نقل الخلايا بالتبني: تقديم خلايا طحال الفئران المانحة إلى الفأر المضيف وتقييم النجاح عبر FACS

نقل الخلايا بالتبني هو طريقة لإدخال الخلايا ذات الأهمية في الكائن الحي. إنها تقنية قوية لدراسة الآليات البيولوجية المختلفة ، بما في ذلك عمل فئات معينة من الخلايا المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، يعد النقل بالتبني علاجا جديدا واعدا للعديد من الحالات ، مثل تلك التي تتطلب عمليات زرع نخاع العظم أو علاجات السرطان حيث يمكن استخراج الخلايا التائية الخاصة بالمريض ، وتغييرها للتعرف على الخلايا السرطانية وتدميرها ، ثم إعادتها إلى الجسم لمحاربة الأورام.

في المختبر ، غالبا ما تستخدم النماذج الحيوانية لدراسة النقل بالتبني. على سبيل المثال ، تفتقر الفئران CD45.1 Rag gamma-c بالضربة القاضية إلى المستقبلات الأساسية للعديد من السيتوكينات ، والتي تعتبر ضرورية للتمايز الطبيعي للخلايا الجذعية المكونة للدم إلى الخلايا الليمفاوية. نتيجة لذلك ، تعاني الفئران بالضربة القاضية من ضعف في نمو الخلايا الليمفاوية وليس لديها خلايا قاتلة طبيعية أو الخلايا التائية أو الخلايا البائية.

يمكن استخدام النقل بالتبني لإدخال الخلايا المناعية المفقودة في هذه الفئران المعرضة للخطر ، عن طريق حصاد أنسجة الفأر المتبرع بها أولا التي تحتوي على تركيزات عالية من الخلايا المناعية ، مثل الطحال. ثم يتم فصل الأنسجة وعزل مجموعة متنوعة من خلايا الطحال ، بما في ذلك الخلايا المناعية. بعد ذلك ، يمكن تحلل كريات الدم الحمراء غير المرغوب فيها ، أو خلايا الدم الحمراء ، عن طريق إضافة محلول تحلل البوتاسيوم لكلوريد الأمونيوم ، ثم يتم فصل خلايا الدم البيضاء المتبقية ، أو خلايا الطحال ، عن بقايا الخلية باستخدام الطرد المركزي.

أخيرا ، يتم حقن خلايا الطحال المنقاة في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، مما يسهل الدراسات التفصيلية لوظائف هذه الخلايا. بعد عدة أيام ، يمكن تأكيد نجاح نقل الخلايا المناعية بالتبني عن طريق عزل الخلايا الطحالية المضيفة وإعدادها بنفس طريقة الأنسجة المانحة. بعد ذلك ، يتم تلطيخ هذه الخلايا باستخدام أجسام مضادة مصنفة ضد علامات الخلايا المناعية للمتبرع بحيث يمكن التحقق منها وفرزها باستخدام FACS.

للبدء ، ارتد قفازات المختبر ومعدات الحماية المناسبة. بعد ذلك ، اغسل زوجا من الملقط ومقص تشريح أولا بمنظف ثم باستخدام 70٪ من الإيثانول ثم جففهما بمنشفة ورقية نظيفة. قم بإعداد 50 مل من محلول الملح المتوازن من هانك ، أو HBSS ، مع مصل عجل الجنين بنسبة 2٪ ، أو FCS ، عن طريق الجمع بين مليلتر واحد من FCS مع 49 مل من HBSS في أنبوب سعة 50 مل. امزج عن طريق سحب المحلول برفق لأعلى ولأسفل 10 مرات تقريبا.

قم بتشريح الفأر القتل رحيم وإزالة طحاله كما هو موضح في تقنية FACS لبروتوكول الفيديو JoVE لفصل الخلايا الليمفاوية البائية الطحالية. لعزل الخلايا المناعية ، ضع الطحال أولا على مصفاة خلية 40 ميكرومتر في طبق بتري. سحق الطحال بمكبس لفصله في الطبق. استعادة الخلايا الملتصقة عن طريق شطف المكبس والمصفاة ب 1 ملليلتر من HBSS 2٪ FCS. بعد ذلك ، قم بتقطيع الطحال والسائل المنفصل من طبق بتري إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. اغسل طبق بتري ب 5 مل من HBSS 2٪ FCS وانقل السائل إلى أنبوب 15 مل.

قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 10 درجات مئوية ثم استرجع الأنبوب بعناية حتى لا تزعج الحبيبات. الآن ، قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات وتخلص من السائل في حاوية نفايات مناسبة. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من محلول البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم إلى أنبوب الطرد المركزي والماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الحبيبات وتحلل كريات الدم الحمراء. انتظر لمدة دقيقتين ثم أضف HBSS 2٪ FCS إلى الحبيبات المعلقة للحصول على قيمة إجمالية قدرها 14 ملليلترا. كرر الطرد المركزي. استرجع الأنبوب بعناية وتخلص من المادة الطافية. ثم, أعد تعليق الحبيبات في 5 ملليلتر HBSS 2٪ FCS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، عد الخلايا المعلقة. أضف خمسة ميكرولترات من التريبان الأزرق إلى خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات. بعد ذلك ، قم بإيداع قطرة من خمسة ميكرولتر من تعليق الخلية المخفف برفق بين زجاج الغطاء وشريحة Malassez. مع ضبط المجهر على تكبير 40 ضعفا ، احسب عدد الخلايا. اضبط تركيز الخلية على 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر عن طريق إضافة الحجم المناسب ل HBSS 2٪ FCS.

لبدء النقل بالتبني ، انقل ملليلترين من تعليق الخلية إلى أنبوب تجميع سعة خمسة ملليلتر. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 10 درجات مئوية ثم تخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من محلول ملحي مخزن بالفوسفات وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 10 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية. ثم أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. باستخدام حقنة 0.5 ملليلتر بإبرة قياس 29 ، قم بحقن 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في الفأر التجريبي عن طريق الوريد في الجيوب الأنفية الدموية المدارية الرجعية.

بعد أربعة أيام من نقل التبني ، قتل الفئران وإزالة الطحال. ثم احصد الخلايا المناعية كما هو موضح في القسم الثالث. بعد ذلك ، قم بنقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية من كل فأر إلى أنبوبين من FACS يحملان اسم التحكم والنقل. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 370 مرة جم لمدة سبع دقائق عند 10 درجات مئوية ثم تخلص من المواد الطافية. الآن ، قم بإعداد مزيج يحتوي على الأجسام المضادة الأربعة في التخفيف المدرج في الجدول الأول. أضف 100 ميكرولتر من المزيج إلى كل أنبوب ثم احتضنه لمدة 20 دقيقة على الثلج في الظلام. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من HBSS 2٪ FCS إلى كل أنبوب ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 370 مرة جم لمدة ثلاث دقائق عند 10 درجات مئوية. تخلص من المواد الطافية ثم أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من HBSS 2٪ FCS. انقل الخلايا المعلقة إلى أنابيب FACS جديدة تحمل علامة تجارية. الآن ، استخدم قياس التدفق الخلوي كما هو موضح في بروتوكول FACS لتقييم وجود CD45. 2 الخلايا الليمفاوية الإيجابية.

الآن ، سنحدد وجود الخلايا الليمفاوية CD45.2 التي تم عزلها من CD45. 1 الطحال المضيف. للبدء ، انقر نقرا مزدوجا فوق أيقونة FlowJo واسحب الملفات الخاصة بكل أنبوب في نافذة كل العينة. بعد ذلك، انقر نقرا مزدوجا فوق الملف المنقل لعرض الخلايا المسجلة من تلك العينة على مخطط نقطي يعرض FSCA المبعثر الأمامي على المحور x والمبعثر الجانبي SSCA على المحور y. انقر فوق المضلع لوضع دائرة حول مجموعات الخلايا الليمفاوية. تظهر نافذة جديدة لتعريف السكان الفرعيين. انقر فوق موافق. الآن ، اضبط المحور y على FSC-W والمحور x على FSC-A. حدد مجموعة الخلية المفردة باستخدام أداة المضلع كما هو موضح سابقا.

بعد ذلك ، انقر نقرا مزدوجا فوق السكان المحاطين بدائرة لإنشاء نافذة جديدة للخلايا المحددة. في النافذة الجديدة ، حدد CD45.2 على Y و CD45.1 على X. انقر فوق رمز T وقم بتخصيص المحور لتكبير المؤامرة. بعد ذلك ، انقر فوق المضلع لوضع دائرة حول الخلايا الإيجابية CD45.2. في نافذة تعريف السكان الفرعيين، قم بتسمية الخلايا المنقولة لمجموعة الخلايا وانقر فوق موافق. في نفس النافذة ، انقر فوق المستطيل لتحديد الخلايا السالبة CD45.2. في نافذة تعريف السكان الفرعيين، قم بتسمية الخلايا المضيفة لمحتوى الخلايا وانقر فوق موافق. بعد ذلك ، انقر نقرا مزدوجا فوق السكان المحطين بدائرة CD45.2 ، والسكان المنقولين ، لإنشاء نافذة جديدة للخلايا المحددة. في النافذة الجديدة ، حدد CD3 على Y و CD4 على X.

بعد ذلك ، انقر فوق المضلع لوضع دائرة حول الخلايا الإيجابية CD4 CD3. في نافذة تحديد السكان الفرعيين هذه، قم بتسمية خلايا CD4 المنقولة لمجموعة الخلايا الخاصة بك. ثم كرر خطوات التحليل السابقة باستخدام ملف ماوس التحكم. أخيرا ، لتصور مجموعات الخلايا الخاصة بك ، انقر فوق محرر التخطيط. اسحب الخلايا المنقولة ومجموعة خلايا CD4 المنقولة من الملفات المنقولة والتحكم إلى علامة التبويب محرر التخطيط. ستظهر مخططا نقطيا يمثل الخلايا الإيجابية CD45.2 والخلايا الليمفاوية CD4. CD45. يجب أن تظهر 2 خلية منقولة فقط في مخطط نقطة الماوس المنقولة.