What are bacteriophages and how do they infect bacterial cells?

Bacteriophages, or phages, are viruses that specifically infect bacteria. They attach to the bacterial cell wall and inject their genetic material into the host. The phage then hijacks the cell's biosynthetic machinery to replicate its DNA and produce numerous progeny phage particles, which are released by lysing and killing the host cell.

Why is the plaque assay considered a reliable method for determining viral titer?

The plaque assay remains one of the most reliable methods for determining viral titer because it directly visualizes the lytic activity of phages. Each plaque represents a single infective phage particle that has infected and lysed multiple neighboring bacterial cells, creating a clear, countable zone. This amplification of lytic activity enables accurate enumeration of phage particles in a sample.

What is the purpose of using bacteria in log-phase growth for the plaque assay?

Bacteria in log-phase growth are actively dividing and have the highest viability, ensuring that a large percentage of cells are capable of forming a dense, confluent lawn on the agar plate. This dense bacterial lawn is essential for the plaque assay because it provides abundant host cells for phage infection and allows clear visualization of plaques as transparent zones against the turbid bacterial background.

How does the double agar layer technique work in a plaque assay?

The double agar layer technique uses a solid, concentrated bottom agar layer and a soft, low-concentration top agar layer containing bacteria and phage. The soft overlay allows phage particles to move locally and infect neighboring cells while restricting their movement to distant areas. This creates localized zones of cell lysis, producing visible plaques that can be counted to determine phage concentration.

Why are serial dilutions necessary before performing a plaque assay?

Phage titers vary exponentially across different samples and types, so serial dilutions generate a wide range of phage concentrations to ensure countable plaque numbers. Performing dilutions in triplicate provides statistically significant and accurate data. An ideal plaque count ranges from 10 to 150 plaques per plate, making dilutions essential for obtaining reliable results.

What does PFU stand for and how is it calculated from plaque counts?

PFU stands for Plaque-Forming Units, representing the number of infective phage particles in a sample. To calculate PFU per milliliter, divide the mean plaque count by the dilution factor, then multiply by 10 to account for the additional dilution from using only 100 microliters of phage mixture during overlay preparation. The final average PFU per milliliter corresponds to the number of infective phage particles in the original sample.

How can the plaque assay be used beyond viral enumeration?

Beyond quantifying phage titer, the plaque assay can characterize plaque morphology to aid in identification of different phage types and isolate phage mutants. Additionally, the resistance or sensitivity of bacterial strains to specific phages can be used for phage typing, dividing bacterial species into subgroups based on their susceptibility to different bacteriophages.

فحص البلاك: طريقة لتحديد العيار الفيروسي كوحدات تشكيل البلاك (PFU)

0 مشاهدة13:00 دقيقة

1. الإعداد

قبل البدء في أي عمل يتضمن ميكروبات ، تأكد من تعقيم مساحة العمل (على سبيل المثال ، مسحها بنسبة 70٪ من الإيثانول). ارتد دائما معطف المختبر والقفازات ، وحافظ على الشعر الطويل مربوطا للخلف ، وتأكد من حماية أي جروح بشكل جيد.
عند الانتهاء ، قم بتعقيم جميع الأسطح وغسل / تعقيم اليدين والمعصمين جيدا.

2. بروتوكول

إعداد LB Media
ملاحظه: اعتمادا على السلالة البكتيرية المضيفة والعاثية ، قد يكون وسط سائل مختلف أكثر ملاءمة للزراعة الأولية للسلالة البكتيرية المضيفة أو قد يكون وسط صلب مختلف أكثر ملاءمة للنمو اللاحق. يستخدم مرق Lysogeny (LB) في هذا البروتوكول للمرق والأجار.
1. امزج 4 جم رطل في 200 مل من الماء المقطر ، في ثلاث نسخ ، لمرق LB ، وأجار القاع الصلب ، والأجار العلوي الناعم. يجب تحضير جميع المحاليل في حاويات قادرة على استيعاب ضعف الحجم النهائي لمنع الفائض أثناء التعقيم.
  ملاحظه: في حالة إجراء الاختبار بثلاث نسخ ، قم بإعداد ضعف كمية أجار القاع LB.
2. اضبط الرقم الهيدروجيني لجميع المحاليل الثلاثة على 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك حسب الاقتضاء.
3. أضف 3 جم من قوة الأجار إلى زجاجة الأجار السفلية لعمل محلول أجار بنسبة 1.5٪ للأجار
4. أضف 1.2 جم من قوة الأجار إلى زجاجة الأجار العلوية لعمل محلول أجار 0.6٪ للأجار الناعم.
5. ضع الزجاجات ، بأغطية شبه مشدودة ، في الأوتوكلاف المضبوطة على 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتعقيم المحاليل. أغلق الأغطية بمجرد انتهاء التشغيل لمنع التلوث.
6. عندما تصل درجة حرارة وسائط LB إلى حوالي 45-50 درجة مئوية ، أضف 450 ميكرولتر من 1 M CaCl₂ المعقم إلى جميع المحاليل الثلاثة 200 مل LB لعمل تركيز نهائي يبلغ 2.25 مليمتر.
7. صب 15 مل من وسط الأجار الصلب في أطباق بتري المعقمة (تجنب الاهتزاز لمنع الرغوة) واترك الأجار يتصلب لبضع ساعات أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 4أ). يمكن تخزين الألواح رأسا على عقب عند 4 درجات مئوية لعدة أيام.
زراعة الخلايا المضيفة
1. قبل يوم واحد من الفحص ، أضف 10 ميكرولتر من ثقافة الإشريكية القولونية إلى 10 مل من مرق LB.
2. احتضان البكتيريا عند 37 درجة مئوية طوال الليل عند 160 دورة في الدقيقة في حاضنة اهتزازية.
3. في صباح يوم الفحص ، أضف 0.5 مل من المزرعة الليلية إلى 10 مل من LB.
  ملاحظه: إذا كنت تقوم بإجراء الاختبار بثلاث نسخ ، فقم بإعداد ضعف كمية هذه الثقافة.
4. احتضان عند 37 درجة مئوية عند 160 دورة في الدقيقة في حاضنة اهتزاز حتى تصبح الثقافة البكتيرية في مرحلة نمو اللوغاريتم. يمكن تحديد ذلك من الناحية الطيفية الضوئية بواسطة OD600 من 0.5-0.7.
5. احتفظ بالثقافة في درجة حرارة الغرفة حتى تتم إضافة البكتيريا إلى أجار LB العلوي.
10 أضعاف التخفيف التسلسلي للجراثيم
1. أضف 180 ميكرولتر من مرق LB إلى سبعة آبار في الصف الأول من الصف إلى 96 بئر
  ملاحظه: يقترح إجراء التخفيف بثلاث نسخ من أجل زيادة موثوقيته الإحصائية. للقيام بذلك ، قم بإعداد تخفيفات إضافية للعاثية في الصفين الثاني والثالث من اللوحة.
2. قم بتدوير عينة العاثية الأصلية بعناية لضمان التجانس ونقل 20 ميكرولتر إلى البئر الأول.
3. امزج العينة جيدا عن طريق سحب العينة وأسفلها.
4. انقل 20 ميكرولتر من التعليق الناتج إلى البئر الثاني.
5. استمر في التخفيف التسلسلي عن طريق نقل 20 ميكرولتر من المحلول في البئر الثاني إلى البئر الثالث ، وهكذا ، حتى البئر السادس ، تاركا البئر السابع كعنصر تحكم سلبي لن يضاف إليه تعليق العاثية. سيؤدي ذلك إلى إنشاء نطاق تخفيف 10-1-10-6.
تصفيح
1. قم بتسمية قاعدة أطباق بتري (المعدة مسبقا في الخطوة 2.1.7) بالاسم والتاريخ ووصف قصير للعينة (بما في ذلك عامل تخفيف عينة العاثية). سخني أطباق بتري مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية قبل ساعة واحدة من الفحص.
2. قم بإذابة وسط أجار الناعم المتصلب (عادة باستخدام الميكروويف ؛ يذوب الأجار المتصلب عند 85 درجة مئوية) ، واتركه يصل إلى حوالي 45 درجة مئوية. يمكن وضع الوسائط الساخنة في حمام مائي 45 درجة مئوية لمدة ~ 1 ساعة للوصول إلى درجة حرارة مناسبة. يجب أن يكون ساخنا بدرجة كافية ليبقى في شكل سائل ، ولكن باردا بدرجة كافية حتى لا يقتل البكتيريا المضافة.
3. امزج 4 مل من المزرعة البكتيرية (من الخطوة 2.2) مع 35 مل من الأجار الناعم (عند 45 درجة مئوية). قم بالتدوير لتوزيع الخلايا بالتساوي مع تجنب الاهتزاز لمنع الرغوة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 4أ).
4. قم بتسمية أنبوب اختبار معقم واحد لكل خطوة من خطوات التخفيف التسلسلي وواحد لعينة التحكم ، ليصبح المجموع 7 أنابيب اختبار مصنفة. ضع 5 مل من خليط المزرعة البكتيرية / خليط الأجار الناعم من الخطوة 2.4.3 في الأنابيب ال 7. اعمل بسرعة من خلال الخطوة 2.4.6 لأن هذه الأحجام الصغيرة من الوسائط القائمة على أجار ستتصلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة.
5. أضف 100 ميكرولتر من عينة التحكم (من الخطوة 2.3) إلى أنبوب اختبار التحكم وقم بتحريكه بعناية. تخلص من طرف الماصة المستخدم وانقل نفس الحجم من كل عينة من عينات العاثيات المخففة بشكل متسلسل (الخطوة 2.3) إلى أنابيب الاختبار الخاصة بها، مع التدوير للخلط.
6. انقل مخاليط 5 مل على الفور إلى ألواح الأجار الصلبة الملصقة والمسخنة مسبقا (<فئة قوية = "xfig">الشكل 4أ). حرك الأطباق برفق لتوزيع الخلطات بشكل متساو.
  ملاحظه: إذا كنت تقوم بإجراء الاختبار ثلاث نسخ ، فكرر الخطوات 2.4.3-6 مرتين أخريين.
7. أغلق كل لوحة بغشاء مختبري ، واترك كلتا الطبقتين تتصلب بشكل صحيح في درجة حرارة الغرفة (حوالي 15 دقيقة) قبل وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية ، مما يحفز نمو كل من البكتيريا والعاثية ، لمدة 24 ساعة أو حتى تتطور اللويحات ، وعادة ما يستغرق ظهور اللويحات حوالي 1-5 أيام (<فئة قوية = "xfig">الشكل 4ب) ، لكن التوقيت يختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على ظروف الحضانة والوسط والأنواع البكتيرية.

< p class = "jove_title" >3. تحليل البيانات والنتائج

عد اللوحات
1. تأكد من عدم ظهور أي لويحات في اللوحات التي تحمل علامة "تحكم" ، لأن هذا يشير إلى التلوث الفيروسي.
2. ابدأ باللوحات المسماة ^10-6 ، والتي تحتوي على عينة العاثيات المخففة. عد اللوحات دون إزالة الغطاء ، وقم بتمييزها بقلم كما تذهب للإشارة إلى اللوحات التي تم عدها بالفعل.
3. عد اللوحات المتبقية. قد تحتوي بعض اللوحات على عدد قليل جدا أو عدد كبير جدا من اللويحات التي لا يمكن عدها. استخدم اللوحات التي تحتوي على 10-150 لوحة لمزيد من التحليل.
حساب PFU
1. اقسم عدد اللويحات على عامل التخفيف ، (على سبيل المثال 10-6 للعينة المخففة) للحصول على عدد وحدات تشكيل البلاك (PFU) في 100 ميكرولتر من خليط العاثية.
  ملاحظه: في حالة إجراء الاختبار بثلاث نسخ ، استخدم متوسط عدد اللويحات من اللوحات الثلاثة.
2. لتحديد تركيز العينة الأصلية (في PFU / مل) ، اضرب في عامل تخفيف إضافي قدره 10 ، حيث تم طلاء 100 ميكرولتر فقط من العينة. (على سبيل المثال )
3. احسب متوسط قيمة PFU / مل لجميع التخفيفات التي تحتوي على ما بين 10 و 150 لوحة للوصول إلى نتيجة أكثر موثوقية.