التخفيفات التسلسلية والطلاء: التعداد الميكروبي
1. الإعداد
- يجب كتابة مخطط انسيابي يسرد جميع المواد والبروتوكول التجريبي التدريجي وطريقة التخلص من الإمدادات في دفتر مختبر والاحتفاظ به بالقرب من مساحة العمل التجريبية.
- يجب تعقيم مساحات العمل بمطهر مناسب (70٪ إيثانول) ويجب على المجرب التخفيف من مخاطر التلوث من خلال ارتداء ملابس مختبرية نظيفة تحميها أيضا من حالات التعرض الشاذة. تشمل الملابس المناسبة على سبيل المثال لا الحصر معطف المختبر ، وقفازات اللاتكس أو النتريل ، وأجهزة الغوغل ، وأجهزة التنفس ، والأحذية المغلقة. من الأهمية بمكان الحفاظ على تقنية المعقمة في جميع الأوقات.
- تحضير 90 مل من محلول ملحي 0.45٪. باستخدام أسطوانة نظيفة متدرجة ، قم بقياس 90 مل من الماء المعقم ونقله إلى قارورة إرلينماير نظيفة تحمل علامة 0.45٪ ملحية . تزن .405 جم من كلوريد الصوديوم (Sigma-Aldrich NaCl S9888) وأضفها إلى القارورة المسمى 0.45٪ محلول ملحي. قم بالتدوير بشكل متكرر حتى لا يبقى أي مذاب مرئيا.
- عند الانتهاء ، يجب على المجرب إعادة تعقيم جميع الأسطح والتخلص من أي كائنات غير مرغوب فيها أو مخزونات مخففة أو أطباق بتري أو حلقات تلقيح يمكن التخلص منها وفقا لإرشادات OSHA. يمكن إزالة ملابس المختبر قبل غسل اليدين.
2. إعداد الوسائط
- حدد الوسائط المناسبة لزراعة الكائن الحي المطلوب. في معظم السيناريوهات ، يمكن المرق من نمو بكتيريا كافية. نظرا لأن الكائنات الحية من بروتوكول فينوغرادسكي مرغوبة هنا ، فقد تم تجميع عمود يتكون من كربونات الكالسيوم والكبريت والسليلوز والطين وتركه دون إزعاج لمدة 7 أيام. يتم فصل العمود المذكور أعلاه إلى أقسام هوائية ودقيقة ولاهوائية.
- اختر وسيطا مناسبا لطلاء الكائن الحي محل الاهتمام. عادة ما يتم استخدام مكملات الوسائط السائلة مع أجار درجة علم الأحياء الدقيقة كعامل تصلب. LB متوسط / أجار كاف عند حصاد عينات من المناطق الهوائية والهوائية الدقيقة واللاهوائية من العمود المذكور أعلاه. ملاحظة: لم يتم حصاد عينات من المنطقة المحبة للميكرو لهذا الإجراء. ومع ذلك ، يجب زراعة هذه الكائنات الحية في برطمانات الشموع. يؤدي إدخال شمعة إلى غرفة الزراعة هذه قبل الختم إلى خلق بيئة منخفضة الأكسجين مناسبة لتكاثر الهوية الدقيقة.
- نظرا لأننا نرغب في تحضير 250 مل ، استخدم 500 مل (أو أكبر) قوارير Erlenmeyer لمنع الغليان عند التعقيم. قم بتسمية أحدهما "مرق" والآخر "أجار".
- حدد مقدار الوسائط المطلوبة لإنشاء كل حل باتباع توصيات تركيز الشركة المصنعة. يتم تحضير LB Agar ، المستخدم هنا ، عن طريق الجمع بين 25 جم / لتر والماء عالي النقاء. يتطلب حجمنا البالغ 250 مل محلولا من 6.25 رطل أجار / 250 مل من الماء. وبالمثل ، يتم تحضير مرق LB من خلال الجمع بين نفس نسبة مرق LB والماء. نظرا لأنه لا يتم استكماله بعامل تصلب ، فلن يتصلب عند تبريده.
- قم بوزن الوسائط واخلطها بالماء بنسب تتوافق مع توصيات الشركة المصنعة. أضف 6.25 جرام من LB Agar إلى قارورة تحمل علامة "أجار" ، و 6.25 جرام من مرق LB إلى قارورة تحمل علامة "مرق". أضف 250 مل من الماء فائق النقاء إلى كل قارورة.
- لف ورق الألمنيوم فوق كل قارورة واستخدم الأوتوكلاف لتعقيم الوسائط لمدة لا تقل عن 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة.
- باستخدام قفاز أو وسادة مقاومة للحرارة ، قم بإزالة القوارير من الأوتوكلاف عند اكتمال الدورة وضعها في حمام مائي 40-50 درجة مئوية.
- بمجرد الوصول إلى درجة الحرارة المناسبة ، اسكب محتويات القارورة المسماة "مرق" في 250 مل Erlenmeyer ، أو قارورة مستديرة القاع. قم بتسمية قارورة 250 مل "solution0".
- احصل على أطباق بتري معقمة مقاس 10 ، 100 مم × 15 مم وقم بتسميتها بالتاريخ والاسم ونوع الوسائط المستخدمة ومنطقة عمود فينوغرادسكي التي سيتم حصاد الكائنات الحية منها.
- قم بإزالة القارورة التي تحمل علامة "أجار" من الحمام المائي وابدأ في سكبها في كل من أطباق بتري ال 10. يجب عدم إضافة أكثر من 15 مل لكل طبق. يمكن إجراء ذلك أيضا باستخدام ماصة وماصة مصلية سعة 25 مل لتحسين الدقة. استخدم طرف ماصة معقم لإزالة أي فقاعات موجودة، ثم قم بتغطيتها بأغطية اللوحة واتركها لتتجلب طوال الليل.
3. تحضير مخفف
- قم بإعداد عشرة أنابيب اختبار قادرة على تخزين 20 مل أو أكثر في رف وقم بتسميتها T1-T10. يتوافق كل رقم أنبوب مع عامل التخفيف الذي يتوافق معه (على سبيل المثال ، T4 = 1x10 -4 أو 0.0001 أو 1 / 10,000 من تركيز المخزون).
- Pipet 9 مل من محلول ملحي 0.45٪ في كل من أنابيب الاختبار ال 10.
- الفراغات المالحة جاهزة الآن للتعقيم بواسطة الأوتوكلاف. استخدم رقائق الألومنيوم لتغطية كل من أنابيب الاختبار ال 10 ثم انقلها إلى رف أنبوب اختبار متوافق مع الأوتوكلاف. تعقيم لمدة لا تقل عن 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة.
- قم بإزالة الفراغات باستخدام قفازات مقاومة للحرارة واتركها لتبرد. قم بتغطيته وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة عندما تصل الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة ، أو عندما تبرد عند لمسها.
4. زراعة الكائن الحي المستهدف
- تلقيح "الحل0" بمستعمرة واحدة من صفيحة مخططة مسبقا أو 50 ميكرولتر من مخزون مجمد. اسمح للكائن الحي المستهدف بوقت التكاثر عن طريق وضع "الحل 0 " الملقح في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل مع الاهتزاز (إذا لزم الأمر). (ملاحظة: يجب تغطية القارورة لمنع التلوث. إذا كان الكائن الحي المستهدف هوائي ، فاستخدم شاشا معقما وسدادات قطنية لمنع التلوث. في حالة تقييم مناطق عمود فينوغرادسكي ، ما عليك سوى إزالة 1 جرام من كل منطقة مرغوبة (الهوائية واللاهوائية لأغراض هذه الدراسة) وإعادة التعليق في T1 قبل المتابعة إلى الخطوة 5.3.
5. التخفيف التسلسلي
- احصل على القارورة التي تحمل علامة "مرق المغذيات" من الحاضنة ورجها بقوة.
- Pipet 1 مل من "solution0" في أنبوب الاختبار المسمى T1. دوامة T1. في حالة تقييم مستخلصات Winogradsky ، قم بوزن 1 جرام من المنطقة المرغوبة وأضفها إلى T1 قبل الدوامة. (ملاحظة: يتم استخدام 1 مل هنا من أجل البساطة - يمكن أيضا استخدام كميات أصغر أو أكبر من المخفف).
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T1 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T2. دوامة T2.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T2 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T3. دوامة T3.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T3 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T4. دوامة T4.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T4 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T5. دوامة T5.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T5 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T6. دوامة T6.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T6 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T7. دوامة T7.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T7 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T8. دوامة T8.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T8 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T9. دوامة T9.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T9 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T10.
6. انتشار الطلاء
- Pipet 100 ميكرولتر من عينة مخففة من T1 مباشرة على طبق بتري. يمكن تكرار هذه الخطوة ، ولكن لا يلزم أن تتكرر لكل أنبوب.
- احصل على قضيب نشر معقم يمكن التخلص منه أو تعقيم قضيب نشر الزجاج باللهب. في حركة في اتجاه عقارب الساعة / عكس اتجاه عقارب الساعة ، حرك الجزء الأفقي من قضيب الانتشار لتوزيع العينة بالتساوي داخل طبق بتري.
- كرر ذلك لكل منطقة من عمود فينوغرادسكي المراد تقييمها.
- احتضان الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بالنسبة للكائنات اللاهوائية ، استخدم غرفة لاهوائية.
7. Streaking
- حدد التخفيف المناسب للكائن الحي المستهدف. على سبيل المثال ، سينتج عن الحل4 تخفيف 1/10,000 من تركيزك الأولي. عادة ما يتم تقييم تخفيفات 1/1,000th (T3/Solution) و 1/1,000,000th (T6/Solution6) و 1/1,000,000,000th (T9/Solution} ) لتعداد الميكروبات.
- باستخدام حلقة تلقيح بلاستيكية معقمة يمكن التخلص منها أو حلقة تلقيح معدنية قابلة لإعادة الاستخدام تعرضت للنيران لمدة لا تقل عن 10 ثوان ، انغمس في المحلول المطلوب من الخطوة 5. يجب أن تنقل حلقات التلقيح المعايرة 0.01 مل. (تحذير: لا تسمح للحلقة الملتهبة بملامسة البكتيريا فور إزالتها من الحرارة)
- ارفع غطاء طبق بتري قليلا على جانب واحد حتى تتمكن حلقة التلقيح فقط من الوصول إلى الأجار. حرك حلقة التلقيح عبر الجزء العلوي من الوسائط بطريقة متعرجة مع الحرص على عدم المساس بالأجار. اخفض غطاء طبق بتري.
- استخدم حلقة تلقيح جديدة يمكن التخلص منها أو أعد تعقيم الحلقة القابلة لإعادة الاستخدام.
- قم بتدوير اللوحة بمقدار 1/3 تقريبا rd (~ 118 درجة) وقلل من تكرار الحركة المتعرجة.
- مرة أخرى ، استخدم حلقة جديدة يمكن التخلص منها أو أعد تعقيم حلقة معدنية قبل الدوران النهائي وقلل من التردد المتعرج مرة أخرى. اخفض غطاء طبق بتري.
- كرر الخطوات 7.2 - 7.6 حتى يتم ربط ثلاثة أطباق بتري على الأقل لثلاثة تخفيفات مختلفة ، باستخدام حلقة جديدة يمكن التخلص منها أو عن طريق إعادة إشعال حلقة قابلة لإعادة الاستخدام ( الشكل 2 ).
- ضع أطباق بتري مخططة في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل. بالنسبة للكائنات اللاهوائية ، استخدم غرفة لاسروبية.
8. تحليل البيانات والنتائج
- تم حصاد الثقافات من مناطق الأكسجين ونقص الأكسجين في عمود فينوغرادسكي لمدة 7 أيام. هذه المناطق مناسبة للكائنات اللاهوائية غير المتجانسة وأكسدة الحديد ، على التوالي.
- تم تخفيف النماذج المستخرجة للأعمدة بشكل متسلسل قبل الخطوط أو الانتشار على ألواح LB Agar.
- كشفت الخطوط عن مجموعة سكانية مختلطة من كل منطقة من مناطق فينوغرادسكي التي تم تقييمها. أسفرت لوحات الانتشار عن نتائج مماثلة.
- لحساب CFU / مل أو CFU / g ، متوسط عدد المستعمرات المحسوبة من ثلاث لوحات. اضرب متوسط عدد المستعمرات في عامل التخفيف واقسمه على الكمية المقتبسى. على سبيل المثال ، إذا تم حساب ما معدله 65 مستعمرة على أطباق تم تلقيحها ب 0.1 مل من المحلول 6 (T6) ، فإن الصيغة الموضحة سابقا ستساوي 650،000،000 CFU / mL.
- يمكن الآن اختيار مستعمرات معزولة من كل لوحة لاستخدامها في فحوصات التخصيب لتحديد هوية الأنواع.
المصدر: جوناثان ف. بليز 1 ، إليزابيث سوتر 1 ، وكريستوفر ب. كوربو 1
1 قسم العلوم البيولوجية ، كلية فاغنر ، 1 طريق الحرم الجامعي ، جزيرة ستاتن نيويورك ،…
1. الإعداد
- يجب كتابة مخطط انسيابي يسرد جميع المواد والبروتوكول التجريبي التدريجي وطريقة التخلص من الإمدادات في دفتر مختبر والاحتفاظ به بالقرب من مساحة العمل التجريبية.
- يجب تعقيم مساحات العمل بمطهر مناسب (70٪ إيثانول) ويجب على المجرب التخفيف من مخاطر التلوث من خلال ارتداء ملابس مختبرية نظيفة تحميها أيضا من حالات التعرض الشاذة. تشمل الملابس المناسبة على سبيل المثال لا الحصر معطف المختبر ، وقفازات اللاتكس أو النتريل ، وأجهزة الغوغل ، وأجهزة التنفس ، والأحذية المغلقة. من الأهمية بمكان الحفاظ على تقنية المعقمة في جميع الأوقات.
- تحضير 90 مل من محلول ملحي 0.45٪. باستخدام أسطوانة نظيفة متدرجة ، قم بقياس 90 مل من الماء المعقم ونقله إلى قارورة إرلينماير نظيفة تحمل علامة 0.45٪ ملحية . تزن .405 جم من كلوريد الصوديوم (Sigma-Aldrich NaCl S9888) وأضفها إلى القارورة المسمى 0.45٪ محلول ملحي. قم بالتدوير بشكل متكرر حتى لا يبقى أي مذاب مرئيا.
- عند الانتهاء ، يجب على المجرب إعادة تعقيم جميع الأسطح والتخلص من أي كائنات غير مرغوب فيها أو مخزونات مخففة أو أطباق بتري أو حلقات تلقيح يمكن التخلص منها وفقا لإرشادات OSHA. يمكن إزالة ملابس المختبر قبل غسل اليدين.
2. إعداد الوسائط
- حدد الوسائط المناسبة لزراعة الكائن الحي المطلوب. في معظم السيناريوهات ، يمكن المرق من نمو بكتيريا كافية. نظرا لأن الكائنات الحية من بروتوكول فينوغرادسكي مرغوبة هنا ، فقد تم تجميع عمود يتكون من كربونات الكالسيوم والكبريت والسليلوز والطين وتركه دون إزعاج لمدة 7 أيام. يتم فصل العمود المذكور أعلاه إلى أقسام هوائية ودقيقة ولاهوائية.
- اختر وسيطا مناسبا لطلاء الكائن الحي محل الاهتمام. عادة ما يتم استخدام مكملات الوسائط السائلة مع أجار درجة علم الأحياء الدقيقة كعامل تصلب. LB متوسط / أجار كاف عند حصاد عينات من المناطق الهوائية والهوائية الدقيقة واللاهوائية من العمود المذكور أعلاه. ملاحظة: لم يتم حصاد عينات من المنطقة المحبة للميكرو لهذا الإجراء. ومع ذلك ، يجب زراعة هذه الكائنات الحية في برطمانات الشموع. يؤدي إدخال شمعة إلى غرفة الزراعة هذه قبل الختم إلى خلق بيئة منخفضة الأكسجين مناسبة لتكاثر الهوية الدقيقة.
- نظرا لأننا نرغب في تحضير 250 مل ، استخدم 500 مل (أو أكبر) قوارير Erlenmeyer لمنع الغليان عند التعقيم. قم بتسمية أحدهما "مرق" والآخر "أجار".
- حدد مقدار الوسائط المطلوبة لإنشاء كل حل باتباع توصيات تركيز الشركة المصنعة. يتم تحضير LB Agar ، المستخدم هنا ، عن طريق الجمع بين 25 جم / لتر والماء عالي النقاء. يتطلب حجمنا البالغ 250 مل محلولا من 6.25 رطل أجار / 250 مل من الماء. وبالمثل ، يتم تحضير مرق LB من خلال الجمع بين نفس نسبة مرق LB والماء. نظرا لأنه لا يتم استكماله بعامل تصلب ، فلن يتصلب عند تبريده.
- قم بوزن الوسائط واخلطها بالماء بنسب تتوافق مع توصيات الشركة المصنعة. أضف 6.25 جرام من LB Agar إلى قارورة تحمل علامة "أجار" ، و 6.25 جرام من مرق LB إلى قارورة تحمل علامة "مرق". أضف 250 مل من الماء فائق النقاء إلى كل قارورة.
- لف ورق الألمنيوم فوق كل قارورة واستخدم الأوتوكلاف لتعقيم الوسائط لمدة لا تقل عن 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة.
- باستخدام قفاز أو وسادة مقاومة للحرارة ، قم بإزالة القوارير من الأوتوكلاف عند اكتمال الدورة وضعها في حمام مائي 40-50 درجة مئوية.
- بمجرد الوصول إلى درجة الحرارة المناسبة ، اسكب محتويات القارورة المسماة "مرق" في 250 مل Erlenmeyer ، أو قارورة مستديرة القاع. قم بتسمية قارورة 250 مل "solution0".
- احصل على أطباق بتري معقمة مقاس 10 ، 100 مم × 15 مم وقم بتسميتها بالتاريخ والاسم ونوع الوسائط المستخدمة ومنطقة عمود فينوغرادسكي التي سيتم حصاد الكائنات الحية منها.
- قم بإزالة القارورة التي تحمل علامة "أجار" من الحمام المائي وابدأ في سكبها في كل من أطباق بتري ال 10. يجب عدم إضافة أكثر من 15 مل لكل طبق. يمكن إجراء ذلك أيضا باستخدام ماصة وماصة مصلية سعة 25 مل لتحسين الدقة. استخدم طرف ماصة معقم لإزالة أي فقاعات موجودة، ثم قم بتغطيتها بأغطية اللوحة واتركها لتتجلب طوال الليل.
3. تحضير مخفف
- قم بإعداد عشرة أنابيب اختبار قادرة على تخزين 20 مل أو أكثر في رف وقم بتسميتها T1-T10. يتوافق كل رقم أنبوب مع عامل التخفيف الذي يتوافق معه (على سبيل المثال ، T4 = 1x10 -4 أو 0.0001 أو 1 / 10,000 من تركيز المخزون).
- Pipet 9 مل من محلول ملحي 0.45٪ في كل من أنابيب الاختبار ال 10.
- الفراغات المالحة جاهزة الآن للتعقيم بواسطة الأوتوكلاف. استخدم رقائق الألومنيوم لتغطية كل من أنابيب الاختبار ال 10 ثم انقلها إلى رف أنبوب اختبار متوافق مع الأوتوكلاف. تعقيم لمدة لا تقل عن 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة.
- قم بإزالة الفراغات باستخدام قفازات مقاومة للحرارة واتركها لتبرد. قم بتغطيته وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة عندما تصل الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة ، أو عندما تبرد عند لمسها.
4. زراعة الكائن الحي المستهدف
- تلقيح "الحل0" بمستعمرة واحدة من صفيحة مخططة مسبقا أو 50 ميكرولتر من مخزون مجمد. اسمح للكائن الحي المستهدف بوقت التكاثر عن طريق وضع "الحل 0 " الملقح في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل مع الاهتزاز (إذا لزم الأمر). (ملاحظة: يجب تغطية القارورة لمنع التلوث. إذا كان الكائن الحي المستهدف هوائي ، فاستخدم شاشا معقما وسدادات قطنية لمنع التلوث. في حالة تقييم مناطق عمود فينوغرادسكي ، ما عليك سوى إزالة 1 جرام من كل منطقة مرغوبة (الهوائية واللاهوائية لأغراض هذه الدراسة) وإعادة التعليق في T1 قبل المتابعة إلى الخطوة 5.3.
5. التخفيف التسلسلي
- احصل على القارورة التي تحمل علامة "مرق المغذيات" من الحاضنة ورجها بقوة.
- Pipet 1 مل من "solution0" في أنبوب الاختبار المسمى T1. دوامة T1. في حالة تقييم مستخلصات Winogradsky ، قم بوزن 1 جرام من المنطقة المرغوبة وأضفها إلى T1 قبل الدوامة. (ملاحظة: يتم استخدام 1 مل هنا من أجل البساطة - يمكن أيضا استخدام كميات أصغر أو أكبر من المخفف).
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T1 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T2. دوامة T2.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T2 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T3. دوامة T3.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T3 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T4. دوامة T4.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T4 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T5. دوامة T5.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T5 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T6. دوامة T6.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T6 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T7. دوامة T7.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T7 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T8. دوامة T8.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T8 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T9. دوامة T9.
- قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T9 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T10.
6. انتشار الطلاء
- Pipet 100 ميكرولتر من عينة مخففة من T1 مباشرة على طبق بتري. يمكن تكرار هذه الخطوة ، ولكن لا يلزم أن تتكرر لكل أنبوب.
- احصل على قضيب نشر معقم يمكن التخلص منه أو تعقيم قضيب نشر الزجاج باللهب. في حركة في اتجاه عقارب الساعة / عكس اتجاه عقارب الساعة ، حرك الجزء الأفقي من قضيب الانتشار لتوزيع العينة بالتساوي داخل طبق بتري.
- كرر ذلك لكل منطقة من عمود فينوغرادسكي المراد تقييمها.
- احتضان الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بالنسبة للكائنات اللاهوائية ، استخدم غرفة لاهوائية.
7. Streaking
- حدد التخفيف المناسب للكائن الحي المستهدف. على سبيل المثال ، سينتج عن الحل4 تخفيف 1/10,000 من تركيزك الأولي. عادة ما يتم تقييم تخفيفات 1/1,000th (T3/Solution) و 1/1,000,000th (T6/Solution6) و 1/1,000,000,000th (T9/Solution} ) لتعداد الميكروبات.
- باستخدام حلقة تلقيح بلاستيكية معقمة يمكن التخلص منها أو حلقة تلقيح معدنية قابلة لإعادة الاستخدام تعرضت للنيران لمدة لا تقل عن 10 ثوان ، انغمس في المحلول المطلوب من الخطوة 5. يجب أن تنقل حلقات التلقيح المعايرة 0.01 مل. (تحذير: لا تسمح للحلقة الملتهبة بملامسة البكتيريا فور إزالتها من الحرارة)
- ارفع غطاء طبق بتري قليلا على جانب واحد حتى تتمكن حلقة التلقيح فقط من الوصول إلى الأجار. حرك حلقة التلقيح عبر الجزء العلوي من الوسائط بطريقة متعرجة مع الحرص على عدم المساس بالأجار. اخفض غطاء طبق بتري.
- استخدم حلقة تلقيح جديدة يمكن التخلص منها أو أعد تعقيم الحلقة القابلة لإعادة الاستخدام.
- قم بتدوير اللوحة بمقدار 1/3 تقريبا rd (~ 118 درجة) وقلل من تكرار الحركة المتعرجة.
- مرة أخرى ، استخدم حلقة جديدة يمكن التخلص منها أو أعد تعقيم حلقة معدنية قبل الدوران النهائي وقلل من التردد المتعرج مرة أخرى. اخفض غطاء طبق بتري.
- كرر الخطوات 7.2 - 7.6 حتى يتم ربط ثلاثة أطباق بتري على الأقل لثلاثة تخفيفات مختلفة ، باستخدام حلقة جديدة يمكن التخلص منها أو عن طريق إعادة إشعال حلقة قابلة لإعادة الاستخدام ( الشكل 2 ).
- ضع أطباق بتري مخططة في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل. بالنسبة للكائنات اللاهوائية ، استخدم غرفة لاسروبية.
8. تحليل البيانات والنتائج
- تم حصاد الثقافات من مناطق الأكسجين ونقص الأكسجين في عمود فينوغرادسكي لمدة 7 أيام. هذه المناطق مناسبة للكائنات اللاهوائية غير المتجانسة وأكسدة الحديد ، على التوالي.
- تم تخفيف النماذج المستخرجة للأعمدة بشكل متسلسل قبل الخطوط أو الانتشار على ألواح LB Agar.
- كشفت الخطوط عن مجموعة سكانية مختلطة من كل منطقة من مناطق فينوغرادسكي التي تم تقييمها. أسفرت لوحات الانتشار عن نتائج مماثلة.
- لحساب CFU / مل أو CFU / g ، متوسط عدد المستعمرات المحسوبة من ثلاث لوحات. اضرب متوسط عدد المستعمرات في عامل التخفيف واقسمه على الكمية المقتبسى. على سبيل المثال ، إذا تم حساب ما معدله 65 مستعمرة على أطباق تم تلقيحها ب 0.1 مل من المحلول 6 (T6) ، فإن الصيغة الموضحة سابقا ستساوي 650،000،000 CFU / mL.
- يمكن الآن اختيار مستعمرات معزولة من كل لوحة لاستخدامها في فحوصات التخصيب لتحديد هوية الأنواع.
في بعض الأحيان ، من أجل تحديد البكتيريا ودراستها ، نحتاج أولا إلى عزلها وإثرائها من العينة. على سبيل المثال ، يتم خلط العينات التي تم الحصول عليها من عمود فينوغرادسكي ، مما يعني أنها تحتوي على أنواع أو سلالات متعددة من البكتيريا ، لذا فإن دراسة بكتيريا فردية أو تعداد الأنواع المختلفة الموجودة قد يكون أمرا صعبا. تحقيقا لهذه الغاية ، عادة ما يتم استخدام تقنيات التخفيف والطلاء التسلسلي لتحديد الحمل البكتيري بشكل موثوق وعزل المستعمرات الفردية.
التخفيف التسلسلي هو عملية يتم من خلالها تقليل تركيز الكائن الحي ، البكتيريا في هذا المثال ، بشكل منهجي من خلال إعادة التعليق المتتالية في كميات ثابتة من المخفف السائل. عادة ما يكون حجم المخفف من مضاعفات 10 لتسهيل الاختزال اللوغاريتمي للكائن الحي العينة. على سبيل المثال ، تتم إزالة جرام واحد من الرواسب أولا من منطقة فينوغرادسكي ذات الأهمية وإضافتها إلى 10 ملليلتر من وسط سائل مناسب. بعد ذلك ، يضاف مليلتر واحد من هذا التخفيف الأول إلى أنبوب آخر يحتوي على تسعة ملليلتر من المتوسط. يمكن تكرار العملية حتى يتم تحضير عدة تركيزات مختلفة من البكتيريا. التخفيف التسلسلي هو مفتاح تعداد البكتيريا في هذا المثال ، نظرا لأن العينات المختلطة من عمود فينوغرادسكي تحتوي على عدد غير معروف ، وغالبا ما يكون كبيرا ، من البكتيريا.
بعد ذلك ، يتيح الطلاء المخطط والطلاء المنتشر عزل البكتيريا وتعداد البكتيريا داخل العينة ، على التوالي. يتم تحقيق الخطوط عن طريق إدخال عينة مخففة إلى قسم واحد من الوسط الصلب المكمل بالمغذيات ، والتي تنقسم إلى أثلاث. ثم ينتشر هذا اللقاح على كل ثلث من اللوحة بنمط متعرج. نظرا لأن أقسام مختلفة من اللوحة مخططة ، تعبر من العينة السابقة مرة واحدة فقط ، تنتشر العينة بشكل أكثر رقة. هذا يعني أنك قد تحتاج فقط إلى الابتعاد عن تخفيف واحد لتحقيق مستعمرات فردية في الأقسام اللاحقة. بعد الحضانة ، تسمح الصفائح المخططة بملاحظات مورفولوجيا المستعمرة ، وهي معلومات يمكن أن تساعد في التمييز بين الأنواع البكتيرية المختلفة.
بدلا من ذلك ، إذا كان الهدف الرئيسي هو تعداد البكتيريا في العينة ، فيمكن استخدام الطلاء المنتشر في الطلاء المنتشر ، يتم توزيع حصة من عينة واحدة بالتساوي على كامل سطح الوسط الصلب. عادة ، نظرا لأننا لا نعرف الأعداد البكتيرية في العينة المختلطة ، يتم عمل لوحة انتشار لكل من التخفيفات أو عينة تمثيلية منها. بعد الحضانة ، يمكن إجراء التعداد باستخدام لوحات الانتشار هذه. يجب التخلص من أي لوحات يقل عدد المستعمرات فيها عن 30 ، لأن الأعداد الصغيرة عرضة لخطأ أكبر. وبالمثل ، يجب التخلص من أي عدد يزيد عن 300 لأن ازدحام المستعمرات وتداخلها يمكن أن يؤدي إلى التقليل من عدد المستعمرات. إذا تم تسجيل عدد المستعمرات لكل من هذه الأطباق المتبقية وضربها في عامل التخفيف ، ثم قسمها على الحجم المطلي ، فإن هذا ينتج عن وحدات تشكيل المستعمرة ، أو CFUs ، لكل مليلتر من التعليق. في هذا الفيديو ، سوف تتعلم كيفية التقييم النوعي والكمي لعينة تحتوي على بكتيريا معروفة ، والمجتمعات الميكروبية الموجودة في مناطق مختلفة من عمود فينوغرادسكي عن طريق التخفيف التسلسلي ، والطلاء المنتشر ، والطلاء الخطي.
أولا ، ارتد أي معدات حماية شخصية مناسبة بما في ذلك معطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية. بعد ذلك ، قم بتعقيم مساحة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسح السطح. بعد ذلك ، اجمع قارورتين من Erlenmeyer سعة 500 مل وقم بتسمية مرق واحد والآخر أجار. لتحضير محلول أجار LB ، اخلطي ما يقرب من 6.25 جرام من أجار LB ، وثلاثة جرامات من الأجار التقني ، و 250 مل من الماء المقطر في القارورة المسمى أجار.
ثم قم بإعداد مرق LB عن طريق الجمع بين 2. 5 غرامات من وسائط LB و 100 مل من الماء المقطر في القارورة التي تحمل علامة المرق. بعد تعقيم القوارير ، استخدم قفازا مقاوما للحرارة لإزالة القوارير من الأوتوكلاف ووضعها في حمام مائي من 40 إلى 50 درجة مئوية. بمجرد أن تصل درجة حرارة القوارير إلى 50 درجة مئوية ، قم بإعداد ثلاث حصص سعة 100 مل من محلول المرق بعناية وقم بتسمية كل محلول من محلول المخزون صفر. بعد ذلك ، اجمع 10 أطباق بتري معقمة وقم بتسميتها بالتاريخ والاسم ونوع الوسائط المستخدمة ومنطقة عمود فينوغرادسكي التي سيتم حصاد الكائنات الحية منها. ماصة 15 مل من أجار من قارورة أجار في كل طبق بتري. بعد ذلك، استخدم طرف الماصة لإزالة أي فقاعات، واستبدال أغطية اللوحة، والسماح لها بالتصلب على الجزء العلوي من المقعد طوال الليل.
في اليوم التالي ، امسح سطح المقعد بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، قم بتسمية 10 أنابيب اختبار سعة 20 مليلتر من T1 إلى T10 وضعها في رف. ماصة تسعة ملليلتر من محلول ملحي 45٪ في كل أنبوب. الآن ، قم بتغطية كل من أنابيب الاختبار ال 10 بشكل غير محكم بأغطيتها ونقلها إلى رف أنبوب اختبار متوافق مع الأوتوكلاف. بعد اكتمال الدورة ، قم بإزالة الفراغات المالحة باستخدام قفازات مقاومة للحرارة واتركها لتبرد. قم بتخزين الأنابيب في درجة حرارة الغرفة حتى تصل إلى حوالي 22 درجة مئوية.
لزراعة كائن حي مستهدف معروف ، الإشريكية القولونية في هذا المثال ، قم بتلقيح 100 مل من المحلول صفر بمستعمرة واحدة من صفيحة مخططة سابقا. ثم قم بتغطية الأنبوب واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية. لتقييم مناطق عمود فينوغرادسكي ، أضف ما يقرب من جرام واحد من المواد من المنطقة الهوائية إلى T1 وأعد تعليقها عن طريق الدوامة. ثم كرر هذه العملية بجرام واحد من المواد من المنطقة اللاهوائية.
قم بإزالة الأنبوب الذي يحتوي على محلول صفر ملقح بالإشريكية القولونية من الحاضنة ورجها. بعد ذلك ، قم بإدخال ملية واحدة من المحلول في أنبوب اختبار T1 ودوامة للخلط. قم بإزالة مليلتر واحد من المحلول من T1 وانقله إلى T2 ، مع الدوامة للخلط. كرر هذه العملية من خلال أنبوب T10. لتقييم المناطق الهوائية واللاهوائية لعمود فينوجرادسكي ، قم بإزالة مليلتر واحد من المحلول من كل أنبوب من أنابيب T1 المعدة مسبقا ونقله إلى أنابيب T2 المناسبة. بعد ذلك ، استمر في التخفيفات التسلسلية من خلال أنابيب T10 كما هو موضح سابقا.
لنشر اللوحة ، قم بتقطيع 100 ميكرولتر من العينة المخففة من كل أنبوب T3 إلى طبق بتري المقابل. بعد ذلك ، استخدم قضيب نشر معقم لتوزيع العينة برفق على طبق بتري واستبدال غطاء اللوحة. كرر هذه العملية مع تخفيفات T6 و T9 ، كما هو موضح سابقا. احتضان الألواح التي تحتوي على كائنات هوائية في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. احتضان الصفائح التي تحتوي على كائنات لاهوائية في غرفة لاهوائية مضبوطة على 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة ألواح التخفيف T3 و T6 و T9 من الحاضنة والغرفة اللاهوائية وانقلها إلى سطح المقعد. من خلال العمل مع لوحة واحدة في كل مرة ، قم بتمرير حلقة تلقيح معقمة عبر الجزء العلوي من الوسائط بنمط متعرج. ثم استبدل غطاء طبق بتري. بعد ذلك ، قم بتدوير اللوحة بمقدار 1/3 وقم بتعقيم الحلقة لتقليل تردد النمط المتعرج الذي تم إجراؤه مسبقا. مرة أخرى ، بعد تعقيم الحلقة ، قم بتدوير اللوحة بمقدار 1/3 ، وقلل من تردد النمط المتعرج مرة أخيرة ، واستبدل الغطاء. كرر طريقة الخطوط هذه للألواح المتبقية ، كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، ضع الصفائح المخططة التي تحتوي على كائنات هوائية في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل والصفائح المخططة التي تحتوي على كائنات لاهوائية في غرفة لاهوائية مضبوطة على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
تم حصاد الثقافات من المناطق الهوائية واللاهوائية في عمود فينوغرادسكي لمدة سبعة أيام. بعد ذلك ، تم تخفيف الثقافات بشكل متسلسل قبل الخطوط والانتشار على ألواح أجار LB. كشفت الخطوط عن مجموعة مختلطة من كل منطقة من مناطق فينوغرادسكي التي تم تقييمها ، وأسفرت لوحات الانتشار عن نتائج مماثلة. سينتج عن الصفيحة المخططة من مجموعة مختلطة مستعمرات بكتيرية بأشكال وأحجام وقوام وألوان مختلفة. في المقابل ، أظهرت الصفائح المخططة والمنتشرة التي تحتوي على الكائن الحي المعروف ، الإشريكية القولونية ، وجود مجموعة متجانسة. بشكل عام ، من الأفضل حساب CFUs لكل مليلتر باستخدام متوسط عدد المستعمرات لثلاث لوحات منتشرة بنفس العينة وعامل التخفيف. اضرب متوسط عدد المستعمرات في عامل التخفيف واقسمه على الكمية المقتبسى. أخيرا ، يمكن استخدام المستعمرات المعزولة المختارة من كل لوحة في فحوصات التخصيب الإضافية لتحديد هوية الأنواع.
Q1: What is serial dilution and why is it used in microbiology?
Serial dilution is a systematic reduction of bacterial concentration through successive resuspension in fixed volumes of liquid diluent, typically in multiples of 10 for logarithmic reduction. It enables microbiologists to obtain manageable concentrations of organisms from samples containing unknown, often large numbers of bacteria, making enumeration and isolation feasible.
Q2: How does streak plating differ from spread plating?
Streak plating introduces a diluted sample to solid medium in a zig-zag pattern across thirds of the plate, progressively thinning the sample to isolate individual colonies and observe colony morphology. Spread plating distributes an aliquot evenly across the entire plate surface for quantitative enumeration rather than isolation.
Q3: What colony counts are considered valid for CFU calculation?
Plates with fewer than 30 colonies are discarded as too few to count due to greater statistical error. Plates with more than 300 colonies are discarded as too numerous to count because crowding and overlapping lead to underestimation. Valid counts fall between 30 and 300 colonies.
Q4: How do you calculate colony forming units per milliliter?
Average the colony count from three plates spread with the same sample and dilution factor. Multiply the average by the dilution factor and divide by the volume plated. This yields CFU/mL, which can be used to generate growth curves using colony forming units and optical density measurements for further analysis.
Q5: Why are Winogradsky Column samples suitable for serial dilution and plating?
Winogradsky Column samples contain mixed populations with multiple bacterial species and strains at unknown concentrations. Serial dilution and plating techniques allow researchers to isolate individual colonies, observe different morphologies, and quantify the diverse microbial communities present in aerobic and anaerobic zones.
Q6: What information can colony morphology reveal about bacterial populations?
Colony morphology—including shape, size, texture, and color—helps differentiate between bacterial species and strains. A homologous population of a single organism produces uniform colonies, while a mixed population displays colonies with varied characteristics, indicating the presence of different bacterial species or strains in the sample.
Q7: What is the significance of using 0.45% saline as a diluent in serial dilution?
Saline blanks serve as the standardized liquid diluent for successive resuspension steps in serial dilution. The 0.45% saline composition maintains osmotic balance and provides a consistent medium for diluting bacterial samples while preserving cell viability and enabling accurate enumeration and isolation of microorganisms.
Videos from this collection: