulting purified splenocytes are counted using trypan blue and adjusted to the desired concentration before transfer into recipient mice.

What is the role of flow cytometry in confirming successful adoptive transfer?

Flow cytometry using fluorescence-activated cell sorting (FACS) confirms transfer success by detecting donor cells in the host spleen. Labeled antibodies against donor markers like CD45.2 distinguish transferred cells from host cells. The technique allows researchers to identify specific lymphocyte populations, such as CD4 T-cells, and verify their presence and distribution in recipient mice.

How is the cell suspension prepared before intravenous injection into recipient mice?

The cell suspension is centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline through two sequential wash steps. The final pellet is resuspended in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, 200 microliters of this purified cell suspension is injected intravenously into the retro-orbital blood sinus of the recipient mouse.

What does the FACS analysis reveal about transferred versus host lymphocytes?

FACS analysis distinguishes CD45.2 positive transferred cells from CD45.1 positive host cells using dot plots. Transferred cells appear only in the transferred mouse sample, not in control mice receiving phosphate buffered saline alone. Further analysis identifies specific transferred lymphocyte subsets, such as CD4 T-cells, demonstrating both successful engraftment and the phenotype of donor cells within the host.

What compatibility factors must be considered before performing adoptive cell transfer?

Host and donor compatibility is crucial to ensure cell adoption without rejection. In this protocol, CD45.2 donor splenocytes are transferred into CD45.1 Rag gamma-c recipient mice, allowing discrimination between donor and host cells. This genetic distinction enables researchers to track transferred cells and assess their integration, survival, and function within the immunocompromised host environment.

نقل الخلايا بالتبني: تقديم خلايا طحال الفئران المانحة إلى الفأر المضيف وتقييم النجاح عبر FACS

0 مشاهدة11:04 دقيقة

< p class = "jove_title" >1. التحضير

قبل البدء ، ارتد قفازات المختبر والملابس الواقية المناسبة.
عقم جميع أدوات التشريح ، أولا بمنظف ثم بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم جففها جيدا.
تحضير 50 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) الذي يحتوي على 2٪ مصل عجل الجنين (FCS).

2. تشريح

باستخدام نظام توصيل ثاني أكسيد الكربون ، قم بالقتل الرحيم للفأر عن طريق نقص الأكسجة. قم بتأمين الفأر القتل الرحيم على لوحة تشريح في وضع الاستلقاء وقم بإجراء بضع البطن الطولي باستخدام المقص والملقط.
باستخدام الملقط يحرك الأمعاء والمعدة على الجانب الأيمن من البطن لكشف المعدة والطحال. يرتبط الطحال بالمعدة.
باستخدام ملقط ، افصل الطحال بعناية عن المعدة وضعه على طبق بتري يحتوي على 5 مل من HBSS 2٪ FCS.

< p class = "jove_title" >3. عزل الخلايا المناعية

ضع الطحال على مصفاة خلية 40 ميكرومتر فوق طبق بتري. سحق الطحال بمكبس لفصله.
استرجع الخلايا الملتصقة عن طريق شطف المكبس والمصفاة ب 1 مل من HBSS 2٪ FCS.
انقل الطحال المنفصل والسائل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
اغسل طبق بتري ب 5 مل من HBSS 2٪ FCS وانقل السائل إلى أنبوب 15 مل.
قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 × جم لمدة 7 دقائق عند 10 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية لتجنب الحبيبات.
أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من ماصة كلوريد الأمونيوم البوتاسيوم لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الحبيبات وتحلل كريات الدم الحمراء.
انتظر لمدة 2 دقيقة وأضف HBSS 2٪ FCS إلى الحبيبات المعلقة للحصول على حجم يصل إلى 14 مل.
قم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى عند 370 × جم لمدة 7 دقائق عند 10 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من HBSS 2٪ FCS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
عد الخلايا باستخدام مقايسة تلطيخ التريبان الأزرق واضبط التركيز النهائي للخلية على 10⁷ خلايا / مل باستخدام الحجم المناسب من HBSS 2٪ FCS.

4. نقل التبني

نقل 2 مل من تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في أنبوب تجميع سعة 5 مل.
قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 × جم لمدة 7 دقائق عند 10 درجات مئوية ثم تخلص من المادة الطافية.
أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من PBS وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 × جم لمدة 7 دقائق عند 10 درجات مئوية.
تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS.
باستخدام حقنة 0.5 مل بإبرة 29G ، قم بحقن 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في الفأر التجريبي عن طريق الوريد في الجيوب الأنفية الدموية المدارية الرجعية.
كعنصر تحكم ، قم بحقن فأر ثان في نفس الجيوب الأنفية الدموية ب 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات.

< ص الفئة = "jove_title" >5. حصاد الخلايا وتلطيخها

بعد أربعة أيام من نقل التبني ، قم بالقتل الرحيم للفئران وإزالة الطحال.
حصاد خلايا الطحال كما هو موضح في القسم 3.
نقل 100 ميكرولتر من معلقات الخلايا من كل فأرة إلى أنبوبين FACS ، يحملان اسم "التحكم" و "المنقول".
بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 × جم لمدة 7 دقائق عند 10 درجات مئوية ثم تخلص من المواد الطافية
قم بإعداد مزيج يحتوي على الأجسام المضادة الأربعة في التخفيفات المدرجة في الجدول 1.

الاجسام المضاده فلوروكروم التخفيف القرص المضغوط 45.1 بف711 1/200 CD45.2 APCCy7 1/400 CD4 BV786 1/1600 CD3 هب ف421 1/200 < p class = "jove_content" >الجدول 1: تكوين مزيج الأجسام المضادة. تحضير أربعة كوكتيلات للأجسام المضادة باستخدام مترافقات الأجسام المضادة الفلورية المركزة و HBSS.

أضف 100 ميكرولتر من المزيج إلى كل أنبوب ، ثم احتضنه لمدة 20 دقيقة على الثلج في الظلام.
أضف 1 مل من HBSS 2٪ FCS ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 370 × جم لمدة 3 دقائق عند 10 درجات مئوية.
تخلص من المواد الطافية وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من HBSS 2٪ FCS.
انقل الخلايا المعلقة إلى أنابيب FACS جديدة تحمل علامة عليها.
باستخدام قياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح في بروتوكول FACS ، قم بتقييم وجود الخلايا الليمفاوية الإيجابية CD45.2.

6. تحليل البيانات

افتح برنامج "FlowJo" واسحب الملفات الخاصة بكل أنبوب في نافذة "كل العينات".
انقر نقرا مزدوجا فوق الملف "المنقول" لعرض الخلايا المسجلة من تلك العينة على مخطط نقطي يعرض المبعثر الأمامي "SSC-A" على المحور Y والمبعثر الجانبي "FSC-A" على المحور X.
انقر فوق "مضلع" وقم بإنشاء استراتيجية بوابة لتحديد الخلايا الليمفاوية ، ثم تمييز الخلايا المانحة والمضيفة باستخدام علامات سطح الخلية (CD45.1 ، CD45.2) ، ثم توصيف خلايا CD45.2 ⁺ (CD3 ، CD4).
كرر خطوات التحليل باستخدام ملف "ماوس التحكم".
لتصور مجموعة الخلايا ، انقر فوق "محرر التخطيط".
اسحب مجموعة "الخلايا المنقولة" و "خلايا CD4 المنقولة" من ملفات "المنقولة" و "التحكم" إلى علامة التبويب "محرر التخطيط".
ستظهر مخططا نقطيا يمثل خلايا CD45.2⁺ والخلايا الليمفاوية CD4.
يجب أن تظهر الخلايا المنقولة CD45.2 فقط في مخطط نقطة "الماوس المنقول".

نقل الخلايا بالتبني هو طريقة لإدخال الخلايا ذات الأهمية في الكائن الحي. إنها تقنية قوية لدراسة الآليات البيولوجية المختلفة ، بما في ذلك عمل فئات معينة من الخلايا المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، يعد النقل بالتبني علاجا جديدا واعدا للعديد من الحالات ، مثل تلك التي تتطلب عمليات زرع نخاع العظم أو علاجات السرطان حيث يمكن استخراج الخلايا التائية الخاصة بالمريض ، وتغييرها للتعرف على الخلايا السرطانية وتدميرها ، ثم إعادتها إلى الجسم لمحاربة الأورام.

في المختبر ، غالبا ما تستخدم النماذج الحيوانية لدراسة النقل بالتبني. على سبيل المثال ، تفتقر الفئران CD45.1 Rag gamma-c بالضربة القاضية إلى المستقبلات الأساسية للعديد من السيتوكينات ، والتي تعتبر ضرورية للتمايز الطبيعي للخلايا الجذعية المكونة للدم إلى الخلايا الليمفاوية. نتيجة لذلك ، تعاني الفئران بالضربة القاضية من ضعف في نمو الخلايا الليمفاوية وليس لديها خلايا قاتلة طبيعية أو الخلايا التائية أو الخلايا البائية.

يمكن استخدام النقل بالتبني لإدخال الخلايا المناعية المفقودة في هذه الفئران المعرضة للخطر ، عن طريق حصاد أنسجة الفأر المتبرع بها أولا التي تحتوي على تركيزات عالية من الخلايا المناعية ، مثل الطحال. ثم يتم فصل الأنسجة وعزل مجموعة متنوعة من خلايا الطحال ، بما في ذلك الخلايا المناعية. بعد ذلك ، يمكن تحلل كريات الدم الحمراء غير المرغوب فيها ، أو خلايا الدم الحمراء ، عن طريق إضافة محلول تحلل البوتاسيوم لكلوريد الأمونيوم ، ثم يتم فصل خلايا الدم البيضاء المتبقية ، أو خلايا الطحال ، عن بقايا الخلية باستخدام الطرد المركزي.

أخيرا ، يتم حقن خلايا الطحال المنقاة في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، مما يسهل الدراسات التفصيلية لوظائف هذه الخلايا. بعد عدة أيام ، يمكن تأكيد نجاح نقل الخلايا المناعية بالتبني عن طريق عزل الخلايا الطحالية المضيفة وإعدادها بنفس طريقة الأنسجة المانحة. بعد ذلك ، يتم تلطيخ هذه الخلايا باستخدام أجسام مضادة مصنفة ضد علامات الخلايا المناعية للمتبرع بحيث يمكن التحقق منها وفرزها باستخدام FACS.

للبدء ، ارتد قفازات المختبر ومعدات الحماية المناسبة. بعد ذلك ، اغسل زوجا من الملقط ومقص تشريح أولا بمنظف ثم باستخدام 70٪ من الإيثانول ثم جففهما بمنشفة ورقية نظيفة. قم بإعداد 50 مل من محلول الملح المتوازن من هانك ، أو HBSS ، مع مصل عجل الجنين بنسبة 2٪ ، أو FCS ، عن طريق الجمع بين مليلتر واحد من FCS مع 49 مل من HBSS في أنبوب سعة 50 مل. امزج عن طريق سحب المحلول برفق لأعلى ولأسفل 10 مرات تقريبا.

قم بتشريح الفأر القتل رحيم وإزالة طحاله كما هو موضح في تقنية FACS لبروتوكول الفيديو JoVE لفصل الخلايا الليمفاوية البائية الطحالية. لعزل الخلايا المناعية ، ضع الطحال أولا على مصفاة خلية 40 ميكرومتر في طبق بتري. سحق الطحال بمكبس لفصله في الطبق. استعادة الخلايا الملتصقة عن طريق شطف المكبس والمصفاة ب 1 ملليلتر من HBSS 2٪ FCS. بعد ذلك ، قم بتقطيع الطحال والسائل المنفصل من طبق بتري إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. اغسل طبق بتري ب 5 مل من HBSS 2٪ FCS وانقل السائل إلى أنبوب 15 مل.

قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 10 درجات مئوية ثم استرجع الأنبوب بعناية حتى لا تزعج الحبيبات. الآن ، قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات وتخلص من السائل في حاوية نفايات مناسبة. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من محلول البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم إلى أنبوب الطرد المركزي والماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الحبيبات وتحلل كريات الدم الحمراء. انتظر لمدة دقيقتين ثم أضف HBSS 2٪ FCS إلى الحبيبات المعلقة للحصول على قيمة إجمالية قدرها 14 ملليلترا. كرر الطرد المركزي. استرجع الأنبوب بعناية وتخلص من المادة الطافية. ثم, أعد تعليق الحبيبات في 5 ملليلتر HBSS 2٪ FCS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، عد الخلايا المعلقة. أضف خمسة ميكرولترات من التريبان الأزرق إلى خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات. بعد ذلك ، قم بإيداع قطرة من خمسة ميكرولتر من تعليق الخلية المخفف برفق بين زجاج الغطاء وشريحة Malassez. مع ضبط المجهر على تكبير 40 ضعفا ، احسب عدد الخلايا. اضبط تركيز الخلية على 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر عن طريق إضافة الحجم المناسب ل HBSS 2٪ FCS.

لبدء النقل بالتبني ، انقل ملليلترين من تعليق الخلية إلى أنبوب تجميع سعة خمسة ملليلتر. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 10 درجات مئوية ثم تخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من محلول ملحي مخزن بالفوسفات وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 10 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية. ثم أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. باستخدام حقنة 0.5 ملليلتر بإبرة قياس 29 ، قم بحقن 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في الفأر التجريبي عن طريق الوريد في الجيوب الأنفية الدموية المدارية الرجعية.

بعد أربعة أيام من نقل التبني ، قتل الفئران وإزالة الطحال. ثم احصد الخلايا المناعية كما هو موضح في القسم الثالث. بعد ذلك ، قم بنقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية من كل فأر إلى أنبوبين من FACS يحملان اسم التحكم والنقل. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 10 درجات مئوية ثم تخلص من المواد الطافية. الآن ، قم بإعداد مزيج يحتوي على الأجسام المضادة الأربعة في التخفيف المدرج في الجدول الأول. أضف 100 ميكرولتر من المزيج إلى كل أنبوب ثم احتضنه لمدة 20 دقيقة على الثلج في الظلام. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من HBSS 2٪ FCS إلى كل أنبوب ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 370 مرة جم لمدة ثلاث دقائق عند 10 درجات مئوية. تخلص من المواد الطافية ثم أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من HBSS 2٪ FCS. انقل الخلايا المعلقة إلى أنابيب FACS جديدة تحمل علامة تجارية. الآن ، استخدم قياس التدفق الخلوي كما هو موضح في بروتوكول FACS لتقييم وجود CD45. 2 الخلايا الليمفاوية الإيجابية.

الآن ، سنحدد وجود الخلايا الليمفاوية CD45.2 التي تم عزلها من CD45. 1 الطحال المضيف. للبدء ، انقر نقرا مزدوجا فوق أيقونة FlowJo واسحب الملفات الخاصة بكل أنبوب في نافذة كل العينة. بعد ذلك، انقر نقرا مزدوجا فوق الملف المنقل لعرض الخلايا المسجلة من تلك العينة على مخطط نقطي يعرض FSCA المبعثر الأمامي على المحور x والمبعثر الجانبي SSCA على المحور y. انقر فوق المضلع لوضع دائرة حول مجموعات الخلايا الليمفاوية. تظهر نافذة جديدة لتعريف السكان الفرعيين. انقر فوق موافق. الآن ، اضبط المحور y على FSC-W والمحور x على FSC-A. حدد مجموعة الخلية المفردة باستخدام أداة المضلع كما هو موضح سابقا.

بعد ذلك ، انقر نقرا مزدوجا فوق السكان المحاطين بدائرة لإنشاء نافذة جديدة للخلايا المحددة. في النافذة الجديدة ، حدد CD45.2 على Y و CD45.1 على X. انقر فوق رمز T وقم بتخصيص المحور لتكبير المؤامرة. بعد ذلك ، انقر فوق المضلع لوضع دائرة حول الخلايا الإيجابية CD45.2. في نافذة تعريف السكان الفرعيين، قم بتسمية الخلايا المنقولة لمجموعة الخلايا وانقر فوق موافق. في نفس النافذة ، انقر فوق المستطيل لتحديد الخلايا السالبة CD45.2. في نافذة تعريف السكان الفرعيين، قم بتسمية الخلايا المضيفة لمحتوى الخلايا وانقر فوق موافق. بعد ذلك ، انقر نقرا مزدوجا فوق السكان المحطين بدائرة CD45.2 ، والسكان المنقولين ، لإنشاء نافذة جديدة للخلايا المحددة. في النافذة الجديدة ، حدد CD3 على Y و CD4 على X.

بعد ذلك ، انقر فوق المضلع لوضع دائرة حول الخلايا الإيجابية CD4 CD3. في نافذة تحديد السكان الفرعيين هذه، قم بتسمية خلايا CD4 المنقولة لمجموعة الخلايا الخاصة بك. ثم كرر خطوات التحليل السابقة باستخدام ملف ماوس التحكم. أخيرا ، لتصور مجموعات الخلايا الخاصة بك ، انقر فوق محرر التخطيط. اسحب الخلايا المنقولة ومجموعة خلايا CD4 المنقولة من الملفات المنقولة والتحكم إلى علامة التبويب محرر التخطيط. ستظهر مخططا نقطيا يمثل الخلايا الإيجابية CD45.2 والخلايا الليمفاوية CD4. CD45. يجب أن تظهر 2 خلية منقولة فقط في مخطط نقطة الماوس المنقولة.

المصدر: Meunier Sylvain^1,2,3, Perchet Thibaut^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
¹ وحدة تكون اللمفاوية ، قسم المناعة ، معهد باستور ، باريس ، فرن…