What is serial dilution and why is it used in microbiology?

Serial dilution is a systematic reduction of bacterial concentration through successive resuspension in fixed volumes of liquid diluent, typically in multiples of 10 for logarithmic reduction. It enables microbiologists to obtain manageable concentrations of organisms from samples containing unknown, often large numbers of bacteria, making enumeration and isolation feasible.

How does streak plating differ from spread plating?

Streak plating introduces a diluted sample to solid medium in a zig-zag pattern across thirds of the plate, progressively thinning the sample to isolate individual colonies and observe colony morphology. Spread plating distributes an aliquot evenly across the entire plate surface for quantitative enumeration rather than isolation.

What colony counts are considered valid for CFU calculation?

Plates with fewer than 30 colonies are discarded as too few to count due to greater statistical error. Plates with more than 300 colonies are discarded as too numerous to count because crowding and overlapping lead to underestimation. Valid counts fall between 30 and 300 colonies.

How do you calculate colony forming units per milliliter?

Average the colony count from three plates spread with the same sample and dilution factor. Multiply the average by the dilution factor and divide by the volume plated. This yields CFU/mL, which can be used to generate growth curves using colony forming units and optical density measurements for further analysis.

Why are Winogradsky Column samples suitable for serial dilution and plating?

Winogradsky Column samples contain mixed populations with multiple bacterial species and strains at unknown concentrations. Serial dilution and plating techniques allow researchers to isolate individual colonies, observe different morphologies, and quantify the diverse microbial communities present in aerobic and anaerobic zones.

What information can colony morphology reveal about bacterial populations?

Colony morphology—including shape, size, texture, and color—helps differentiate between bacterial species and strains. A homologous population of a single organism produces uniform colonies, while a mixed population displays colonies with varied characteristics, indicating the presence of different bacterial species or strains in the sample.

What is the significance of using 0.45% saline as a diluent in serial dilution?

Saline blanks serve as the standardized liquid diluent for successive resuspension steps in serial dilution. The 0.45% saline composition maintains osmotic balance and provides a consistent medium for diluting bacterial samples while preserving cell viability and enabling accurate enumeration and isolation of microorganisms.

التخفيفات التسلسلية والطلاء: التعداد الميكروبي

0 مشاهدة10:53 دقيقة

1. الإعداد

يجب كتابة مخطط انسيابي يسرد جميع المواد والبروتوكول التجريبي التدريجي وطريقة التخلص من الإمدادات في دفتر مختبر والاحتفاظ به بالقرب من مساحة العمل التجريبية.
يجب تعقيم مساحات العمل بمطهر مناسب (70٪ إيثانول) ويجب على المجرب التخفيف من مخاطر التلوث من خلال ارتداء ملابس مختبرية نظيفة تحميها أيضا من حالات التعرض الشاذة. تشمل الملابس المناسبة على سبيل المثال لا الحصر معطف المختبر ، وقفازات اللاتكس أو النتريل ، وأجهزة الغوغل ، وأجهزة التنفس ، والأحذية المغلقة. من الأهمية بمكان الحفاظ على تقنية المعقمة في جميع الأوقات.
تحضير 90 مل من محلول ملحي 0.45٪. باستخدام أسطوانة نظيفة متدرجة ، قم بقياس 90 مل من الماء المعقم ونقله إلى قارورة إرلينماير نظيفة تحمل علامة 0.45٪ ملحية . تزن .405 جم من كلوريد الصوديوم (Sigma-Aldrich NaCl S9888) وأضفها إلى القارورة المسمى 0.45٪ محلول ملحي. قم بالتدوير بشكل متكرر حتى لا يبقى أي مذاب مرئيا.
عند الانتهاء ، يجب على المجرب إعادة تعقيم جميع الأسطح والتخلص من أي كائنات غير مرغوب فيها أو مخزونات مخففة أو أطباق بتري أو حلقات تلقيح يمكن التخلص منها وفقا لإرشادات OSHA. يمكن إزالة ملابس المختبر قبل غسل اليدين.

2. إعداد الوسائط

حدد الوسائط المناسبة لزراعة الكائن الحي المطلوب. في معظم السيناريوهات ، يمكن المرق من نمو بكتيريا كافية. نظرا لأن الكائنات الحية من بروتوكول فينوغرادسكي مرغوبة هنا ، فقد تم تجميع عمود يتكون من كربونات الكالسيوم والكبريت والسليلوز والطين وتركه دون إزعاج لمدة 7 أيام. يتم فصل العمود المذكور أعلاه إلى أقسام هوائية ودقيقة ولاهوائية.
اختر وسيطا مناسبا لطلاء الكائن الحي محل الاهتمام. عادة ما يتم استخدام مكملات الوسائط السائلة مع أجار درجة علم الأحياء الدقيقة كعامل تصلب. LB متوسط / أجار كاف عند حصاد عينات من المناطق الهوائية والهوائية الدقيقة واللاهوائية من العمود المذكور أعلاه. ملاحظة: لم يتم حصاد عينات من المنطقة المحبة للميكرو لهذا الإجراء. ومع ذلك ، يجب زراعة هذه الكائنات الحية في برطمانات الشموع. يؤدي إدخال شمعة إلى غرفة الزراعة هذه قبل الختم إلى خلق بيئة منخفضة الأكسجين مناسبة لتكاثر الهوية الدقيقة.
نظرا لأننا نرغب في تحضير 250 مل ، استخدم 500 مل (أو أكبر) قوارير Erlenmeyer لمنع الغليان عند التعقيم. قم بتسمية أحدهما "مرق" والآخر "أجار".
حدد مقدار الوسائط المطلوبة لإنشاء كل حل باتباع توصيات تركيز الشركة المصنعة. يتم تحضير LB Agar ، المستخدم هنا ، عن طريق الجمع بين 25 جم / لتر والماء عالي النقاء. يتطلب حجمنا البالغ 250 مل محلولا من 6.25 رطل أجار / 250 مل من الماء. وبالمثل ، يتم تحضير مرق LB من خلال الجمع بين نفس نسبة مرق LB والماء. نظرا لأنه لا يتم استكماله بعامل تصلب ، فلن يتصلب عند تبريده.
قم بوزن الوسائط واخلطها بالماء بنسب تتوافق مع توصيات الشركة المصنعة. أضف 6.25 جرام من LB Agar إلى قارورة تحمل علامة "أجار" ، و 6.25 جرام من مرق LB إلى قارورة تحمل علامة "مرق". أضف 250 مل من الماء فائق النقاء إلى كل قارورة.
لف ورق الألمنيوم فوق كل قارورة واستخدم الأوتوكلاف لتعقيم الوسائط لمدة لا تقل عن 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة.
باستخدام قفاز أو وسادة مقاومة للحرارة ، قم بإزالة القوارير من الأوتوكلاف عند اكتمال الدورة وضعها في حمام مائي 40-50 درجة مئوية.
بمجرد الوصول إلى درجة الحرارة المناسبة ، اسكب محتويات القارورة المسماة "مرق" في 250 مل Erlenmeyer ، أو قارورة مستديرة القاع. قم بتسمية قارورة 250 مل "solution₀".
احصل على أطباق بتري معقمة مقاس 10 ، 100 مم × 15 مم وقم بتسميتها بالتاريخ والاسم ونوع الوسائط المستخدمة ومنطقة عمود فينوغرادسكي التي سيتم حصاد الكائنات الحية منها.
قم بإزالة القارورة التي تحمل علامة "أجار" من الحمام المائي وابدأ في سكبها في كل من أطباق بتري ال 10. يجب عدم إضافة أكثر من 15 مل لكل طبق. يمكن إجراء ذلك أيضا باستخدام ماصة وماصة مصلية سعة 25 مل لتحسين الدقة. استخدم طرف ماصة معقم لإزالة أي فقاعات موجودة، ثم قم بتغطيتها بأغطية اللوحة واتركها لتتجلب طوال الليل.

3. تحضير مخفف

قم بإعداد عشرة أنابيب اختبار قادرة على تخزين 20 مل أو أكثر في رف وقم بتسميتها T1-T10. يتوافق كل رقم أنبوب مع عامل التخفيف الذي يتوافق معه (على سبيل المثال ، T4 = 1x10 ^-4 أو 0.0001 أو 1 / 10,000 من تركيز المخزون).
Pipet 9 مل من محلول ملحي 0.45٪ في كل من أنابيب الاختبار ال 10.
الفراغات المالحة جاهزة الآن للتعقيم بواسطة الأوتوكلاف. استخدم رقائق الألومنيوم لتغطية كل من أنابيب الاختبار ال 10 ثم انقلها إلى رف أنبوب اختبار متوافق مع الأوتوكلاف. تعقيم لمدة لا تقل عن 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة.
قم بإزالة الفراغات باستخدام قفازات مقاومة للحرارة واتركها لتبرد. قم بتغطيته وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة عندما تصل الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة ، أو عندما تبرد عند لمسها.

4. زراعة الكائن الحي المستهدف

تلقيح "الحل₀" بمستعمرة واحدة من صفيحة مخططة مسبقا أو 50 ميكرولتر من مخزون مجمد. اسمح للكائن الحي المستهدف بوقت التكاثر عن طريق وضع "الحل ₀" الملقح في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل مع الاهتزاز (إذا لزم الأمر). (ملاحظة: يجب تغطية القارورة لمنع التلوث. إذا كان الكائن الحي المستهدف هوائي ، فاستخدم شاشا معقما وسدادات قطنية لمنع التلوث. في حالة تقييم مناطق عمود فينوغرادسكي ، ما عليك سوى إزالة 1 جرام من كل منطقة مرغوبة (الهوائية واللاهوائية لأغراض هذه الدراسة) وإعادة التعليق في T1 قبل المتابعة إلى الخطوة 5.3.

5. التخفيف التسلسلي

احصل على القارورة التي تحمل علامة "مرق المغذيات" من الحاضنة ورجها بقوة.
Pipet 1 مل من "solution₀" في أنبوب الاختبار المسمى T1. دوامة T1. في حالة تقييم مستخلصات Winogradsky ، قم بوزن 1 جرام من المنطقة المرغوبة وأضفها إلى T1 قبل الدوامة. (ملاحظة: يتم استخدام 1 مل هنا من أجل البساطة - يمكن أيضا استخدام كميات أصغر أو أكبر من المخفف).
قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T1 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T2. دوامة T2.
قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T2 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T3. دوامة T3.
قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T3 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T4. دوامة T4.
قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T4 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T5. دوامة T5.
قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T5 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T6. دوامة T6.
قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T6 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T7. دوامة T7.
قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T7 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T8. دوامة T8.
قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T8 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T9. دوامة T9.
قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T9 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T10.

6. انتشار الطلاء

Pipet 100 ميكرولتر من عينة مخففة من T1 مباشرة على طبق بتري. يمكن تكرار هذه الخطوة ، ولكن لا يلزم أن تتكرر لكل أنبوب.
احصل على قضيب نشر معقم يمكن التخلص منه أو تعقيم قضيب نشر الزجاج باللهب. في حركة في اتجاه عقارب الساعة / عكس اتجاه عقارب الساعة ، حرك الجزء الأفقي من قضيب الانتشار لتوزيع العينة بالتساوي داخل طبق بتري.
كرر ذلك لكل منطقة من عمود فينوغرادسكي المراد تقييمها.
احتضان الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بالنسبة للكائنات اللاهوائية ، استخدم غرفة لاهوائية.

7. Streaking

حدد التخفيف المناسب للكائن الحي المستهدف. على سبيل المثال ، سينتج عن الحل₄ تخفيف 1/10,000 من تركيزك الأولي. عادة ما يتم تقييم تخفيفات 1/1,000^th (T3/Solution) و 1/1,000,000^th (T6/Solution₆) و 1/1,000,000,000^th (T9/Solution_}) لتعداد الميكروبات.
باستخدام حلقة تلقيح بلاستيكية معقمة يمكن التخلص منها أو حلقة تلقيح معدنية قابلة لإعادة الاستخدام تعرضت للنيران لمدة لا تقل عن 10 ثوان ، انغمس في المحلول المطلوب من الخطوة 5. يجب أن تنقل حلقات التلقيح المعايرة 0.01 مل. (تحذير: لا تسمح للحلقة الملتهبة بملامسة البكتيريا فور إزالتها من الحرارة)
ارفع غطاء طبق بتري قليلا على جانب واحد حتى تتمكن حلقة التلقيح فقط من الوصول إلى الأجار. حرك حلقة التلقيح عبر الجزء العلوي من الوسائط بطريقة متعرجة مع الحرص على عدم المساس بالأجار. اخفض غطاء طبق بتري.
استخدم حلقة تلقيح جديدة يمكن التخلص منها أو أعد تعقيم الحلقة القابلة لإعادة الاستخدام.
قم بتدوير اللوحة بمقدار 1/3 تقريبا ^rd (~ 118 درجة) وقلل من تكرار الحركة المتعرجة.
مرة أخرى ، استخدم حلقة جديدة يمكن التخلص منها أو أعد تعقيم حلقة معدنية قبل الدوران النهائي وقلل من التردد المتعرج مرة أخرى. اخفض غطاء طبق بتري.
كرر الخطوات 7.2 - 7.6 حتى يتم ربط ثلاثة أطباق بتري على الأقل لثلاثة تخفيفات مختلفة ، باستخدام حلقة جديدة يمكن التخلص منها أو عن طريق إعادة إشعال حلقة قابلة لإعادة الاستخدام ( الشكل 2 ).
ضع أطباق بتري مخططة في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل. بالنسبة للكائنات اللاهوائية ، استخدم غرفة لاسروبية.

8. تحليل البيانات والنتائج

تم حصاد الثقافات من مناطق الأكسجين ونقص الأكسجين في عمود فينوغرادسكي لمدة 7 أيام. هذه المناطق مناسبة للكائنات اللاهوائية غير المتجانسة وأكسدة الحديد ، على التوالي.
تم تخفيف النماذج المستخرجة للأعمدة بشكل متسلسل قبل الخطوط أو الانتشار على ألواح LB Agar.
كشفت الخطوط عن مجموعة سكانية مختلطة من كل منطقة من مناطق فينوغرادسكي التي تم تقييمها. أسفرت لوحات الانتشار عن نتائج مماثلة.
لحساب CFU / مل أو CFU / g ، متوسط عدد المستعمرات المحسوبة من ثلاث لوحات. اضرب متوسط عدد المستعمرات في عامل التخفيف واقسمه على الكمية المقتبسى. على سبيل المثال ، إذا تم حساب ما معدله 65 مستعمرة على أطباق تم تلقيحها ب 0.1 مل من المحلول ₆ (T6) ، فإن الصيغة الموضحة سابقا ستساوي 650،000،000 CFU / mL.
يمكن الآن اختيار مستعمرات معزولة من كل لوحة لاستخدامها في فحوصات التخصيب لتحديد هوية الأنواع.

المصدر: جوناثان ف. بليز ¹ ، إليزابيث سوتر ¹ ، وكريستوفر ب. كوربو ¹
¹ قسم العلوم البيولوجية ، كلية فاغنر ، 1 طريق الحرم الجامعي ، جزيرة ستاتن نيويورك ،…