What are the four phases of a bacterial growth curve?

A typical bacterial growth curve progresses through four distinct phases. Lag phase is when bacteria adjust to their environment before rapid growth begins. Exponential phase follows, characterized by rapid cell division and doubling. Stationary phase occurs when growth plateaus due to nutrient depletion. Finally, death phase involves cell lysis from severe nutrient limitation.

How do colony forming units differ from optical density measurements?

Colony forming units (CFUs) provide direct bacterial cell counts through serial dilution and plate counting, yielding precise CFU/mL values. Optical density measures light absorbance at 600 nanometers (OD600) using a spectrophotometer, offering instant results with fewer reagents. While OD600 is faster and more convenient, CFUs are more accurate, especially at higher cell densities.

Why is the 30-300 colony range important when counting plates?

The 30-300 colony range minimizes counting error when calculating CFU/mL. Plates with fewer than 30 colonies show high stochastic variation, leading to unreliable estimates. Plates exceeding 300 colonies suffer from crowding and overlapping, causing underestimation. Using plates within this optimal range ensures accurate bacterial enumeration for each time point.

What is doubling time and how is it calculated?

Doubling time is the fastest rate at which bacteria reproduce under specific growth conditions, measured during the exponential phase. To calculate it, identify two time points with the steepest slope, then compute the change in time and change in generations using the bacterial counts at each point. Dividing time change by generation change yields doubling time, allowing comparison of growth conditions.

How does a standard curve relate optical density to colony forming units?

A standard curve plots CFU/mL against OD600 on a linear scale for readings at or below 1.0 OD600. A linear regression equation (Y = MX + B) is generated, where M is the slope and B is the y-intercept. This relationship allows researchers to estimate CFU/mL from OD600 measurements in future experiments, saving time and materials while maintaining accuracy.

What preparation steps are necessary before measuring bacterial growth?

First, prepare LB broth and agar media in separate bottles, then sterilize in an autoclave at 121°C for 35 minutes. Cool agar to 50°C and pour into Petri dishes. Using pure cultures and streak plating isolation of single bacterial colonies, inoculate liquid media overnight at 37°C with shaking. Finally, inoculate a sterile flask with a 1:1000 volume of the overnight culture to begin growth curve measurements.

Why does the relationship between OD600 and CFU/mL deteriorate at higher optical densities?

The OD600-to-CFU relationship becomes less accurate above 1.0 OD600 because bacterial cells begin changing shape and accumulating extracellular products in the media. These changes influence light absorbance readings independently of actual cell count, causing the spectrophotometer measurement to diverge from true bacterial enumeration. This error becomes pronounced during stationary and death phases.

منحنيات النمو: توليد منحنيات النمو باستخدام وحدات تشكيل المستعمرات وقياسات الكثافة البصرية

0 مشاهدة12:15 دقيقة

1. الإعداد

المواد المختبرية المطلوبة: الوسائط السائلة ، وسائط أجار الصلبة ، قوارير إرلينماير ، أنابيب اختبار 15 مل ، محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، موزع الخلايا البكتيرية ، 70٪ إيثانول ، ومقياس الطيف الضوئي. يجب تعقيم جميع المحاليل والأواني الزجاجية قبل الاستخدام.
تحضير محطة العمل عن طريق التعقيم بنسبة 70٪ من الإيثانول. العمل بالقرب من موقد بنسن لمنع تلوث الوسائط.
عند العمل مع البكتيريا ، يجب استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة والتقنية المعقمة. مطلوب معطف مختبر وقفازات عند العمل مع الثقافات البكتيرية.
وصفات للمخازن المؤقتة والحلول والكواشف
1. ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (8).
2. مرق لوريا بيرتاني (LB) (9).

2. بروتوكول

إعداد وسائل الإعلام
1. حدد وسائط النمو التي يمكن من خلالها زراعة البكتيريا وإعداد كل من المرق السائل ووسائط الأجار الصلبة (1.5٪ وزن / حجم أجار) في زجاجات منفصلة قابلة للتعقيم. هنا ، تم تحضير مرق LB و LB أجار لنمو الإشريكية القولونية.
2. قم بتعقيم الوسائط بغطاء شبه مشدود في الأوتوكلاف المضبوط على 121 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة.
3. بالنسبة لوسائط أجار ، بعد التعقيم ، ضعها في حمام مائي مضبوطة على 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى تبرد. بمجرد أن تبرد ، اسكب وسائط أجار 20-25 مل في أطباق بتري دائرية مقاس 100 × 15 مم. اترك الأطباق تثبت لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
التحضير الأولي للبكتيريا
1. من المخزون المجمد ، قم بتجميع البكتيريا الخطية للعزل على أجار وسائط مختار للحصول على عزلات مستعمرة واحدة. احتضان في ظروف النمو المسموح بها للبكتيريا المختارة. هنا ، يتم وضع الإشريكية القولونية على أجار LB ويتم تحضينها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (16-18 ساعة).
2. باستخدام حلقة تلقيح معقمة ، حدد مستعمرة واحدة من لوحة الخط وتلقيح 4 مل من الوسائط السائلة في أنبوب اختبار سعة 15 مل وتنمو في الظروف المسموح بها للبكتيريا المختارة. هنا ، يزرع الإشريكية القولونية عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 210 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها (16-18 ساعة).
إعداد منحنى النمو
1. تحضير قارورة النمو
  1. الأوتوكلاف قوارير Erlenmeyer بحجم مناسب. عادة ، يتم استخدام نسبة 1: 5 من الوسائط إلى إجمالي حجم القارورة. هنا ، يتم استخدام وسائط 100 مل في قارورة سعة 500 مل.
  2. باستخدام ماصة مصلية ، انقل الوسائط المعقمة إلى قارورة Erlenmeyer.
2. إعداد سلسلة التخفيف
  1. تسمية أنابيب اختبار سعة 15 مل: -1 ، -2 ، -3 ، -4 ، -5 ، -6 ، -7 ، -8 ، و -9 ، توزيع 9 مل PBS في كل منها. تتوافق هذه الأرقام مع عامل التخفيف المستخدم لحساب CFU / mL. هناك حاجة إلى مجموعة جديدة من الأنابيب لكل نقطة زمنية للتجميع. (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2)
3. تحضير طبق أجار
  1. لوحات الملصقات مع وقت التجميع وعامل التخفيف. لكل نقطة زمنية سيكون هناك لوحة واحدة لكل تخفيف.
بروتوكول منحنى النمو
1. تطعيم وسائل الإعلام
  1. باستخدام المزرعة السائلة الليلية المحضرة كجزء من الخطوة 2.2.2 ، قم بتلقيح وسائط القارورة بحجم 1: 1000 من المزرعة. هنا ، تتم إضافة 100 ميكرولتر من المزرعة السائلة بين عشية وضحاها إلى 100 مل من وسائط LB.
  2. قم بتدوير الوسائط لتوزيع البكتيريا بالتساوي.
2. مجموعة النقاط الزمنية
  1. إعداد حالة النمو
    1. ضع قارورة في ظروف النمو التجريبية المختارة للبكتيريا المحددة. يجب أن تؤخذ النقاط الزمنية بشكل متكرر للبكتيريا سريعة النمو ويمكن أخذها على فترات أطول للبكتيريا بطيئة النمو. هنا ، يزرع الإشريكية القولونية عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز بمعدل 210 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) ونقاط زمنية تؤخذ كل 1 ساعة.
  2. قياس الكثافة البصرية (OD600)
    1. في كل نقطة زمنية ، بما في ذلك النقطة الزمنية للبداية (t = 0) ، اسحب 1 مل من الثقافة البكتيرية واستغني عنها في كوفيت مقياس الطيف الضوئي.
    2. امسح الكوفيت نظيفا وسجل الكثافة البصرية بطول موجي 600 نانومتر. إذا كانت قراءة الكثافة البصرية أكبر من 1.0، فقم بتخفيف 100 ميكرولتر من الثقافة 1:10 باستخدام وسائط جديدة سعة 900 ميكرولتر، وسجل الكثافة البصرية، واضرب هذه القيمة في 10 لقياس OD600.
  3. قياس وحدة تشكيل المستعمرة (CFU / mL)
    1. في كل نقطة زمنية ، اسحب 1 مل من الثقافة البكتيرية واستغني عنها في أنبوب الاختبار الزجاجي -1 الذي يحتوي على 9 مل من PBS.
    2. بالنسبة لسلسلة التخفيف ، قم بنقل 1 مل بشكل متسلسل من الأنبوب -1 إلى أسفل جميع أنابيب التخفيف إلى -9 ، مع الدوامة بعد كل نقل. (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2)
    3. لكل تخفيف ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية على لوحة أجار الوسائط الصلبة المسماة في المقابل. (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2)
    4. باستخدام مفرشة الخلايا التي تم تعقيمها بالإيثانول ، وتمريرها عبر لهب موقد بنسن ، وتبريدها عن طريق لمس سطح الأجار ، انشر 100 ميكرولتر من تعليق الخلية حتى يجف سطح صفيحة الأجار.
    5. احتضان الصفائح المنتشرة رأسا على عقب عند درجة حرارة تدعم نمو البكتيريا. هنا ، يتم تحضين الإشريكية القولونية عند 37 درجة مئوية.
    6. بعد الحضانة ، بمجرد ظهور المستعمرات المرئية ، احسب عدد المستعمرات البكتيرية على كل لوحة وسجل هذه القيم جنبا إلى جنب مع عامل التخفيف المرتبط بها لجميع الألواح في كل نقطة زمنية.

< p class = "jove_title" >3. تحليل البيانات والنتائج

الكثافة البصرية (OD600) مخطط منحنى النمو
1. ارسم الكثافة الضوئية (OD600) مقابل الوقت على مقياس شبه لوغاريتم. (<فئة قوية = "xfig">الشكل 3)
وحدة تشكيل المستعمرة (CFU / mL) مؤامرة منحنى النمو
1. لكل نقطة زمنية ، اختر لوحة التخفيف حيث يقع عدد المستعمرات في حدود 30-300 بكتيريا. اضرب رقم عدد المستعمرات في عامل التخفيف ثم في 10 حيث يعتبر انتشار 100 ميكرولتر تخفيفا إضافيا بنسبة 1:10 عند حساب CFU / mL.
2. ارسم وحدات تشكيل المستعمرة مقابل الوقت على مقياس شبه لوغاريتمي. (<فئة قوية = "xfig">الشكل 4)
ربط الكثافة البصرية ووحدات تشكيل المستعمرة
1. ارسم وحدات تشكيل المستعمرة مقابل الكثافة الضوئية على مقياس خطي لقراءات OD600 أقل من أو تساوي 1.0 OD600 لأن العلاقة بين OD600 و CFU / mL أقل دقة بعد 1.0 OD600. هنا ، يتم رسم النقاط الزمنية الست الأولى. (<فئة قوية = "xfig">الشكل 5)
2. قم بإنشاء خط اتجاه انحدار خطي يعرض المعادلة وقيمة R².
تحديد وقت مضاعفة البكتيريا
1. باستخدام مخطط منحنى نمو وحدة تشكيل المستعمرة ، خلال المرحلة الأسية ، حدد نقطتين على الرسم البياني مع المنحدر الأكثر حدة بينهما لحساب وقت المضاعفة.
2. حساب وقت المضاعفة
  2. ΔTime = t₂ - t₁ ، حيث t₁ = النقطة الزمنية 1 و t₂ = النقطة الزمنية 2
  3. ، حيث b = عدد البكتيريا في t₂ ، B = عدد البكتيريا في t₁ ، و n = عدد الأجيال. مشتق من: .
  4. احسب وقت المضاعفة باستخدام:

المصدر: Andrew J. Van Alst¹ و Rhiannon M. LeVeque¹ و Natalia Martin¹ و Victor J. DiRita¹
¹ قسم علم الأحياء الدقيقة وعلم الوراثة الجزيئية، جامعة ولاية…