What is the minimum inhibitory concentration (MIC) and how is it determined?

The minimum inhibitory concentration (MIC) is the lowest antibiotic concentration at which bacteria can no longer survive or multiply. It is determined by observing where bacterial growth stops in response to increasing antibiotic concentrations. In an E-test, the MIC value is read at the point where the growth inhibition zone intersects the antibiotic strip. In broth dilution methods, MIC is identified as the lowest antibiotic concentration showing no visible bacterial growth or turbidity.

How does the Epsilometer test (E-test) measure antibiotic susceptibility?

The E-test uses a plastic strip impregnated with a predefined gradient of antibiotic applied to a Mueller-Hinton agar plate inoculated with bacteria. The antibiotic diffuses into the agar, and susceptible bacteria cannot multiply, forming a clear growth inhibition zone around the strip. The MIC value is determined by reading the numerical scale on the strip at the point where bacterial growth intersects the strip edge.

What is antibiotic synergy and how is it evaluated?

Antibiotic synergy occurs when the combined effect of two antibiotics is greater than the sum of their individual activities. Synergy is evaluated by calculating the fractional inhibitory concentration (FIC) index, which sums the ratio of each antibiotic's MIC in combination to its individual MIC. An FIC index less than 0.5 indicates significant synergy between the two antibiotics.

What is the difference between cross and non-cross E-test methods for synergy testing?

In the non-cross test, E-strips are applied sequentially to the same plate location after the first strip is removed, requiring two plates and more time. In the cross test, both E-strips are placed simultaneously at a 90-degree angle on a single plate, making it faster and requiring fewer materials. Both methods determine MIC values in combination and calculate the FIC index to assess synergy.

How does the broth micro dilution method determine MIC values?

The broth micro dilution method creates two-fold serial antibiotic dilutions in a 96-well microtiter plate containing bacteria in growth medium. After incubation, the MIC is identified as the well with the lowest antibiotic concentration showing no visible bacterial growth or turbidity. This quantitative method offers flexibility in choosing specific antibiotic concentrations and can be applied to multiple bacterial species.

Why is preparing a standardized bacterial suspension important for antibiotic susceptibility testing?

A standardized bacterial suspension ensures consistent and comparable results across tests. The suspension is prepared by matching its turbidity to a McFarland 0.5 standard, which establishes a uniform bacterial concentration. This standardization is critical because varying bacterial concentrations would produce inconsistent growth inhibition zones and unreliable MIC values.

What does an FIC index greater than 0.5 indicate about antibiotic combinations?

An FIC index greater than 0.5 indicates that the two antibiotics do not act synergistically against the tested bacterial strain. Instead, their combined effect is either additive, meaning the joint effect equals the sum of individual activities, or potentially antagonistic. This result suggests that combination therapy may not provide enhanced efficacy compared to single antibiotic treatment.

اختبار الحساسية للمضادات الحيوية: اختبارات مقياس الحدة الحيوية لتحديد قيم الميكروفون لاثنين من المضادات الحيوية وتقييم تآزر المضادات الحيوية

0 مشاهدة13:39 دقيقة

p class = "jove_title" >1. اختبارات مقياس الضغط (الاختبارات الإلكترونية)

الإعداد
1. ارتد قفازات ومعطف مختبر
2. جهز مساحة العمل عن طريق تعقيمها باستخدام 70٪ من الإيثانول
3. اجمع لوحات أجار مولر-هينتون (لوحات MHA)
إعداد معيار تعكر ماكفارلاند رقم 0.5
1. تحضير محلول 1٪ من كلوريد الباريوم (BaCl₂):
  أضف 1 جرام من كلوريد الباريوم اللامائي (BaCl₂) في 100 مل من الماء المقطر. دوامة جيدا.
2. تحضير محلول 1٪ من حامض الكبريتيك (H₂SO₄):
  أضف 1 مل من H₂SO₄ المركز في 99 مل من الماء المقطر. دوامة جيدا.
3. قم بإعداد معيار تعكر McFarland رقم 0.5:
  محلول 50 ميكرولتر BaCl₂ في 5 مل من محلول 1٪ H₂SO₄. دوامة الحل جيدا للحصول على تعليق عكر.
4. احتفظ بمعيار تعكر ماكفارلاند رقم 0.5 في أنبوب مغطى بورق الألمنيوم. يحفظ في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة أقصاها 6 أشهر. دوامة جيدا إلى محلول متجانس قبل الاستخدام.
تحضير لوحات MHA
1. اكشط بكتيريا المجموعة G من المكورات العقدية من صفيحة أجار الدم باستخدام حلقة معقمة. تخلط في 1 مل من المحلول الملحي ، ودوامة لتعليق البكتيريا.
2. قارن التعليق بمعيار ماكفارلاند رقم 0.5 لتحقيق نفس التعكر من أجل الحصول على نفس حجم اللقاح أثناء التجارب. اضبط التركيز باستخدام محلول ملحي إضافي أو بكتيريا.
3. بتلقيح ألواح MHA باستخدام قضيب قطني معقم. امسح الطبق برفق لتغطية السطح. تابع إحدى الطرق الثلاث الموضحة أدناه (1.4-1.6).
اختبار مقاومة المضادات الحيوية الفردية. مجموعة المكورات العقدية G ، مقاومة البنسلين G أو الجنتاميسين
1. ضع شريط اختبار إلكتروني (إما البنسلين G أو الجنتامين) في وسط لوحة MHA (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1 أ ، ب).
2. احتضان لمدة 18-20 ساعة ، 37 درجة مئوية.
3. اقرأ النتائج. يتم قياس MIC على أنه منطقة التثبيط التي تتقاطع مع شريط اختبار المضادات الحيوية المتدرج (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1 C ، D).

< p class = "jove_content" >

الشكل 1: اختبار إلكتروني واحد. وضع شريط اختبار إلكتروني من أ) البنسلين G و B) gentamicin على صفيحة أجار مولر هينتون المغطاة بمستعمرات بكتيرية من المكورات العقدية من المجموعة G قبل (A و B) وبعد (C و D) حضانة ليلية عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اختبار التآزر النهج المتقاطع. مجموعة المكورات العقدية G ، مقاومة البنسلين G والجنتاميسين.
1. ضع شريطي اختبار إلكتروني مع مضادات حيوية مختلفة (مثل البنسلين G والجنتاميسين) على صفيحة MHA الملقحة في تشكيل متقاطع.
  1. للحصول على أدق النتائج ، استهدف وضع الصليب بزاوية 90 درجة تقريبا عند التقاطع بين المقاييس عند قيم MIC الخاصة بها ، والتي تم تحديدها مسبقا في اختبار مقاومة المضادات الحيوية الفردي (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2 أ).
  2. لاحظ أنه بمجرد وضع الشرائط على لوحة أجار ، لا ينبغي تحريكها ، لأن بعض المضادات الحيوية قد تكون قد امتصتها اللوحة بالفعل. لذلك ، من الأنسب الحفاظ على الشرائط بزاوية خاطئة قليلا (على سبيل المثال 85 درجة) وما يصل إلى 1-2 مم من قيمة MIC الفعلية. ينصح بإجراء التجربة ثلاث نسخ لتقليل هذه المشكلة.
2. احتضان لمدة 18-20 ساعة ، 37 درجة مئوية.
3. اقرأ النتائج. يتم قياس MIC على أنه منطقة التثبيط التي تتقاطع مع شريط اختبار المضادات الحيوية المتدرج على كل شريط اختبار إلكتروني (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2 ب).
4. استخدم صيغة التركيز المثبط الجزئي (FIC) (المعادلة 1) لتحديد التآزر.

الشكل 2: كشف التآزر - اختبار متقاطع. نتائج اختبار التآزر المضاد للميكروبات للميكروبات MIC للبنسلين G والجنتاميسين على المكورات العقدية المجموعة G قبل (A) وبعد (B) الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية 5٪ CO₂. تتشكل زاوية 90 درجة بين قيمتي MIC الفرديتين (البنسلين G: 0.094 ميكروغرام / مل ، الجنتاميسين: 8 ميكروغرام / مل). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اختبار التآزر نهج غير متقاطع. مجموعة العقدية G ، مقاومة البنسلين G والجنتاميسين.
1. ضع شريط الاختبار الإلكتروني في وسط لوحة MHA (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 3 أ ، د).
2. حدد مكان وجود قيمة MIC المحددة مسبقا على كل شريط.
3. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. تخلص من شريط الاختبار الإلكتروني لكل لوحة MHA (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 3 ب ، ه).
5. ضع شريط الاختبار الإلكتروني الثاني (الذي يحتوي على مضاد حيوي مختلف) على منطقة الشريط الذي تمت إزالته مسبقا على التوالي بحيث تتوافق قيم الميكروفون الخاصة به مع العلامة ومحاذاة.
6. احتضان لمدة 18-20 ساعة ، 37 درجة مئوية.
7. اقرأ النتائج. يتم قياس MIC على أنه منطقة التثبيط التي تتقاطع مع شريط اختبار المضادات الحيوية المتدرج على كل شريط اختبار إلكتروني (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 3 C ، F).
8. من أجل تحديد التآزر ، يتم استخدام صيغة التركيز المثبط الجزئي (FIC) (المعادلة 1).

الشكل 3: كشف التآزر - اختبار غير متقاطع. نتائج اختبار التآزر المضاد للميكروبات لميكروفون البنسلين G والجنتاميسين على مجموعة المكورات العقدية G. A) شريط الجنتاميسين (8 ميكروغرام / مل متمركزة) فوق بكتيريا المكورات العقدية من المجموعة G ، ب) إزالة شريط الجنتاميسين ، ج) شريط جنتاميسين / بنسلين G المركب (0.094 ميكروغرام / مل في المركز) فوق بكتيريا المكورات العقدية من المجموعة G ، د) شريط البنسلين G (0.094 ميكروغرام / مل متمركز) ، ه) إزالة شريط البنسلين G ، F) شريط البنسلين G / الجنتاميسين المركب (8 ميكروغرام / مل في المركز) فوق بكتيريا المكورات العقدية من المجموعة G. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

< p class = "jove_title" >2. اختبار المرق

الإعداد
1. ارتد قفازات ومعطف مختبر
2. جهز مساحة العمل عن طريق تعقيمها باستخدام 70٪ من الإيثانول
3. اجمع 15 مل من مرق MH مع 50٪ دم حصان متحلل و 20 مجم / مل β-NAD (MH-F)
(اختياري) إجراء اختبار إلكتروني [البروتوكول 1] لتحديد الميكروفون على الوسط الصلب
1. على الرغم من كونها اختيارية ، إلا أن هذه المعرفة ستسمح بتصميم تجريبي أفضل (على سبيل المثال ، يمكن تصميم تركيزات المضادات الحيوية المضافة لإحاطة قيمة الميكروفون المحددة من اللوحة) ، مما يحسن فرص نجاح التجربة.
تحضير لقاح بكتيري. كما هو مذكور أعلاه ، يمكن تقدير تركيز البكتيريا من خلال قياسات OD نانومتر أو معايير تعكر ماكفارلاند
1. طريقة OD600 نانومتر
  1. الحصول على معلق بكتيري بتركيز بكتيري ثابت
  2. قم بتخفيف المزرعة في مرق MH-F لتحقيق OD600 من 0.003
2. طريقة تعكر ماكفارلاند
  1. ضع 15 مل من مرق MH-F في أنبوب معقم.
  2. تلقيح مرق MH-F بالبكتيريا (من طبق) إلى مستوى ماكفارلاند. دوامة الحل بقوة. صب المحلول في طبق بتري معقم.
تحضير المضادات الحيوية
1. تحديد تركيز المضادات الحيوية المطلوبة
  1. تحديد قيمة MIC من الاختبار الإلكتروني (على سبيل المثال 0.125 ميكروغرام/مل للبنسلين G و 8 ميكروغرام/مل للجنتاميسين)
  2. اضرب قيمة MIC للوحة أجار في 2^4-2 ⁷ ، أي ما يعادل أربعة إلى سبعة تخفيفات تسلسلية 2x. سيكون هذا هو التركيز الأولي للمضادات الحيوية. (على سبيل المثال، بالنسبة للبنسلين G، سبعة تخفيفات تسلسلية 2x: 0.125 ميكروغرام/مل × 2⁷ = 16 ميكروغرام/مل؛ بالنسبة للجنتاميسين، أربعة تخفيفات تسلسلية 2x 8 ميكروغرام/مل × 2⁴ = 128 ميكروغرام/مل
  3. اضرب قيمة البداية المطلوبة 100x من أجل تحديد تركيز مخزون من المضادات الحيوية (على سبيل المثال مخزون 1.6 مجم / مل بنسلين G و 12.8 مجم / مل جنتاميسين)
2. قم بإعداد تركيز مخزون المضادات الحيوية 100x وفقا لذلك
  1. قم بإذابة المضادات الحيوية في 10 مل من الماء المعقم ، والدوامة لتوليد محلول مخزون (على سبيل المثال 16 مجم بنسلين G و 128 مجم جنتاميسين لإنشاء المخزونات المذكورة أعلاه)
أضف البكتيريا إلى آبار الصفيحة الدقيقة
1. Aliquot 200 ميكرولتر مرق MH-F يحتوي على لقاح البكتيريا في الآبار في الصفوف الثلاثة الأولى من صفيحة ميكروتيتر 96 بئرا لتجربة في ثلاث نسخ.
أضف المضادات الحيوية إلى آبار الصفيحة الدقيقة
1. أضف 200 ميكرولتر مرق MH-F إضافي مع البكتيريا إلى العمود الأول من الآبار (A1 ، B1 ، C1) ليصل الحجم الإجمالي إلى 400 ميكرولتر.
2. أضف 4 ميكرولتر من تركيز مخزون المضادات الحيوية إلى العمود الأول من الآبار. نظرا لأن العينة تحتوي على 400 ميكرولتر ، فسيؤدي ذلك إلى تخفيف المضادات الحيوية بمقدار 100 مرة.
3. قم بإنشاء تخفيف تسلسلي 2x عن طريق نقل 200 ميكرولتر من البكتيريا / المضادات الحيوية من A1 إلى A2 ، وصولا إلى A11. Pipet بقوة بين التخفيفات. كرر الخطوة لصفوف إضافية.
4. قم بإزالة 200 ميكرولتر من العمود 11 بحيث يكون الحجم النهائي في جميع الآبار 200 ميكرولتر.
5. اترك العمود الأخير (A12 ، B12 ، C12) بدون مضادات حيوية ، كضوابط.
تحديد قيم الميكروفون
1. احتضن صفيحة الميكروتيتر المكونة من 96 بئرا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز.
2. يتم تعريف قيمة MIC على أنها آخر بئر في سلسلة التخفيف التي لا تظهر أي نمو مرئي للبكتيريا (<فئة قوية = "xfig">الشكل 4). ومع ذلك ، لا يمكن الوثوق بهذه القيمة إلا إذا كان حجم اللقاح الأصلي صحيحا.

< p class = "jove_content" >

الشكل 4: تحديد الميكروفون عن طريق تخفيف المرق. يعرف MIC هنا بأنه آخر بئر يظهر صفاء (لا يوجد نمو للبكتيريا) قبل أن يغير العكارة. الصف عبارة عن نسخ مكررة من قيمة MIC للبنسلين G والصف عبارة عن نسخ مكررة من قيمة MIC للجنتاميسين ، كلاهما مقابل عزلة من مجموعة المكورات العقدية G. A) النتيجة التجريبية الفعلية ، B) التفسير التخطيطي للقيم من A (رمادي = لا نمو ؛ أبيض = نمو). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: إجراء تخطيطي لسلسلة التخفيف لحساب تركيز البكتيريا الأصلي. تم إجراء التخفيفات كما هو موضح (20 ميكرولتر مخفف في 180 ميكرولتر لسلسلة تخفيف 10x) ، ثم يتم طلاء 10 ميكرولتر من الصفوف A-H على لوحين منفصلين من أجار الدم كما هو موضح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحديد حجم اللقاح الأصلي
ملاحظه: فحوصات المرق الدقيقة حساسة للغاية لحجم اللقاح الأصلي المستخدم. سيعطي حجم اللقاح المفرط نتيجة إيجابية خاطئة ، لأن المضادات الحيوية المضافة لن تكون قادرة على تثبيط النمو بعد الآن بهذه النسبة. لذلك ، من الأهمية بمكان التحقق من كمية البكتيريا التي تمت إضافتها إلى الآبار الصغيرة. في حين أن البيانات لن تكون متاحة في نقطة التجربة (بسبب الحاجة إلى حضانة لمدة 24 ساعة) ، إلا أنها ستكون بمثابة عنصر تحكم. إذا كان عدد البكتيريا المضافة ضمن نطاق التركيز المحدد ، فيمكن الوثوق بقيم الميكروفون. إذا كان اللقاح مرتفعا جدا أو منخفضا جدا ، فيجب تكرار التجربة.
1. تمييع البكتيريا بشكل متسلسل
  1. قم بإعداد صفيحة ميكروتيتر سعة 96 بئرا لتخفيف التركيز البكتيري الأصلي لتحديد حجم اللقاح. الأمثل هو حجم 200 ميكرولتر مع 10^5-6 بكتيريا. لإجراء التخفيفات ، قم أولا بنقل 180 ميكرولتر من PBS المعقم لكل بئر في B-H (في ثلاث نسخ 1-3).
  2. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من المحلول البكتيري إلى A (في ثلاث نسخ 1-3).
  3. قم بتوليد تخفيف تسلسلي 10x (في ثلاث نسخ) عن طريق نقل 20 ميكرولتر من البكتيريا من A إلى B ، مع ماصة بقوة. كرر الخطوات الخاصة ب C-H.
2. قم بوضع التخفيفات البكتيرية لتحديد حجم اللقاح
  1. ضع علامة على لوحات أجار الدم وفقا ل <فئة قوية = "xfig"> الشكل 5.
  2. انقل 10 ميكرولتر من التخفيف التسلسلي إلى اللوحة وفقا ل <الفئة القوية = "xfig">الشكل 5.
  3. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 20-24 ساعة.
3. تحديد حجم اللقاح البكتيري
  1. احسب الأعداد البكتيرية في البقع داخل 5-50 مستعمرة (<فئة قوية = "xfig">الشكل 6).
  2. احسب حجم اللقاح الأولي عن طريق حساب متوسط العينات الثلاثية ، واضرب في عامل التخفيف (على سبيل المثال 10x للعينات B ، و 100x للعينات C ، و 1000x للعينات D ، وما إلى ذلك) ثم بمقدار 100 للتعويض عن حجم الاكتشاف البالغ 10 ميكرولتر ، مما ينتج عنه حجم اللقاح في cfu / mL. إذا كان اللقاح في حدود 10^5-6 cfu / mL ، فيمكن الوثوق ببيانات الميكروفون.

< p class = "jove_content" >

الشكل 6: تحديد حجم اللقاح. تم تحضين البكتيريا الملقحة وفقا للشكل 5 لمدة 20-24 ساعة عند 37 درجة مئوية ثم تم عدها. يحتوي الصف D على عدد لا بأس به من المستعمرات التي يجب عدها (على سبيل المثال 5-50). العينات في A غير مخففة ، B مخففة 10x ، C مخفف 100x ، D مخفف 1000x ، ويتم طلاء 10 ميكرولتر فقط في كل بقعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.