فحص البلاك: طريقة لتحديد العيار الفيروسي كوحدات تشكيل البلاك (PFU)

العاثيات ، وتسمى أيضا العاثيات ، هي فيروسات تصيب البكتيريا على وجه التحديد ويمكننا تأكيد وجودها وتحديدها باستخدام أداة تسمى مقايسة البلاك. تصيب العاثيات مضيفيها المعرضين للإصابة عن طريق الالتصاق أولا بجدار الخلية البكتيرية وحقن مادتها الوراثية. بعد ذلك ، يختطفون آلية التخليق الحيوي للخلية لتكرار الحمض النووي الخاص بهم وإنتاج العديد من جزيئات العاثيات ، والتي يطلقونها بعد ذلك عن طريق تحلل الخلية المضيفة وقتلها.

هذا النشاط اللايتي هو أساس تقنية تعداد العاثيات المستخدمة على نطاق واسع والمعروفة باسم مقايسة البلاك أو مقايسة طبقة الأجار المزدوجة. هنا ، يتم تحضير مزيج العاثيات لأول مرة في مرق المغذيات المنصهر الذي يحتوي على أجار منخفض التركيز. يجب أن تكون جميع البكتيريا المستخدمة في المزيج حية وتنقسم بنشاط في مرحلة السجل من نموها ، مما يضمن أن نسبة كبيرة من البكتيريا قابلة للحياة وقادرة على تكوين عشب كثيف حول اللويحات. بعد ذلك ، ينتشر مزيج أجار البكتيريا المنصهرة هذا على وسط مغذي أجار أكثر صلابة وتركيزا والذي تم ترسيخه بالفعل على طبق بتري. عند الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، يتجمد مرق بكتيريا أجار والعاثية منخفض التركيز أيضا لتشكيل تراكب أجار ناعم.

هنا ، يمكن للخلايا البكتيرية أن تستمد مغذيات إضافية من الطبقة السفلية ويجب أن تتكاثر بسرعة لإنتاج عشب ملتقى من البكتيريا. ومع ذلك ، نظرا لوجود جزيئات العاثيات أيضا في الطبقة الرخوة ، فإنها ستصيب وتكرر مادتها الوراثية داخل البكتيريا ، وتبلغ ذروتها في تحلل الخلايا ، الذي يطلق ذرية متعددة. ثم تصيب ذرية العاثيات هذه الخلايا المجاورة ، حيث أن الحالة شبه الصلبة لطبقة العاثيات البكتيرية تقيد حركتها إلى الخلايا المضيفة البعيدة. تستمر دورة العدوى والتحلل هذه على مدى جولات متعددة ، مما يؤدي إلى قتل عدد كبير من البكتيريا في منطقة موضعية. يتمثل تأثير الخلايا المجاورة التي يتم تدميرها في إنتاج منطقة دائرية واحدة واضحة ، تسمى البلاك ، والتي يمكن رؤيتها بالعين المجردة ، مما يؤدي إلى تضخيم نشاط البكتيريا اللايتيك للعاثية بشكل فعال وتمكين تعدادها.

يشار إلى عدد اللويحات الموجودة على طبق بتري باسم وحدات تشكيل البلاك ، أو PFUs ، وبشرط أن يكون تركيز العاثيات الأولي مخففا بدرجة كافية ، يجب أن يتوافق مباشرة مع عدد جزيئات العاثيات المعدية في العينة الأصلية. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لتوصيف مورفولوجيا البلاك ، أو للمساعدة في تحديد أنواع العاثيات ، أو لعزل طفرات العاثيات. في هذا المختبر ، سوف تتعلم كيفية إجراء اختبار البلاك لتعداد العاثيات ، باستخدام عاثية T7 من بكتريا قولونية كمثال.

أولا ، حدد وسيطا مناسبا لزراعة الخلايا البكتيرية المضيفة والعاثية. هنا تم استخدام مرق lysogeny ، أو LB medium ، لزراعة الإشريكية القولونية والعاثية T7. بعد ذلك ، خذ ثلاث زجاجات زجاجية نظيفة وقم بتسميتها بالوسائط والاسم ، ثم الأولى باسم LB-Broth ، والثانية باسم LB-Bottom Agar ، والثالثة باسم LB-Top Agar. الآن ، قم بوزن أربعة جرامات من مسحوق LB المركب مسبقا في ثلاث مجموعات ثم انقل مجموعة واحدة من الوسائط المجففة الموزونة إلى كل زجاجة. أضف 200 مل من الماء إلى الزجاجة الأولى. امزج المحتويات باستخدام شريط تحريك مغناطيسي.

بعد ذلك ، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني والتحريك المستمر ، ارفع الرقم الهيدروجيني النهائي إلى 7.4 من خلال إضافة هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك. كرر إضافة الماء وضبط درجة الحموضة للزجاجتين الأخريين المتبقيتين أيضا. الآن ، قم بوزن ثلاثة جرامات من مسحوق أجار وأضفه إلى الزجاجة الثانية لعمل أجار سفلي بنسبة 1.5٪. أخيرا ، تزن 1. 2 جرام من أجار وأضفه إلى الزجاجة الثالثة لعمل أجار علوي .6٪. لا تحتاج حالة المرق في الزجاجة الأولى إلى إضافة أجار. قم بتغطية الزجاجة بإحكام ثم قم بتعقيم الوسائط عن طريق التعقيم على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بمجرد الانتهاء ، قم بإزالة زجاجات الوسائط من الأوتوكلاف وقم بلف أغطية الزجاجات على الفور لإغلاقها تماما لمنع التلوث. احتفظ بوسائط LB-Broth و LB-Top Agar على المقعد لاستخدامها لاحقا. ضع أجار LB-Bottom ليبرد في حمام مائي مضبوطة مسبقا على 45 درجة مئوية تقريبا.

عندما يصل أجار LB-Bottom إلى حوالي 45 درجة مئوية ، انقله إلى طاولة العمل. بعد ذلك ، قم بتعقيم مساحة العمل باستخدام 70٪ إيثينول. بعد ذلك ، أضف 450 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم المولي المعقم إلى أجار القاع المنصهر لعمل تركيز نهائي يبلغ 2.25 ملليمولار. حركي الزجاجة برفق لخلطها. ثم ضع سبعة أطباق بتري نظيفة. قم بتسمية كل طبق في الأسفل باسم الوسائط وتاريخ التحضير. ثم اسكب 15 مل من الأجار السفلي في كل من أطباق بتري السبعة. اترك الأطباق تتماسك لبضع ساعات أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بمجرد ضبطها ، يمكن تخزين ألواح الاستزراع عند أربع درجات مئوية لعدة أيام إذا لزم الأمر ، رأسا على عقب لتقليل التكثيف. انقل أطباق بتري من ثلاجة الأربع درجات مئوية إلى حاضنة 37 درجة مئوية قبل ساعة واحدة من الفحص.

في اليوم السابق لإجراء الفحص ، يجب استزراع الإشريكية القولونية. هنا ، تم تلقيح 10 ميكرولتر من ثقافة الإشريكية القولونية في 10 مل من LB-Broth. ضع البكتيريا لتنمو طوال الليل في حاضنة اهتزاز مضبوطة على 37 درجة مئوية عند 160 دورة في الدقيقة. ثم ، في يوم الفحص ، قم بإزالة الثقافة البكتيرية من الحاضنة. قم ببذور 10 مل من مرق LB الطازج مع 0.5 مل من المزرعة الليلية. ضع هذه الخلايا لتنمو في حاضنة اهتزاز مضبوطة على 37 درجة مئوية عند 160 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، استخدم مقياس الطيف الضوئي للتحقق من وصول هذه الثقافة إلى نمو طور السجل ، ويشار إليه بكثافة بصرية من 0.5 إلى 0.7. بمجرد أن يصل OD إلى هذا المستوى ، أوقف الحضانة عن طريق نقل ثقافة الخلية إلى المقعد. وهي الآن جاهزة للاستخدام في فحص تراكب العاثيات.

يمكن أن تختلف عيارات العاثيات بشكل كبير عبر أنواع وعينات العاثيات المختلفة. لذلك من أجل عدها بشكل فعال ، يجب تخفيفها لتوليد مجموعة واسعة من تركيزات العاثيات. في يوم الفحص ، قم بإنشاء سلسلة من تخفيفات العاثيات تتراوح من عشر إلى مليون تركيزات ، باتباع تقنية التخفيف 10 أضعاف. للحصول على بيانات ذات دلالة إحصائية ودقيقة ، قم بإجراء التخفيف التسلسلي ثلاث نسخ.

بعد ذلك ، قم بإذابة أجار LB-top المتصلب باستخدام الميكروويف. ثم ضعه في حمام مائي محدد مسبقا على 45 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة ، اجمع أطباق بتري التي تحتوي على طبقة الأجار السفلية من الحاضنة. قم بتسمية الألواح بتركيز العاثيات وتاريخ الفحص. ثم ضع سبعة أنابيب اختبار نظيفة. قم بتسمية كل أنبوب اختبار برقم تخفيف العاثية التسلسلي وقم بتعيين واحد كعنصر تحكم.

عندما يصل أجار LB-top إلى 45 درجة مئوية ، انقله إلى مقعد العمل. والآن، أضف 450 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم المولي إلى أجار 200 ملليلتر لتكوين تركيز نهائي يساوي 2.25 ملليمولار. حركي الزجاجة برفق لخلطها. بعد ذلك ، أضف 35 مل من أجار LB-top وأربعة ملليلتر من التعليق البكتيري إلى أنبوب مخروطي معقم. قم بتدوير الخلايا برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي ولكن تجنب الاهتزاز لمنع تكوين الرغوة.

الآن ، قم بنقل خمسة ملليلتر من مزيج أجار البكتيريا العلوي إلى كل من أنابيب الاختبار السبعة. بعد ذلك ، انقل 100 ميكرولتر من عينات العاثيات المخففة بشكل متسلسل ووسائط التحكم ، والتي يجب أن تكون مجرد وسائط بدون عاثية ، إلى أنابيب الاختبار المصنفة باحترام. حركي الخليط برفق لضمان الخلط المناسب. انقل برفق خمسة ملليلتر من مزيج العاثيات إلى صفيحة بتري المعنية. وزعي المزيج بالتساوي في جميع أنحاء السطح بالكامل عن طريق تحريك لوحة بتري برفق.

بمجرد وضع جميع ألواح بتري في طبقات مع المزيج ، اسمح بتصلب الطبقة العليا عن طريق الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الانتهاء من هذه الخطوات ، كرر العملية للمجموعتين الثانية ثم الثالثة من أطباق بتري باستخدام المجموعتين المتبقيتين من تخفيفات العاثيات. أغلق كل طبق بالبارافيلم واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ضع لوحة الثقافة رأسا على عقب عند درجة حرارة مناسبة لمدة 24 ساعة أو حتى تتطور اللويحات. هنا ، تم وضع الصفائح في حاضنة 37 درجة مئوية ليوم واحد ، وهي حالة محفزة للنمو للإشريكية القولونية والعاثية T7.

ستظهر اللويحات بعد يوم إلى خمسة أيام من الحضانة ، اعتمادا على الأنواع البكتيرية وظروف الحضانة واختيار الوسيط. هنا ، كانت اللويحات مرئية بعد يوم واحد من الحضانة عند 37 درجة مئوية. ابدأ بفحص اللوحات التي تحمل علامة التحكم وتأكد من عدم تشكل لويحات في هذه الألواح ، لأن هذا قد يشير إلى تلوث فيروسي. لتحديد عيار العاثيات في العينة الأصلية ، ابدأ بالألواح التي تحتوي على عينة العاثية المخففة أولا واحسب اللويحات دون إزالة الأغطية ، مع وضع علامة عليها للإشارة إلى تلك التي تم عدها بالفعل. كرر العد لكل طبق في كل مجموعة. قد تحتوي بعض اللوحات على لويحات كثيرة جدا أو قليلة جدا بحيث لا يمكن عدها. ضع في اعتبارك من 10 إلى 150 عددا مثاليا من البلاك.

بعد ذلك ، قم بإنشاء جدول يسرد قيم أرقام البلاك للتخفيفات والتكرارات المختلفة. بعد ذلك ، احسب متوسط قيم عدد البلاك لألواح التخفيف التي تحتوي على العدد المثالي لعدد البلاك. في هذا المثال ، كان هذا هو متوسط عدد اللويحات المتكونة في 10 إلى سالب ثلاثة و 10 إلى سالب أربعة ألواح تخفيف. الآن ، اضبط عامل تخفيف العاثيات بقسمة متوسط قيم البلاك التي تم الحصول عليها على عوامل تخفيف العاثية المعنية. هنا ، تم تقسيم متوسط عدد اللويحات المتكونة إلى 10 إلى سالب ثلاثة و 10 إلى سالب أربعة ألواح التخفيف ، حسب عوامل التخفيف الخاصة بها للحصول على عدد وحدات تشكيل البلاك ، أو PFUs ، في 100 ميكرولتر من خليط العاثية. لتحويل القيمة إلى PFU لكل مليلتر ، اضرب القيم المتولدة في 10 ، حيث تم استخدام 100 ميكرولتر فقط من مزيج تخفيف العاثيات أثناء خطوة تحضير تراكب العاثيات ، مما ينتج عنه عامل تخفيف إضافي قدره 10. أخيرا ، احسب متوسط القيم التي تم الحصول عليها من لوحات التخفيف المختلفة. سيعطي هذا متوسط عدد PFUs لكل مليلتر. يتوافق عدد PFUs مع عدد جزيئات العاثيات المعدية في العينة الأصلية.