Why are variable regions of 16S rRNA useful for bacterial identification?

Variable regions of 16S rRNA serve as unique molecular fingerprints for bacterial species because they differ among bacteria while conserved regions remain essential for ribosome function. These variable regions allow scientists to distinguish phenotypically identical strains that appear the same under microscopy or on growth media, making 16S rRNA sequencing more accurate than conventional identification methods.

What are the main steps in a PCR reaction for 16S rRNA amplification?

PCR consists of repeated cycles of three key steps: denaturation of double-stranded DNA template, annealing of universal primer pairs to conserved regions of the gene, and extension of primers by DNA polymerase. Universal primers bind to highly conserved regions, allowing amplification of the 16S rRNA gene in any bacterial species. The process generates millions of copies of the target DNA fragment for subsequent analysis.

How do you evaluate the quality of a PCR product before sequencing?

PCR product quality is assessed using agarose gel electrophoresis, where successful amplification yields a single band of expected size, typically up to 1500 base pairs. The band should appear distinct without smearing or multiple bands, indicating a pure product. If the gel shows multiple bands or no band, the PCR reaction failed and should be repeated with optimized conditions.

What information does a DNA chromatogram reveal about sequencing quality?

A DNA chromatogram displays peaks representing nucleotides in the sequence. An ideal chromatogram has evenly spaced peaks with minimal background signals. Double peaks indicate multiple DNA templates were present, while broad peaks suggest loss of resolution. Poor quality sections typically appear at the five prime and three prime ends and should be removed before database comparison.

How does BLAST database searching confirm bacterial species identity?

After assembling forward and reverse primer sequences into one continuous sequence, the sequence is entered into the BLAST nucleotide database for comparison with reference 16S rRNA sequences. BLAST returns matches ranked by highest similarity, allowing confirmation of bacterial identity. One hundred percent identity with a reference sequence provides definitive species identification.

Why is genomic DNA quality critical before beginning PCR?

High-quality genomic DNA free of contaminants is essential because impurities can inhibit the PCR reaction and prevent successful amplification. DNA should appear as a thick band above 10 kilobases with minimal smearing on an agarose gel. Creating serial dilutions of the isolated DNA helps optimize the template concentration for PCR, improving amplification efficiency and product quality.

What advantages does 16S rRNA sequencing offer over conventional bacterial identification methods?

Sixteen S rRNA sequencing is faster and more accurate than conventional methods like microscopy, growth on selective media, and biochemical tests. It enables identification of bacteria difficult to culture in laboratory conditions and allows discrimination between phenotypically identical strains at the molecular level. This molecular approach provides definitive species and strain identification based on genetic variation.

تسلسل 16S rRNA: تقنية قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد الأنواع البكتيرية

0 مشاهدة10:57 دقيقة

1. الإعداد

أثناء التعامل مع الكائنات الحية الدقيقة ، يجب اتباع الممارسات الميكروبيولوجية الجيدة. يجب التعامل مع جميع الكائنات الحية الدقيقة ، وخاصة العينات غير المعروفة ، كمسببات الأمراض المحتملة. اتبع تقنية التعقيم لتجنب تلويث العينات أو الباحثين أو المختبر. اغسل يديك قبل وبعد التعامل مع البكتيريا ، واستخدم القفازات ، وارتد ملابس واقية.
إجراء تقييم للمخاطر للبروتوكول التجريبي لعزل الحمض النووي الجيني وتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قد تكون بعض الكواشف ضارة!
الثقافة النقية ضرورية لتسلسل 16S rRNA. قبل الشروع في عزل الحمض النووي الجيني ، تأكد من أن مادة البداية نقية تماما. يمكن القيام بذلك عن طريق طلاء الخطوط لعزل المستعمرات الفردية. يمكن زراعتها بشكل مخطط على أطباق فردية ، أو في مرق ، إذا لزم الأمر.
معدات المختبرات المطلوبة:
1. دورة حرارية ل PCR. تتمثل وظيفة التدوير الحراري في رفع درجة الحرارة وخفضها وفقا لبرنامج محدد. أثناء إنشاء البرنامج ، سيطلب منك إدخال قيم درجة الحرارة والوقت لكل خطوة PCR بالإضافة إلى إجمالي عدد الدورات.
2. نظام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. يتم استخدامه لفصل شظايا الحمض النووي بناء على حجمها وشحنتها. في هذا البروتوكول ، سيتم استخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز لتصور جودة منتجات الحمض النووي الجيني المعزول وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

2. بروتوكول

ملاحظة: ينطبق البروتوكول الموضح على تسلسل جين 16S rRNA من مزرعة نقية للبكتيريا. لا ينطبق على الدراسات الميتاجينومي.

زراعة البكتيريا لعزل الحمض النووي الجيني (gDNA).
1. قم بزراعة الكائنات الحية الدقيقة الخاصة بك على وسط مناسب. يمكن استخدام كل من الوسائط السائلة والصلبة في هذه الخطوة. اختر الظروف التي تحقق أفضل نمو. أثناء التخطيط للتجربة ، ضع في اعتبارك أن البكتيريا بطيئة النمو قد تحتاج إلى عدة أيام للوصول إلى مرحلة النمو المتأخر / الثابت. في هذا البروتوكول ، نمت Bacillus subtilis 168 في مرق lysogeny (LB) بين عشية وضحاها في حاضنة اهتزاز مثبتة عند 200 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية.
عزل gDNA.
1. إذا نمت البكتيريا على وسط صلب ، اكشط بعض الخلايا باستخدام حلقة معقمة وأعد تعليقها في 1 مل من الماء المقطر
2. إذا نمت البكتيريا في وسط سائل ، فاستخدم ما يقرب من 1.5 مل من المزرعة الليلية.
3. قم بتقطيع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (دقيقة واحدة ، 12,000 - 16,000 × جم) ، وقم بإزالة المادة الطافية ، واستخدم الخلايا لعزل gDNA باستخدام مجموعة تجارية أو بروتوكولات قياسية [على سبيل المثال ، تحضير الحمض النووي الكلي CTAB (13) أو استخراج الفينول الكلوروفورم (14)]. هنا ، تم استخدام مجموعة تجارية لعزل gDNA من 1.5 مل من B. subtilis 168 مزرعة ليلية ، OD₆₀₀ = 1.5.
  ملاحظة 1: بالنسبة لبعض البكتيريا سالبة الجرام ، يمكن حذف هذه الخطوة واستبدالها بإطلاق بسيط للحمض النووي من الخلايا عن طريق الغليان. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في الماء المقطر واحتضانها في كتلة تسخين على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  الملاحظة 2: يصعب تعطيل الخلايا البكتيرية موجبة الجرام. لذلك يوصى باختيار طريقة أو مجموعة عزل gDNA مخصصة للعزل عن هذه المجموعة من البكتيريا.
فحص جودة gDNA.
1. تحقق من جودة gDNA المعزول عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. أولا ، امزج 5 ميكرولتر من gDNA المعزول مع 1 ميكرولتر من صبغة التحميل (6x) ، وقم بتحميل العينة على هلام الاغاروز 0.8٪ الذي يحتوي على كاشف تلطيخ الحمض النووي.
2. قم بتحميل معيار الكتلة الجزيئية وقم بتشغيل الرحلان الكهربائي حتى تصل مقدمة الصبغة إلى قاع الجل.
3. بمجرد اكتمال الرحلان الكهربائي ، تصور الجل على مصباح إضاءة مناسب (إما الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق). يظهر GDNA كنطاق جزيئي عالي سميك (أعلى من 10 كيلو بايت). يظهر مثال على فحص جودة gDNA في <الفئة القوية = "xfig">الشكل 3.
4. إذا اجتاز gDNA مراقبة الجودة (أي أن النطاق الجزيئي العالي موجود وهناك القليل من تلطيخ gDNA أو عدم وجود تلطيخ للحمض النووي) ، فقم بتخفيف gDNA الخاص بك بشكل متسلسل عن طريق وضع العلامات الأولى على 3 أنابيب طرد مركزي دقيقة على النحو التالي: "10x" و "100x" و "1000x".
5. الماصة 90 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم في كل من الأنابيب الثلاثة.
6. خذ 10 ميكرولتر من محلول gDNA وأضفه إلى الأنبوب الذي يحمل علامة "10x".
7. قم بتحريك الحجم بالكامل (أي 100 ميكرولتر) لأعلى ولأسفل تماما لضمان خلط المحلول بشكل موحد. ثم خذ 10 ميكرولتر من المحلول من هذا الأنبوب وانقله إلى الأنبوب الذي يحمل علامة "100x".
8. امزج كما هو موضح من قبل وكرر نفس الإجراء عن طريق نقل 10 ميكرولتر من المحلول من الأنبوب "100x" إلى الأنبوب "1000x". سيتم استخدام هذه التخفيفات كقالب في تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

< p class = "jove_content" >

الشكل 3: الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز من gDNA معزولة من Bacillus subtilis. حارة 1: M - علامة الكتلة الجزيئية (من أعلى إلى أسفل: 10000 نقطة أساس ، 8000 نقطة أساس ، 6000 نقطة أساس ، 5000 نقطة أساس ، 4000 نقطة أساس ، 3500 نقطة أساس ، 3000 نقطة أساس ، 2500 نقطة أساس ، 2000 نقطة أساس ، 1500 نقطة أساس ، 1000 نقطة أساس). حارة 2: gDNA - الحمض النووي الجيني المعزول من Bacillus subtilis. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تضخيم جين 16S rRNA بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).< / > ملاحظه: تم تحسين بروتوكول تفاعل البوليميراز المتسلسل أدناه لبوليميراز الحمض النووي وزوج التمهيدي 8F - 1492R (انظر الجدول 1). مطلوب تحسين البروتوكول لكل زوج من البوليميراز والبرايمر.
1. قم بإذابة جميع الكواشف على الجليد.
2. قم بإعداد المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في الجدول 2. نظرا لأن بوليميراز الحمض النووي نشط في درجة حرارة الغرفة ، يجب إجراء إعداد التفاعل على الجليد ، أي يجب أن تبقى أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل ومكونات التفاعل على الجليد طوال الوقت. قم بإعداد تفاعل واحد لكل عينة gDNA وتفاعل واحد للتحكم السلبي. التحكم السلبي هو مزيج PCR بدون قالب gDNA ويستخدم لضمان عدم تلوث المكونات الأخرى للتفاعل.
  ملاحظه: في حالة وجود عينات متعددة ، يتم تحضير مزيج رئيسي بشكل شائع. المزيج الرئيسي هو حل يحتوي على جميع مكونات التفاعل باستثناء القالب. يساعد على حذف سحب العينات المتكرر وتجنب خطأ سحب العينة ويضمن تناسقا عاليا بين العينات. لتحضير المزيج الرئيسي ، اضرب حجم كل مكون (باستثناء قالب الحمض النووي) في عدد العينات التي تم اختبارها. امزج جميع المكونات في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وقم بسحب الحجم بالكامل لأعلى ولأسفل عدة مرات.
3. Aliquot 49 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في أنابيب PCR الفردية.
4. أضف قالب 1 ميكرولتر إلى أنابيب مع مزيج رئيسي. للتحكم السلبي أضف 1 ميكرولتر من الماء المعقم. للتأكد من خلط المكونات جيدا، قم بسحب المزيج برفق لأعلى ولأسفل ~ 10 مرات باستخدام ماصة مضبوطة على 30-50 ميكرولتر.
5. اضبط جهاز PCR باستخدام البرنامج الموضح في الجدول 3.
6. ضع الأنابيب في جهاز PCR وابدأ البرنامج.
7. بمجرد اكتمال البرنامج ، افحص جودة منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بك عن طريق الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز.
8. ينتج عن تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الناجح باستخدام زوج التمهيدي 8F-1492R نطاقا واحدا يبلغ حوالي 1.5 كيلو بايت (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 4). في حالة وجود نطاقات أخرى (مثل منتجات غير محددة) ، قم بتحسين برنامج PCR عن طريق ضبط درجة حرارة التلدين. إذا كان هناك نطاق واحد بالحجم المتوقع، فانتقل إلى الخطوة التالية. هنا ، أنتج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل مع قالب gDNA المخفف 100x أفضل منتج لأنه يحتوي على شريط حاد من الحجم المتوقع ويفتقر إلى منتجات غير محددة. ومن ثم تم اختياره لتنقية وإرساله للتسلسل.
9. قبل التسلسل ، يجب تنظيف المنتج من البادئات المتبقية ، والديوكسي ريبونوكليوتيدات ، والبوليميراز ، والمخزن المؤقت التي كانت موجودة في تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يمكن عزل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل التجارية. يتم تحميل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على عمود يحتوي على مصفوفة ربط الحمض النووي. يرتبط منتج PCR بالعمود، بينما تتدفق المكونات الأخرى عبر العمود. ثم يتم غسل العمود باستخدام مخزن الغسيل ، وأخيرا ، يتم شطف الحمض النووي في المخزن المؤقت المفضل. تأكد من أن المخزن المؤقت للشطف المكمل بالمجموعة متوافق مع التسلسل.
10. أرسل منتج PCR المنقى لتسلسل الحمض النووي. اتبع الإرشادات الخاصة بتقديم عينات التسلسل في مرفق التسلسل المختار. للحصول على أفضل تغطية تسلسلية ، استخدم بادئات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (نفس المستخدمة في القسم 2.4.1) كبادئات للتسلسل. هنا ، تم استخدام الاشعال 8F و 1492R لتسلسل منتج PCR.

مكون التركيز النهائي الحجم لكل تفاعل الحجم لكل x تفاعلات (مزيج رئيسي) 5x المخزن المؤقت للتفاعل 1x 10 ميكرولتر 10 ميكرولتر × × 10 ملي مولار dNTPs 200 ميكرومتر 1 ميكرولتر 1 ميكرولتر × × 10 ميكرومتر برايمر 8F 0.5 ميكرومتر 2.5 ميكرولتر 2.5 ميكرولتر × × 10 ميكرومتر برايمر 1492R 0.5 ميكرومتر 2.5 ميكرولتر 2.5 ميكرولتر × × بوليميراز فوسيون 1 وحدة 0.5 ميكرولتر 0.5 ميكرولتر × × قالب الحمض النووي * - 1 ميكرولتر - ddH₂O - 32.5 ميكرولتر 32.5 ميكرولتر × × الحجم الإجمالي 50 ميكرولتر 49 ميكرولتر × ×

الجدول 2: مكونات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل . * استخدم gDNA المخفف 10x أو 100x أو 1000x من الخطوة 2.3.

درج درجة الحرارة الوقت دورات التمسخ الأولي 98 درجة مئوية 30 ثانية التمسخ 98 درجة مئوية 10 ثوان 25-30 الصلب 60 درجة مئوية 30 ثانية امتداد 72 درجة مئوية 45 ثانية التمديد النهائي 72 درجة مئوية 7 دقائق مسك 4 درجة مئوية ∞

الجدول 3: برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم جين 16S rRNA.

< p class = "jove_content" >

الشكل 4: تم تضخيم الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات 8F و 1492R و gDNA كقالب. عينة gDNA من B. subtilis (انظر الشكل 3) تم تخفيفها 10 و 100 و 1000 مرة من أجل اختبار أفضل نتيجة. حارة 1: M - علامة الكتلة الجزيئية (من أعلى إلى أسفل: 10000 نقطة أساس ، 8000 نقطة أساس ، 6000 نقطة أساس ، 5000 نقطة أساس ، 4000 نقطة أساس ، 3500 نقطة أساس ، 3000 نقطة أساس ، 2500 نقطة أساس ، 2000 نقطة أساس ، 1500 نقطة أساس ، 1000 نقطة أساس ، 750 نقطة أساس ، 500 نقطة أساس ، 250 نقطة أساس). حارة 2: تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل مع قالب مخفف 10x. حارة 3: تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل مع قالب مخفف 100x. حارة 4: تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل مع قالب مخفف 1000x. حارة 5: (C-) - تحكم سلبي (تفاعل بدون قالب الحمض النووي). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تحليل البيانات والنتائج

ملاحظة: يتم تسلسل منتج PCR باستخدام الاشعال الأمامية (هنا 8F) والعكسية (هنا 1492R). لذلك ، يتم إنشاء مجموعتين من تسلسل البيانات ، واحدة للأمام والأخرى للطبقة التمهيدية العكسية. لكل تسلسل ، يتم إنشاء نوعين على الأقل من الملفات: أ) ملف نصي يحتوي على تسلسل الحمض النووي و ب) مخطط كروماتوغرام للحمض النووي ، والذي يوضح جودة تشغيل التسلسل.

بالنسبة للبرايمر الأمامي ، افتح الكروماتوجرام ، وافحص التسلسل بعناية. يجب أن يحتوي الرسم الكروماتوغرامي المثالي لتسلسل الجودة على قمم متباعدة بشكل متساو وإشارات خلفية قليلة أو معدومة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 5أ).
إذا لم يكن الكروماتوجرام عالي الجودة ، فيجب تجاهل التسلسل ، أو مراجعة ملف نص التسلسل وفقا لما يلي:
1. يشير وجود قمم مزدوجة في جميع أنحاء الكروماتوجرام إلى وجود قوالب متعددة للحمض النووي. يمكن أن يكون هذا هو الحال إذا لم تكن الثقافة البكتيرية نقية. يجب تجاهل هذا التسلسل (<فئة قوية = "xfig">الشكل 5ب).
2. قد ينشأ الرسم الكروماتوغرامي الغامض من وجود قمم ملونة مختلفة في نفس الموقع. أحد الأخطاء الأكثر شيوعا هو وجود قمتين ملوتين مختلفتين في نفس الموضع والتعيين غير الصحيح للقواعد بواسطة برنامج التسلسل (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 5ج). قم بتصحيح أي نيوكليوتيدات معينة بشكل غير صحيح يدويا وقم بتحريرها في الملف النصي.
3. يمكن أن تؤدي الكروماتوغرامات منخفضة الدقة إلى "قمم عريضة" غالبا ما تتسبب في خطأ في حساب النيوكليوتيدات في هذه المناطق (<فئة قوية = "xfig">الشكل 5د). يصعب تصحيح هذا الخطأ ، وبالتالي لا ينبغي التعامل مع حالات عدم التطابق المحتملة في خطوة المحاذاة الإضافية على أنها موثوقة.
4. ما ترى جودة قراءة الكروماتوگرام الرديئة ووجود قمم متعددة في نهايات 5 و 3 من التسلسل. تقوم بعض برامج التسلسل بإزالة هذه الأجزاء منخفضة الجودة تلقائيا (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 5E) ، ولا يتم تضمين النيوكليوتيدات في الملف النصي. إذا لم يتم اقتطاع التسلسل تلقائيا، فحدد الأجزاء منخفضة الجودة (مثل الإشارة الضعيفة، والقمم المتداخلة، وفقدان الدقة) في النهايات وقم بإزالة القواعد المعنية من الملف النصي.

الشكل 5: أمثلة على استكشاف أخطاء تسلسل الحمض النووي وإصلاحها. أ) مثال على تسلسل كروماتوجرام عالي الجودة (قمم متباعدة بشكل متساو لا لبس فيها). ب) تسلسل رديء الجودة يحدث عادة في بداية الكروماتوجرام. تعتبر منطقة المنطقة الرمادية منخفضة الجودة ويتم إزالتها تلقائيا بواسطة برنامج التسلسل. يمكن قص المزيد من القواعد يدويا. ج) وجود قمم مزدوجة (يشار إليها بالسهام). تمت قراءة النيوكليوتيدات التي يشار إليها بالسهم الأحمر بواسطة جهاز التسلسل على أنها "T" (ذروة حمراء) ، لكن الذروة الزرقاء أقوى ، ويمكن أيضا تفسيرها على أنها "C". د) تشير القمم المتداخلة إلى تلوث الحمض النووي (أي أكثر من قالب واحد). ه) فقدان الدقة وما يسمى ب "القمم العريضة" (المميزة بالمستطيل) التي تمنع استدعاء القاعدة الموثوق به. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كرر 3.1 و 3.2 للبرايمر العكسي.
أخيرا ، قم بتجميع التسلسلات الأمامية والخلفية في تسلسل واحد متجاور. ينتج عن تشغيل التسلسل الجيد تسلسل يصل إلى 1100 نقطة أساس. بالنظر إلى أن منتج PCR يبلغ ~ 1500 نقطة أساس ، يجب أن تتداخل التسلسلات التي تم الحصول عليها باستخدام البادئات الأمامية والخلفية جزئيا.
1. ادمج التسلسلين باستخدام برنامج تجميع تسلسل الحمض النووي ، على سبيل المثال أداة مجانية مثل CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15).
2. أدخل التسلسلين بتنسيق FASTA في المربع المشار إليه. انقر فوق الزر "إرسال" وانتظر حتى تعود النتائج.
3. لعرض التسلسل المجمع ، اضغط على "Contigs" في علامة تبويب النتائج. لعرض تفاصيل المحاذاة اضغط على "تفاصيل التجميع".
  ملاحظة 1: إذا تم استخدام برنامج CAP3 لتجميع contig ، فلا داعي لتحويل تسلسل التمهيدي العكسي إلى تكميلي عكسي. ومع ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى هذه الخطوة إذا تم استخدام برنامج آخر.
  الملاحظة 2: تنسيق FASTA هو تنسيق قائم على النص لتمثيل تسلسل النيوكليوتيدات. يبدأ السطر الأول (سطر الوصف) في ملف FASTA برمز ">" متبوعا بالاسم أو معرف فريد للتسلسل. بعد سطر الوصف يوجد تسلسل النيوكليوتيدات. الصق التسلسلات الخاصة بك بالتنسيق التالي:
  < / > >sequence_frw_primer< / > الصق التسلسل الخاص بك من الملف النصي هنا
  >sequence_rvs_primer
  الصق التسلسل الخاص بك من الملف النصي هنا
قم بإجراء بحث في قاعدة البيانات من خلال زيارة موقع الويب الخاص بأداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (BLAST؛ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
1. حدد أداة "Nucleotide BLAST" لمقارنة تسلسلك بقاعدة البيانات.
2. أدخل التسلسل الخاص بك (contig الذي تم تجميعه في 3.5) في مربع النص "تسلسل الاستعلام" ، ثم حدد قاعدة البيانات "16S rRNA sequences (Bacteria and Archea)" في قائمة التمرير لأسفل.
3. اضغط على زر "BLAST" في أسفل الصفحة. سيتم إرجاع التسلسلات الأكثر تشابها. يتم عرض مثال على نتيجة BLAST في الشكل 6. في التجربة المقدمة ، كانت النتيجة الأولى هي B. subtilis سلالة 168 ، تظهر هوية 100٪ مع التسلسل المتاح في قاعدة بيانات BLAST.
4. إذا كانت النتيجة العلوية لا تظهر هوية بنسبة 100٪ ، فانتقل إلى المحاذاة وتحقق من عدم التطابق. عند النقر فوق الضربة العلوية ، سيتم توجيهك إلى تفاصيل المحاذاة. سيتم ربط النيوكليوتيدات المحاذاة بخطوط عمودية قصيرة بينما تحتوي النيوكليوتيدات غير المتطابقة على فجوة بينها. ارجع إلى الكروماتوجرام الذي تلقيته من شركة التسلسل وقم بمراجعة التسلسل مرة أخرى مع التركيز على المنطقة غير المتطابقة. قم بتصحيح التسلسل إذا تم العثور على أي أخطاء إضافية. قم بتشغيل BLAST مرة أخرى باستخدام التسلسل المصحح.

< p class = "jove_content" >

الشكل 6: مثال على نتيجة انفجار النوكليوتيدات. 16S rRNA تسلسل الجين من الثقافة النقية ل B. subtilis 168 تم استخدامه كتسلسل استعلام. تظهر النتيجة العلوية هوية بنسبة 100٪ (تحتها خط) إلى B. subtilis السلالة 168 ، كما هو متوقع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المصدر: Ewa Bukowska-Faniband¹, Tilde Andersson¹, Rolf Lood¹
¹ قسم العلوم السريرية لوند، قسم طب العدوى، المركز الطبي الحيوي، جامعة لوند، 221 00 لوند،…

Browse More Videos

BLAST