What is the chromium release assay and why is it used to measure immune cell function?

The chromium release assay quantifies the cytotoxic potential of immune cells like T cells and NK cells by measuring their ability to kill target cells. Target cells are labeled with radioactive chromium-51, co-cultured with effector cells, and cell lysis releases the chromium into the supernatant. A gamma counter measures the radioactivity, providing a quantifiable output of target cell death that reflects immune cell activation and potency.

How does chromium-51 labeling enable detection of target cell death?

Chromium-51 is a radioactive isotope that is rapidly taken up by target cells and nonspecifically labels cellular proteins. When effector cells induce lysis and loss of membrane integrity in target cells, the labeled chromium is released into the culture supernatant. The radioactive chromium spontaneously undergoes gamma radiation decay, which is detected and quantified using a gamma counter to determine the extent of cell death.

What is the role of serial dilutions in the chromium release assay protocol?

Serial dilutions create a range of effector cell concentrations in the assay plate, allowing researchers to establish the relationship between effector cell number and target cell killing. By progressively diluting effector cells across plate rows, the assay generates multiple data points showing how cytotoxic activity varies with different effector-to-target cell ratios, enabling comparison of immune cell potency under different conditions.

Why are control wells essential in the chromium release assay?

Control wells serve critical functions: row A contains target cells alone to measure spontaneous chromium release without effector cells, and row H contains 1% NP-40 detergent to lyse all target cells and determine total counts per minute. These controls establish baseline and maximum chromium release values, enabling calculation of percent specific lysis by accounting for background radioactivity and normalizing experimental results.

How is percent specific lysis calculated from chromium release assay data?

Percent specific lysis is calculated using the formula: (experimental CPM minus spontaneous CPM) divided by (maximum CPM minus spontaneous CPM), then multiplied by 100. Counts per minute from triplicate wells are averaged, and spontaneous release from control wells is subtracted from experimental values. This calculation normalizes results and allows direct comparison of cytotoxic activity between different effector cell populations or treatment conditions.

What safety precautions are necessary when working with chromium-51?

Chromium-51 requires dedicated laboratory space with ample lead shielding for safe storage and handling during all steps. A Geiger counter with a pancake probe must be available to survey for contamination. Proper signage indicates where radioactive samples are kept, and all radioactive materials must be labeled with radioactive tape. Appropriate personal protective equipment, including lab coat and gloves, is essential when handling chromium-51.

How does CpG stimulation affect the cytotoxic capacity of peripheral blood mononuclear cells?

CpG-stimulated peripheral blood mononuclear cells demonstrate significantly enhanced killing of target cells compared to unstimulated cells, particularly as the effector-to-target cell ratio increases. In the assay example, CpG stimulation was necessary for observed increases in target cell lysis, indicating that immune cell activation through CpG stimulation is required to achieve robust cytotoxic responses against melanoma cells.

فحص موت الخلايا: فحص إطلاق الكروم للقدرة السامة للخلايا

0 مشاهدة11:48 دقيقة

نظرة عامة على الإجراءات

تتضمن الاختبار النموذجي لقياس موت الخلايا الخطوات التالية:

أولا ، يتم تصنيف الخلايا المستهدفة ب Na₂ [⁵¹Cr] O₄. هذا يميزها عن الخلايا المستجيبة في الفحص.
أثناء وضع العلامات على الخلايا المستهدفة ، يتم جمع الخلايا المستجيبة ، وباستخدام تقنية التخفيف التسلسلي ، يتم إنشاء معايرة متناقصة للخلايا المستجيبة في لوحة فحص مستديرة القاع 96 بئر.
في نهاية وضع العلامات على الخلايا المستهدفة ، يتم غسل الخلايا أولا ثم يضاف عدد ثابت من الخلايا إلى لوحة الفحص التي تحتوي بالفعل على سلسلة من تخفيفات الخلايا المستجيبة.
بعد ذلك ، يتم احتضان مزيج الخلايا المستهدفة المستجيبة لفترة زمنية محددة للسماح بتفاعل خلوي كاف مع الخلايا المستهدفة ، للتوسط في تحلل الخلية.
أخيرا ، يتم حصاد المواد الطافية المزروعة وجمعها في أنابيب. يتم تحديد كمية ⁵¹Cr باستخدام عداد جاما.
في النهاية ، يتم جمع البيانات واستخدامها لحساب "النسبة المئوية لتحلل الخلية المحددة" للخلايا المستهدفة.

1. تصنيف الخلايا المستهدفة ب ⁵¹كرور

للبدء ، قم بإعداد الخلايا المستهدفة ، (هنا - خط خلية الورم الميلانيني البشري WM793) ، في معلق خلية واحدة.
للقيام بذلك ، قم أولا بإزالة الوسائط من قارورة زراعة الأنسجة.
ثم اغسل الخلايا ب 5 مل من 1X PBS.
قم بتربسين الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من التربسين إلى الطبق لمدة ~ 2 دقيقة.
اضغط برفق على القارورة لفك الخلايا من سطح القارورة.
أضف 5 مل من وسائط RPMI إلى القارورة وقم بسحب الوسائط لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا.
اجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 5 دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة. صب المادة الطاففة.
أضف 10 مل من الوسائط إلى الحبيبات وقم بسحب الوسائط برفق لأعلى ولأسفل لتعليق الخلايا.
حدد تركيز الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم.
انقل 1 × 10⁶ خلايا إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.
قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 5 دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة وصب المادة الطافية.
بدوامة الأنبوب لفترة وجيزة لإعادة تعليق حبيبات الخلية في الحجم الصغير للوسط المتبقي وراءه.
أضف 100 ميكروCi من ⁵¹كرور مباشرة إلى تعليق الخلية المستهدفة WM793.
ملاحظة: يجب أن يكون هناك مساحة مختبر مخصصة للنشاط الإشعاعي المعين. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون هناك درع وافر من الرصاص للتخزين الآمن واستخدام ⁵¹Cr خلال جميع الخطوات بالإضافة إلى اللافتات المناسبة للإشارة إلى مكان الاحتفاظ بالعينات التي تحتوي على ⁵¹Cr. من الضروري أيضا استخدام عداد جيجر المجهز بمسبار فطيرة لمسح المساحة بحثا عن التلوث المحتمل.
أضف قطعة صغيرة من الشريط المشع إلى الأنبوب للإشارة إلى أن الأنبوب مشع الآن.
ضع الأنبوب في حاضنة 37 درجة مئوية مع درع رصاص واحتضانه لمدة 1 ساعة.
بعد فترة الحضانة ، اغسل الخلايا المستهدفة ب 5 مل من FBS لإزالة أي ⁵¹كرور زائد.
قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
أعد تعليق الحبيبات واغسلها مرة ثانية باستخدام FBS. تحقق من الحبيبات بحثا عن النشاط الإشعاعي المدمج باستخدام عداد جيجر.
أعد تعليق الحبيبات في وسط كامل سعة 10 مل ، وتحقيق تركيز خلية يبلغ 10⁵ خلية / مل ملاحظة: تم حذف خطوة عد الخلايا بعد وضع العلامات ⁵¹كرور هنا إلى حد كبير لأسباب تتعلق بالسلامة. يمكن افتراض أن تركيز خلية WM793 هو نفسه كما كان قبل وضع العلامات ^{على 51}كرور.

2. تحضير الخلايا المستجيب

يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الخلايا المستجيبة ، مثل الخلايا التائية البشرية أو الفأرية والخلايا القاتلة الطبيعية. في هذا المثال ، تم استخدام PBMCs ، المعزولة من الدم الكامل بواسطة الطرد المركزي المتدرج القياسي الكثافة (بتركيز 5 × 10⁶).
للبدء ، أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الأنسجة إلى كل بئر من أحد الصفوف (هنا الصف أ ، انظر الجدول 1) من صفيحة مستديرة القاع ذات 96 بئر. هنا ، لا تتم إضافة أي خلايا مستجيب ، وستكون بمثابة "فارغة" لتحديد "الحد الأدنى / التلقائي من ^{إطلاق 51}Cr" من الخلايا المستهدفة.

الشكل 1

الجدول 1: تخطيط فحص إصدار ⁵¹Cr: الصف أ- الخلايا المستهدفة (10⁴ خلايا / 100 ميكرولتر) محتضنة بالوسائط فقط (يولد" فارغة "لتحديد "الحد الأدنى / التلقائي من ⁵¹كرور "). الصفوف B إلى C- الآبار التي تحتوي على مستجيب مختلف: نسب الخلية المستهدفة (E: T) ، تتراوح من 50: 1 إلى 1.5: 1. الصف H- الخلايا المستهدفة (10⁴ خلايا / 100 ميكرولتر) محتضنة بنسبة 1٪ NP-40 (NP-40 يحلل الخلايا المستهدفة ، مما يولد "الحد الأقصى أو الإجمالي لإطلاق ⁵¹Cr"). يتم اختبار كل نسبة E: T في ثلاث نسخ لكل حالة تجريبية. العمود 1-3- PBMCs غير المحفزة والعمود 4-6- PBMCs المحفزة CpG.

بعد ذلك ، قم بإنشاء تخفيف خلية تسلسلية 2X ل PBMCs (بثلاث نسخ لكل حالة تجريبية) ، للحصول على تركيز خلية مستجيب يتراوح من 5x10⁵ إلى 15,625 خلية / 100 ميكرولتر من الوسائط (هنا الصفوف B إلى G).
ملاحظة: في هذا المثال، تكون نسبة المستجيب الأولي: الخلية المستهدفة (E: T) 50:1. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذه النسبة اعتمادا على التفاصيل التجريبية.
اترك الصف الأخير فارغا (هنا الصف H) عن طريق عدم إضافة أي خلايا مستجيب إلى هذه الآبار. (سيتم استخدام هذا الصف لإنشاء "إجمالي الأعداد / الدقيقة ، أو (c. p. m)" أو "الحد الأقصى ⁵¹Cr release").
ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تصبح الخلايا المستهدفة جاهزة للإضافة.

3. إضافة ⁵¹Cr من الخلايا المستهدفة WM793 المسماة إلى الفحص

بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة الخلايا المستهدفة من الحاضنة واغسلها ب 5 مل من FBS لإزالة أي فائض ^{من 51}كرور.
قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ، باستخدام جهاز طرد مركزي مخصص.
قم بإزالة غسل FBS (المادة الطافية المشعة) في حاوية نفايات مناسبة.
كرر خطوة الغسيل عن طريق تعليق الحبيبات في 5 مل من FBS.
الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
أخيرا, أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من الوسط الكامل.
صب معلق الخلية WM793 الذي يحمل ^{علامة 51}Cr (10⁵ خلايا / مل) في خزان كاشف يمكن التخلص منه.
بعد ذلك، أضف 100 ميكرولتر من هذه الخلايا المستهدفة المصنفة، إلى كل بئر من لوحة الخلية المستجيب المكونة من 96 بئرا، باستخدام ماصة متعددة القنوات.
بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من 1٪ NP-40 (في الماء) إلى صف الآبار الخالية من أي خلايا مستجيبة (هنا الصف H). 1٪ NP-40 سوف يحلل الخلايا المستهدفة ، وبالتالي ستعمل هذه الآبار كعناصر تحكم لتحديد "إجمالي العدد / الدقيقة ، أو (c. p. m)" أو الحد الأقصى لإطلاق ⁵¹Cr.
قم بتأمين الغطاء على اللوحة عن طريق إضافة قطعة صغيرة من الشريط اللاصق المنفذ للغاز على كل جانب من جوانب اللوحة وضع قطعة من الشريط المشع على الغطاء للإشارة إلى احتوائه ^{على 51}كرور.
باختصار ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 1200 دورة في الدقيقة. إذا تم استخدام لوحة تجريبية واحدة فقط ، فأضف لوحة توازن إلى جهاز الطرد المركزي.
ملاحظة: من المهم استخدام جهاز طرد مركزي مميز للتعامل مع العينات المشعة.
قم بإزالة اللوحة من جهاز الطرد المركزي.
ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية مع قطعة صغيرة من درع الرصاص فوق اللوحة لمزيد من الأمان. احتضان لمدة 16 ساعة للسماح بتحلل الخلية المستهدفة.
ملاحظة: يمكن أن تختلف فترة الحضانة من 4 إلى 18 ساعة اعتمادا على الخلايا المستجيبة المستخدمة وآلية القتل المحتملة المستخدمة.

4. حصاد المواد الطفية

في نهاية فترة الحضانة ، قم بإزالة الشريط اللاصق بعناية حول حافة اللوحة وإزالة الغطاء.
بعد ذلك ، ضع إطار الحصاد على اللوحة ، وتأكد من التأكد من وجود أقراص المرشح الصغيرة في مكانها لكل سدادة قطنية. سيضمن ذلك جمع مادة طافية خالية من الخلايا.
الآن ، اضغط ببطء وبلطف على سدادات القطن في الآبار.
بعد حوالي 10 ثوان ، حرر الضغط على سدادات القطن ثم انقل المقابس القطنية إلى شرائط الأنبوب.
ضع كل من هذه الأنابيب في أنبوب FACS ثانوي.
أخيرا ، قم بتحميل أنابيب FACS على عداد جاما وقم بتشغيل العينات لتقدير كمية ⁵¹Cr التي تم إطلاقها في كل حالة. يتم قياس العينات عادة لمدة دقيقة واحدة ، مما يسمح بتحديد "العدد / الدقيقة" بسهولة.
بعناية ، سجل الترتيب الذي تم به تحميل الأنابيب في العداد.

5. تحليل البيانات

هنا ، تمت إضافة PBMCs غير المحفزة إلى الأعمدة الثلاثة الأولى ، وأضيفت PBMCs المحفزة CpG (CpG ODN ، (1 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة) إلى الأعمدة 4-6. انظر الجدول 2.

1 2 3 4 5 6 7 8 أ 1251 1157 [1157] [م] 1086 917 1118 1140 ب 1832 1986 1971 7629 ريال 7913 8180 ج 1677 1739 1428 5454 ريال 5055 5268 د 1638 1552 1734 4239 3582 3786 ه 1658 1580 1339 2818 2623 2750 ويف 1579 1472 1483 2028 1779 1769 ز 1326 1325 1184 1801 1654 1565 ح 9220 9367 8067 8774 9647 8236 ريال أنا متوسط A1 ، A2 ، A3 -> 1164.67 c.p.m التلقائي 1058.33 دولار ي متوسط B1 ، B2 ، B3 -> 1929.67 9.91٪ 7907.33 87.50٪ 50:1 ك متوسط C1 ، C2 ، C3 -> 1614.67 دولار 5.83٪ 5259 م 53.67٪ 25: 1 ل متوسط D1 ، D2 ، D3 -> 1641.33 دولار 6.17٪ 3869 35.91٪ 12.5:1 م متوسط E1 ، E2 ، E3 -> 1525.67 دولار 4.68٪ 2730.33 21.36٪ 6.25:1 ن متوسط F1 ، F2 ، F3 -> 1511.33 دولار 4.49٪ 1858.67 [ا] 10.22٪ 3.12:1 O متوسط G1 ، G2 ، G3 -> 1278.33 دولار 1.47٪ 1673.33 [إ] 7.86٪ 1.56:1 ص متوسط H1 ، H2 ، H3 -> 8884.67 الحد الأقصى للحساب في الدقيقة 8885.67 Unstim PBMC CpG-stim PBMC نسبة E: T

الجدول 2: ⁵¹بيانات فحص إصدار Cr: قيم بيانات "العدد في الدقيقة" / "c. p. m" ، ومتوسط قيم c. p. m ، وقيم التحلل المحددة المحسوبة.

تم إدخال البيانات التي تم جمعها (التعداد في الدقيقة ، أي c.p.m) في خلايا جدول البيانات بنفس الطريقة التي تم بها وضع العينات في اللوحة الأصلية.
أولا ، تم حساب متوسطات النسخ الثلاثية. الجدول 2 - الخلايا I3 إلى P3 ، للخلايا PBMCs غير المحفزة والخلايا I6 إلى P6 ، ل PBMCs المحفزة ب CpG.
بمجرد تحديد المتوسطات ، تم حساب النسبة المئوية للتحمس النوعي لكل حالة باستخدام الصيغة التالية-
< / >
تم حساب النسبة المئوية للتحلل المحدد لكل حالة (الجدول 2 - الخلايا J4 إلى O4 ، ل PBMCs غير المحفزة و J7 إلى O7 ، ل PBMCs غير المحفزة).

المصدر: فرانسيس ف. سجاستاد^1،2 ، ويتني سوانسون^2،3 ، وتوماس س. جريفيث^1،2،3،4
¹ برنامج الدراسات العليا في علم الأحياء الدقيقة والمناعة وبيولوجيا السرطان…