فحص موت الخلايا: فحص إطلاق الكروم للقدرة السامة للخلايا

في هذا الفيديو ، ستلاحظ كيفية إجراء فحص إطلاق الكروم وتحديد الإمكانات السامة للخلايا للخلايا المستجيبة.

الخلايا المناعية مسؤولة عن تحديد وإزالة الخلايا التي يحتمل أن تكون ضارة ، مثل الخلايا السرطانية أو المصابة بالفيروسات ، من الجسم ، والتي تعد جزءا لا يتجزأ من الاستجابة المناعية. تمتلك العديد من الخلايا المناعية ، مثل الخلايا التائية والخلايا الطبيعية ، خاصية تعرف باسم الإمكانات السامة للخلايا ، وهي القدرة على تحديد الخلايا المستهدفة وإفراز البروتينات التي تحفز تدهور البروتين وتحللها وموت تلك الخلايا المستهدفة. يعد تحديد إمكانات السامة للخلايا أمرا بالغ الأهمية لقياس تنشيط الخلايا المناعية وفعاليتها ، ويستخدم اختبار إطلاق الكروم بشكل شائع لهذا الغرض.

تمكن هذه الطريقة المستخدمين من مقارنة السمية الناجمة عن أنواع معينة من الخلايا المناعية في ظل ظروف مختلفة ، وهو أمر ذو قيمة لدراسة العلاج المناعي للسرطان والأمراض المرتبطة بالمناعة. للبدء ، يتم تحضين الخلايا المستهدفة ، مثل الخلايا السرطانية ، بنظير مشع ، الكروم 51 ، الذي تمتصه الخلايا. بعد ذلك ، يتم زراعة هذه الخلايا ذات العلامات الراديوية بشكل مشترك مع الخلايا المناعية المعزولة ذات الأهمية ، والتي تسمى أيضا الخلايا المستجيبة ، في قاع دائري ، 96- صفيحة بئر لتسهيل التفاعل بين نوعي الخلايا.

يتضمن الإعداد العام للاختبار احتضان عدد محدد من الخلايا المستهدفة بتركيزات مختلفة من الخلايا المناعية ، جنبا إلى جنب مع الضوابط المناسبة. تسمح الزراعة المشتركة للخلايا المستجيبة بالحث على موت الخلايا المبرمج والتحلل في الخلايا المستهدفة ، مما يؤدي إلى إطلاق الكروم داخل الخلايا 51 في المادة الطافية. بعد ذلك ، في نقطة زمنية محسنة مسبقا ، يتم حصاد المادة الطافية التي تحتوي على الكروم المنبعث من جميع الآبار. الكروم 51 ، كونه مشعا ، يخضع تلقائيا للاضمحلال الإشعاعي لإصدار إشعاع جاما. تمثل مستويات إشعاع جاما في المواد الطافية من جميع الآبار الموجودة في لوحة الفحص ناتجا قابلا للقياس الكمي لتحلل الخلايا المستهدفة. يتم قياس ذلك باستخدام عداد جاما ، والذي يستخدم بعد ذلك لتحديد الإمكانات السامة للخلايا للخلايا المناعية.

للبدء ، يتم تحضير الخلايا المستهدفة ، خط خلية الورم الميلانيني البشري WM793 في هذا المثال ، في معلق خلية واحدة. للقيام بذلك ، قم أولا بإزالة الوسائط من قارورة زراعة الأنسجة وغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من 1X PBS. صب PBS ثم أضف ملليلتر واحد من التربسين إلى الطبق لمدة دقيقتين تقريبا. اضغط برفق على القارورة لفك الخلايا من سطح القارورة ثم أضف خمسة ملليلتر من وسائط RPMI إلى القارورة. قم بضرب الوسائط لأعلى ولأسفل لجمع الخلايا وإضافة هذا التعليق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

ضع الأنبوب في جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسائط من الأنبوب مع التأكد من عدم تعطيل حبيبات الخلية. قم بنفض الغبار برفق في الجزء السفلي من الأنبوب لتعطيل حبيبات الخلية وإضافة 10 مل من الوسائط إلى الأنبوب. بعد ذلك، قم بسحب الوسائط برفق لأعلى ولأسفل لتعليق الخلايا. بعد ذلك ، حدد تركيز الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم وانقل ملليلترين من تعليق الخلية الأصلي إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي وحبيبات الخلايا بسرعة 12 مائة دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، اسكب الوسائط الزائدة من الأنبوب في حاوية النفايات. قم بدوامة الأنبوب لفترة وجيزة لإعادة تعليق حبيبات الخلية في الحجم الصغير للوسط المتبقي وراءه.

بعد ذلك ، استعد لاستخدام Chromium 51 عن طريق الانتقال إلى مساحة مختبر مخصصة لهذا النشاط الإشعاعي المعين. يجب أن يكون هناك درع وافر من الرصاص للتخزين الآمن واستخدام Chromium 51 أثناء جميع الخطوات ، بالإضافة إلى لافتات مناسبة للإشارة إلى مكان الاحتفاظ بالعينات التي تحتوي على Chromium 51. من الضروري أيضا استخدام عداد جيجر المجهز بمسبار فطيرة للعمل في الفضاء للتلوث المحتمل.

بمجرد إعداده للاستخدام السليم للنشاط الإشعاعي ، أضف 100 ميكروكوري من الكروم 51 مباشرة إلى تعليق الخلية المستهدفة. بعد ذلك ، أضف قطعة صغيرة من الشريط المشع إلى الأنبوب للإشارة إلى أن العينة والأنبوب مشعا الآن. ضع الأنبوب في حاضنة 37 درجة مئوية مع درع من الرصاص واحتضنه لمدة ساعة ، مع تحريك الأنبوب كل 15 إلى 20 دقيقة.

أثناء وضع العلامات على الخلايا المستهدفة ، قم بإعداد معلق خلية واحدة من الخلايا المستجيبة. في هذا المثال ، تم عزل الخلايا النووية الأحادية للدم المحيطي البشري ، أو PDMCs ، من الدم الكامل عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة القياسية إلى تركيز 5 في 10 إلى 6. انقل تعليق الخلية المستجيب هذا إلى خزان كاشف يمكن التخلص منه ثم أضف 200 ميكرولتر من هذا التعليق في كل بئر من الصف B في صفيحة دائرية القاع سعة 96 بئرا. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من RPMI إلى كل بئر في الصف C إلى G من اللوحة.

الآن ، ابدأ في إجراء التخفيفات التسلسلية ل PBMCs للحصول على مجموعة من أرقام الخلايا المستجيبة عن طريق إزالة 100 ميكرولتر من الخلايا في الآبار في الصف B وإضافتها إلى الصف C. بعد ذلك ، قم بتخفيف الخلايا المستجيبة عن طريق نقل 100 ميكرولتر من الخلايا من الصف C إلى الصف D. استمر في التخفيف التسلسلي. بمجرد الوصول إلى الصف G ، انقل 100 ميكرولتر من الآبار لترك حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر في كل بئر في هذا الصف. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الأنسجة إلى الآبار الموجودة في الصف A لتكون بمثابة عنصر تحكم في الإطلاق التلقائي للكروم 51 من الخلايا المستهدفة ، حيث لا ينبغي إضافة خلايا مستجيبة إلى هذا الصف. بعد ذلك ، ضع صفيحة في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تصبح الخلايا المستهدفة جاهزة للإضافة.

بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة الخلايا المستهدفة من الحاضنة واغسلها ب 5 مل من FBS لإزالة أي فائض من الكروم 51. بعد ذلك ، ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي مخصص وقم بالدوران بسرعة 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. قم بإزالة غسل FBS المشع في حاوية نفايات مناسبة وكرر خطوة الغسيل عن طريق تعليق الحبيبات في 5 مل من FBS الطازجة. ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي مخصص وقم بتدوير الخلايا مرة أخرى عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. قم بإزالة الغسيل الثاني وتحقق من الحبيبات بحثا عن النشاط الإشعاعي المدمج باستخدام عداد جيجر. أخيرا ، قم بتعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من الوسط الكامل واسكب تعليق الخلية المستهدفة بالكروم 51 في خزان كاشف يمكن التخلص منه. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من هذه الخلايا المستهدفة المصنفة إلى كل بئر من لوحة الخلية المستجيب المكونة من 96 بئر. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من 1٪ NP-40 في الماء إلى الآبار الموجودة في الصف H لتحلل جميع الخلايا المستهدفة في كل صف. سيتم استخدام هذه الآبار كعنصر تحكم لتحديد إجمالي الأعداد في الدقيقة ، أو التكلفة لكل ألف ظهور.

الآن بعد أن تم تحضير اللوحة ، قم بتأمين الغطاء عن طريق إضافة قطعة صغيرة من الشريط اللاصق إلى كل جانب من جوانب اللوحة وضع قطعة من الشريط المشع على الغطاء للإشارة إلى احتوائه على الكروم 51. بعد ذلك ، ضع اللوحة في جهاز طرد مركزي محدد للتعامل مع العينات المشعة. إذا تم استخدام لوحة تجريبية واحدة فقط ، فأضف لوحة توازن إلى جهاز الطرد المركزي. اضبط جهاز الطرد المركزي على 1200 دورة في الدقيقة ، وارفع اللوحة إلى السرعة. بمجرد الوصول إلى السرعة ، أوقف الجهاز. قم بإزالة اللوحة من جهاز الطرد المركزي. بعد ذلك ، ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية مع قطعة صغيرة من درع الرصاص فوق اللوحة لمزيد من الأمان. احتضان لمدة 16 ساعة للسماح للخلايا المستهدفة بالتحلل.

في نهاية فترة الحضانة ، قم بإزالة الشريط بعناية حول حافة اللوحة ، وقم بإزالة الغطاء. بعد ذلك ، ضع إطار الحصاد على اللوحة مع التأكد من وجود أقراص المرشح الصغيرة في مكانها لكل سدادة من المقابس القطنية. الآن ، اضغط ببطء وبلطف على سدادات القطن في الآبار. بعد حوالي عشر ثوان ، حرر الضغط على سدادات القطن ، ثم انقل المقابس القطنية إلى شرائط الأنبوب. ضع كل من هذه الأنابيب في أنبوب FACS ثانوي. أخيرا ، قم بتحميل أنابيب FACS على عداد جاما وقم بتشغيل العينات لتقدير كمية الكروم 51 المنبعثة في كل حالة. سجل بعناية الترتيب الذي تم به تحميل الأنابيب في العداد.

هنا ، تمت إضافة PBMCs غير المحفزة إلى أول 3 ممرات وأضيفت PMBCs المحفزة CPG إلى الممرات من 4 إلى 6. في هذا المثال ، تم إدخال الأعداد في الدقيقة في خلايا جدول البيانات بنفس الطريقة التي تم بها وضع العينات في اللوحة الأصلية وتم حساب متوسطات النسخ الثلاثية. على سبيل المثال ، بالنسبة للحالة الأولى ، تم حساب متوسط الخلايا A1 و A2 و A3 في الخلية I3. بمجرد تحديد المتوسطات ، يمكن حساب النسبة المئوية للتحلل المحدد لكل حالة باستخدام هذه الصيغة. على سبيل المثال ، لحساب النسبة المئوية للتحلل المحدد للخلايا غير المحفزة التي كانت نسبة 50 إلى 1 من الخلايا المستجيبة لاستهداف الخلايا ، تم طرح CPM التلقائي ، والذي في هذا المثال ، 1164.67 ، من CPM التجريبي ، 1129. 67. يمكن بعد ذلك قسمة هذا الرقم على الفرق بين الحد الأقصى للتكلفة لكل ألف ظهور والتكلفة لكل ألف ظهور تلقائي ، ثم ضربه في 100 لإعطاء النسبة المئوية للتحلل المحدد. ثم يتم حساب هذا لكل شرط. يمكن بعد ذلك رسم هذه البيانات بيانيا لإظهار مقارنة نسبة E إلى T مع النسبة المئوية للتحلل المحدد لكل من PBMCs غير المحفزة ، و PBMCs المحفزة CPG. في هذا المثال ، قتلت الخلايا المستجيبة المحفزة باستخدام CPG الخلايا المستهدفة بشكل أكثر فعالية مع زيادة نسبة الخلايا المستجيبة إلى الخلايا المستهدفة. لم تلاحظ هذه الزيادة في PBMCs غير المحفزة ، مما يشير إلى أن تحفيز CPG ضروري للزيادة الملحوظة في تحلل الخلايا المستهدفة.