الثقافات النقية وطلاء الخطوط: عزل المستعمرات البكتيرية المفردة من عينة مختلطة

على طبق بتري ، إذا خضعت بكتيريا واحدة لجولات متعددة من التكاثر اللاجنسي ، فسيؤدي ذلك إلى تكوين مستعمرة نسيلية. ومع ذلك ، قد يكون الحصول على بكتيريا واحدة من عينة مختلطة ، مثل تعليق التربة ، أمرا صعبا. إذا تم أخذ حلقة واحدة من هذه الثقافة غير المتجانسة ، فيمكن أن تحتوي على ما يصل إلى تريليون بكتيريا فردية. لنشر هذا العدد الكبير من البكتيريا على سطح صفيحة أجار والحصول على مستعمرة واحدة ، حتى باستخدام نمط متعرج ، ستحتاج الحلقة إلى السحب بشكل مستمر على سطح ما يكفي من الألواح الموضوعة جنبا إلى جنب لتطويق جزيرة الحرية بأكملها. من الواضح أن العلماء لا يستخدمون هذا العدد الكبير من اللوحات. بدلا من ذلك ، يستخدمون تقنية تسمى طلاء الخط.

تعتمد

تقنية لوحة الخطوط على التخفيف التدريجي لعينة بكتيرية ، ويتم إجراؤها على سطح الوسائط الصلبة لطبق بتري واحد. للبدء ، يتم تقسيم سطح الوسائط بصريا إلى خمسة أقسام عن طريق تعيين أربعة أجزاء من المحيط كأقسام أربعة أولى ، ومركز اللوحة كقسم خامس. سيؤدي ذلك إلى إنشاء خمس لوحات وسائط بشكل فعال من طبق بتري واحد. بعد ذلك ، باستخدام حلقة من اللقاح المطلوب ، يتم رسم القسم الأول باستخدام نمط متعرج. بعد ذلك ، يتم استخدام حلقة جديدة يمكن التخلص منها ، أو في حالة وجود حلقة سلكية ، يتم تعقيمها بموقد بنسن ، وإشعالها حتى تصبح حمراء ساخنة على طول السلك. هذا الاستخدام لحلقة جديدة ، أو حلقة تعقيم باللهب ، يزيل أي خلايا بكتيرية متبقية ، مما يساعد في تخفيف البكتيريا. ثم يتم تبريد الحلقة الساخنة في الهواء لبضع ثوان قبل سحبها عبر القسم الأول لإنشاء ثلاثة إلى أربعة خطوط منفصلة ، كل منها يحمل جزءا صغيرا فقط من البكتيريا في القسم الثاني. يتم ربط الأقسام المتبقية بنفس الطريقة ، باستخدام حلقة معقمة في كل مرة ، وتمريرة واحدة عبر الخط السابق.

باستخدام دورة الخطوط والتعقيم هذه ، يجب تخفيف تركيز البكتيريا في كل قسم لاحق بحيث يحتوي القسم الأخير على عدد قليل من البكتيريا الموجودة بشكل منفصل. عند الحضانة ، تتكاثر هذه البكتيريا المنفصلة لإنتاج مستعمرات نسيلة معزولة من الخلايا الوليدة ، والتي يشار إليها باسم وحدات تشكيل المستعمرة ، أو CFUs. يمكن حصادها وإعادة خطها للتأكد من أن العمل اللاحق يتضمن نوعا واحدا فقط من البكتيريا ، يشار إليه باسم الثقافة النقية. بالإضافة إلى عزل المستعمرات الفردية عن ثقافة البكتيريا المختلطة ، تستخدم تقنية طلاء الخطوط أيضا لتحديد سلالات خاصة بالوسائط ، أو تحديد مورفولوجيا المستعمرة البكتيرية ، أو تحديد الأنواع البكتيرية المختلفة. في هذا الفيديو ، سوف نوضح كيفية عزل المستعمرات أحادية البكتيريا من تعليق عينة مختلطة من البكتيريا عبر تقنية طلاء الخط.

للبدء ، ارتد قفازات المختبر ومعطف المختبر. بعد ذلك ، قم بتعقيم مساحة العمل باستخدام 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، حدد وسيطا مناسبا يحافظ على الأنواع البكتيرية المستخدمة أو السلالة وابدأ في تحضير الوسائط. هنا ، يتم تحضير أجار LB الشائع عن طريق وزن عشرة جرامات من الوسائط المسحوقة المصنوعة مسبقا و 7.5 جرام من الأجار. أضف المكونات الموزونة والمجففة إلى زجاجة زجاجية قادرة على استيعاب ضعف الحجم النهائي لتجنب الفائض. ثم أضف 500 مل من الماء إلى الزجاجة ، وقم بتغطيتها بإحكام شبه محكم. قم بتعقيم الوسائط عن طريق وضع الزجاجة في الأوتوكلاف المضبوض على 121 درجة مئوية لمدة عشرين دقيقة. بعد الانتهاء ، استخدم قفازات مقاومة للحرارة أو وسادة ساخنة لإزالة الوسائط من الجهاز ثم قم بلف غطاء الزجاجة على الفور لإغلاقه بإحكام.

للاستخدام في نفس اليوم ، اترك الوسائط تبرد عن طريق وضع الزجاجة في حمام مائي ساخن إلى حوالي 45 درجة مئوية ، للحفاظ على الوسائط في حالة سائلة. بدلا من ذلك ، يمكن ترك الوسائط في درجة حرارة الغرفة لتخزينها في الحالة الصلبة. عند الحاجة ، ضع الزجاجة في الميكروويف مع الغطاء مفتوحا قليلا لإذابة الوسائط ، واترك الوسائط تبرد باستخدام حمام مائي 45 درجة مئوية.

بعد ذلك ، خذ كم من أطباق بتري المعقمة ، وباستخدام علامة دائمة ، قم بتسميتها بأسماء المحقق والوسائط بالإضافة إلى التاريخ. بعد ذلك ، انقل الحجم المطلوب من الوسائط إلى وعاء معقم ، وأضف المضادات الحيوية أو المكونات الحساسة الأخرى إذا لزم الأمر. هنا ، يتم خلط 50 مل من الوسائط مع 100 ميكرولتر من الكاناميسين للحصول على تركيز نهائي يبلغ 25 ميكروغرام لكل ملليلتر. قم بتدوير الأنبوب لضمان التوزيع المتساوي للمكونات المضافة في جميع أنحاء الوسائط. ببطء ، لتجنب تكوين الفقاعات ، اسكب 20 إلى 25 مل من وسط الثقافة 45 درجة مئوية تقريبا في كل من اللوحة. إذا ظهرت فقاعات أو رغوة ، فقم بإزالتها بسرعة باستخدام ماصة عادية وطرف معقم. ثم استبدل جميع الأغطية على الفور لمنع التلوث. اترك الأجار يتجمد في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل أو طوال الليل. بمجرد التصلب ، قم بتخزين ألواح الثقافة رأسا على عقب عند أربع درجات مئوية لتقليل التكثيف على سطح الوسط.

لربط الثقافة المفضلة ، خذ أولا لوحة ثقافة نظيفة وقم بإزالة الغطاء. العمل بسرعة ، اغمر حلقة معقمة يمكن التخلص منها في اللقاح المطلوب ثم امسح الحلقة على الفور فوق الربع الأول من اللوحة باستخدام حركة متعرجة. استبدل غطاء الطبق ، وتخلص من حلقة التلقيح المستخدمة ، ثم حدد حلقة معقمة جديدة. باستخدام الحلقة الجديدة ، قم بعمل ثلاث إلى أربع ضربات عبر خط المسحة الأصلي المشع من الربع الأول ، والذي يجب أن يحتوي على مجموعة بكتيريا كثيفة نسبيا في الربع الثاني. أغلق الغطاء مرة أخرى ، وتخلص من الحلقة. مع حلقة جديدة ، كرر هذا الإجراء مرة أخرى ، ولكن هذه المرة تمتد من الربع الثاني إلى الربع الثالث. ثم ، مع حلقة جديدة مرة أخرى ، قم بعمل خط آخر من القسم الثالث إلى القسم الرابع من اللوحة. أخيرا ، باستخدام حلقة جديدة ، قم بضربة أخيرة بنمط متعرج من الربع الرابع باتجاه مركز اللوحة. سيكون انتشار البكتيريا أقل في هذه المنطقة ، مما يسمح بشكل مثالي بإنشاء مستعمرات فردية من خلية أم واحدة قابلة للحياة.

استبدل غطاء اللوحة ، وإذا كان ذلك مناسبا للأنواع البكتيرية ، فقم بإغلاق اللوحة بغشاء بارا لمنع تدفق الهواء. اقلب لوحة الثقافة رأسا على عقب لمنع قطرات التكثيف ، ثم ضعها في درجة حرارة مناسبة للنمو. هنا ، يتم ضبط الحاضنة على 37 درجة مئوية. اترك اللوحة تحتضن حتى تظهر المستعمرات البكتيرية. لتوليد مجموعة بكتيرية نسيلة ، حدد مستعمرة منفصلة واحدة من هذه اللوحة. الآن ، باستخدام الحلقة المعقمة ، المس المستعمرة المستهدفة ، وكما كان من قبل ، قم بعمل خط في الربع الأول من لوحة جديدة. استمر في تعقيم الحلقة بالتناوب وخط الأرباع المتبقية من اللوحة كما هو موضح سابقا ، وتنتهي بالتعرج إلى المركز. أغلق الطبق وضعه ليحتضن حتى تتشكل مستعمرات منفصلة. بمجرد نمو هذه المستعمرات ، فإنها ستمثل عادة سلالات نسيلة نقية.

قد تحتوي صفيحة الخط الأولية على مستعمرات تنشأ من خلايا من أنواع بكتيرية مختلفة أو خلايا ذات تركيبة وراثية مختلفة ، اعتمادا على نقاء العينة. من خلال العزل اللاحق لمستعمرة واحدة ، حيث يتم اشتقاق جميع الوحدات من خلية أم مشتركة ، فإن إجراء الخطوط الثاني يولد مجموعة بكتيرية نسيلة نسبيا ، مناسبة لمزيد من التوصيف أو التلقيح في المرق.