تحويل خلايا الإشريكية القولونية باستخدام إجراء كلوريد الكالسيوم المكيف

p class = "jove_content" > يصف هذا البروتوكول تحضير وتحويل الإشريكية القولونية المختصة DH5α باستخدام تكييف إجراء كلوريد الكالسيوم (12).

1. الإعداد

1. معدات
   • مقياس الطيف الضوئي
   • جهاز الطرد المركزي Sorval (أو ما يعادله)
   • جهاز طرد مركزي على الطاولة
   • كتلة حرارية أو حمام مائي
   • شاكر مداري
   • حاضنة ثابتة
   • صينية صب هلام
   • أمشاط البئر
   • مصدر الجهد
   • صندوق جل
   • مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية
   • المايكرويف
2. الحلول والكواشف
   • مرق لوريا بيرتاني (LB) (10 جم كازين مائي إنزيمي ، 5 جم من مستخلص الخميرة و 5 جم كلوريد الصوديوم في 1000 مل من H₂O)
   • مرق فائق الأمثل مع قمع الكاتابوليت (SOC): (2٪ (وزن / حجم) التربتون ، 0.5٪ (وزن / حجم) مستخلص الخميرة ، 10 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي ملي كلوريد₂ ، 10 ملي مجم 4 ، و 20 ملي جلوكوز)
   محلول
   • كلوريد_{الكالسيوم 2-ملغ كلوريد 2} (80 ملي ملي كلوريد₂ ، 20 ملي كالسيوم₂).
   • محلول M CaCl₂ (إذا تم تحويل الخلايا على الفور) أو محلول 0.1M CaCl₂ يحتوي على 10٪ (حجم / حجم) جلسرين (إذا تم تجميد الخلايا للاستخدام في المستقبل).
   • لوحات أجار LB
   • ألواح أجار LB الانتقائية (في هذه التجربة ، نظرا لأن البلازميد المستخدم يمنح مقاومة الأمبيسلين ، فقد تم استخدام ألواح أجار LB التي تحتوي على أمبيسلين 100 ميكروغرام / مل)
   • الإشريكية القولونية DH5α سلالة
   • البلازميد pUC19 DNA (100 بيكوغرام / ميكرولتر)
   • QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)
   • إنزيم تقييد HindIII
   • 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي
   • نقطة انصهار منخفضة الاغاروز
   • 1X TAE buffer (40 ملي ملي قاعدة تريس ، 20 ملي حمض الخليك و 1 ملي مولار EDTA)
   • بروميد الإيثيديوم (10 مجم / مل)
3. ملاحظات السلامة العامة
   الإشريكية القولونية يصنف DH5α على أنه مستوى السلامة الحيوية 1 (BSL1). تشكل الميكروبات في هذه الفئة تهديدا ضئيلا أو معدوما للإصابة بالعدوى لدى البالغين الأصحاء. ومع ذلك ، يلزم التلاعب الدقيق بالكائنات الحية الدقيقة.

المهم يجب تنفيذ جميع الخطوات الواردة في هذا البروتوكول باستخدام تقنيات معقمة وعلى الجليد أو درجات حرارة 4 درجات مئوية ما لم يذكر ذلك.

2. بروتوكول

1. من مخزون مجمد من الإشريكية القولونية DH5α (المجمدة في 20٪ جلسرين من مزرعة ليلية مزروعة في LB) ، قم بإخراج البكتيريا للعزل على طبق أجار LB. احتضان عند 37 درجة مئوية طوال الليل (16-20 ساعة).
2. تلقيح مستعمرة واحدة في 3 مل من مرق LB في أنبوب. تنمو الاهتزاز عند 210 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (16-20 ساعة).
3. قم بقياس OD600 للثقافة الليلية. استخدم المزرعة الليلية لتلقيح 100 مل من مرق LB في قارورة سعة 1 لتر إلى OD600 = 0.01. احتضان اهتزاز المزرعة بقوة (210 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمراقبة OD600 في مقياس الطيف الضوئي كل 15-20 دقيقة ، حتى تصل الثقافة إلى OD600 = 0.35 (حوالي 3 ساعات).
   ملاحظة: لكي يكون التحول فعالا ، يجب أن تكون الخلايا البكتيرية في منتصف مرحلة النمو الأسي. يجب أن يكون الحد الأقصى لعدد الخلايا 10⁸ خلايا / مل ، وهو ما يتوافق مع OD600 = 0.4 بالنسبة لمعظم سلالات الإشريكية القولونية. يسمح استخدام مقياس الطيف الضوئي بقياس OD600 ، والذي يسمح بتحديد أن الخلايا في مرحلة النمو المناسبة. إذا تم استخدام هذا البروتوكول لسلالات أخرى من البكتيريا ، فستكون المعايرة لتحديد عدد المستعمرات التي تشكل وحدات بقيم OD600 محددة ضرورية لتحديد هذا الارتباط.
4. انقل 50 مل من المزرعة إلى كل من زجاجتين من زجاجات الطرد المركزي من مادة البولي بروبيلين الباردة. ضع الزجاجات على الثلج لمدة 20 دقيقة حتى تبرد.
5. استرجع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 2700 جم (4100 دورة في الدقيقة في دوار Sorval GSA) لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
6. قم بإزالة المادة الطافية. قم بتصريف آخر آثار الوسائط عن طريق وضع الزجاجة رأسا على عقب على وسادة أو منشفة ورقية.
7. أعد تعليق كل حبيبات بكتيرية في 30 مل من كلور الكالسيوم_{2-MgCl 2} (80 ملي ملي كلوريد₂ ، 20 ملي كالسيموم₂) محلول مثلج. أضف أولا 5 مل من المحلول ، ولفها بحذر حتى تذوب الحبيبات تماما ثم أضف الباقي 25 مل من المحلول.
8. كرر الخطوة 2.4.
9. كرر الخطوة 2.5.
10. إذا كانت الخلايا المختصة ستتحول مباشرة ، فأعد تعليق كل حبيبات بكتيرية إلى 2 مل من محلول ككلوريد الكالسيوم₂ (0.1 م) المثلج عن طريق تدوير الأنابيب بعناية. إذا لم يتم تعليق الحبيبات بهذه الطريقة ، فقم بإعادة التعليق عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل (تجنب تكوين الفقاعة).
    بدلا من ذلك ، يمكن تجميد الخلايا المختصة وتخزينها لاستخدامها لاحقا. لتحضير مخزونات مجمدة من الخلايا المختصة ، أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من محلول CaCl₂ 0.1M يحتوي على 10٪ (حجم / حجم) جلسرين. يجب أن يكون هذا الحل مثلجا. تعليق خلية Aliquot في أنابيب بولي بروبيلين مثلجة 1.5 مل (160 ميكرولتر لكل أنبوب). قم بتجميد الخلايا المختصة على الفور في حمام ثلج جاف / إيثانول. نقل الأنابيب إلى فريزر -70 درجة مئوية.
11. لتحويل الخلايا المعالجة بكلوريد الكالسيوم₂ ، انقل 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة إلى كل من أنابيب البولي بروبيلين 2 1.5 مل. أضف 1 ميكرولتر (100 بيكوغرام) من الحمض النووي البلازميد pUC19 إلى أحد الأنابيب واترك الأنبوب الثاني بدون حمض نووي (تحكم سلبي). تخلط بلطف (تجنب تكوين الفقاعات). احتضن لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    ملاحظة: لا ينبغي استخدام أكثر من 50 نانوغرام من الحمض النووي بحجم 10 ميكرولتر أو أقل في التحول.
12. انقل الأنابيب إلى كتلة الحرارة واحتضانها عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية بالضبط.
    ملاحظة: الصدمة الحرارية هي خطوة حاسمة. لا تتجاوز درجة الحرارة أو وقت الحضانة.
13. نقل الأنابيب بسهولة إلى الجليد. احتضان لمدة 2 دقيقة.
14. أضف 950 ميكرولتر من وسائط SOC واحتضان الأنابيب لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية للسماح للبكتيريا بالتعافي والتعبير عن علامة مقاومة المضادات الحيوية المشفرة في البلازميد.
15. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في 1000 ميكرولتر في SOC (1/100 تخفيف) و 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في 1000 ميكرولتر في SOC (1/10 تخفيف). ضع 100 ميكرولتر من التخفيفات ، بالإضافة إلى عنصر التحكم ، على ألواح انتقائية ، وانتشر باستخدام ملعقة. عادة ، سينتج عن طلاء 100 ميكرولتر من تخفيف 1/100 و 1/10 عددا كافيا من وحدات تشكيل المستعمرة (cfu) لكل لوحة. من الناحية المثالية ، يجب أن يتراوح هذا الرقم بين 30-300 CFU بحيث يكون هناك عدد كاف من المستعمرات ولكن منفصلة عن بعضها البعض. ومع ذلك ، سيعتمد عدد cfu على كفاءة التحويل (انظر قسم تحليل البيانات والنتائج).
16. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية. يجب أن تظهر المستعمرات المحولة في غضون 12-16 ساعة (يعتمد هذا النطاق على سلالة الخلية وطريقة الاختيار). لا ينبغي أن تنمو مستعمرات في السيطرة السلبية.
17. عد cfu / اللوحة التي تم الحصول عليها للتحويل (الجدول 1).
18. للتحقق من أن المحولات تحتوي على بلازميد pUC19 ، سيتم إجراء تحضير البلازميد والهضم اللاحق. تحقيقا لهذه الغاية ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة في 3 مل من مرق LB في أنبوب. تنمو الاهتزاز عند 210 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (16-20 ساعة).
19. قم بإعداد مستحضر البلازميد باستخدام QIAprep Spin Miniprep Kit ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
20. هضم 1 ميكروغرام من pUC19 المنقى باستخدام إنزيم التقييد HindIII عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي إنزيم يقطع في موقع الاستنساخ المتعدد pUC19 لهذه الخطوة.

مكون مبلغ 10X المخزن المؤقت لملخص التقييد 2.5 ميكرولتر البلازميد pUC19 1 ميكروغرام هندالثالثة 1 ميكرولتر ح₂س 20.5 ميكرولتر (إلى 25 ميكرولتر)

21. قم بتشغيل سلم الوزن الجزيئي ، والحمض النووي pUC19 المهضوم ونفس الكمية من الحمض النووي pUC19 غير المهضوم في هلام الاغاروز 1٪ الذي يحتوي على 1 ميكروغرام / مل من بروميد الإيثيديوم لمدة ساعة واحدة عند 95 فولت < br / > ملاحظة: سيختلف الوقت والجهد حسب المعدات المستخدمة.
22. تصور الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. قارن حجم الحمض النووي pUC19 المهضوم وغير المهضوم (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2) (انظر قسم تحليل البيانات والنتائج).
    تابع الخطوات اللازمة المطلوبة للتحقق من التحويل وفقا لهدف كل تجربة تحويل معينة.

الشكل 2: هضم الحمض النووي البلازميد المستعاد من خلايا DH5α المحولة. تم استرداد الحمض النووي البلازميد من خلايا DH5α المحولة ، وهضمها باستخدام HindIII ، وتشغيلها في هلام الاغاروز بنسبة 1٪ وتم تصورها باستخدام مصدر للأشعة فوق البنفسجية (الخطوات من 2.19 إلى 2.22).

< p class = "jove_title" >3. تحليل البيانات والنتائج < p class = "jove_content">لحساب كفاءة التحويل ، وهو مؤشر على مدى امتصاص الخلايا للحمض النووي خارج الخلية ، يجب حساب المستعمرات التي تم الحصول عليها في التحول: التخفيف سي إف يو 1/100 34 1/10 246 < p class = "jove_content" > الجدول 1: وحدات تشكيل المستعمرة (cfu) محسوبة من تجربة التحويل. < p class = "jove_content" > كفاءة التحويل (TE) هي مقياس لعدد cfu الناتج عن تحويل 1 ميكروغرام من البلازميد إلى حجم معين من الخلايا المختصة. تؤثر العديد من المعلمات على كفاءة التحول: حجم البلازميد ، والنمط الجيني للخلية ، ومرحلة النمو أثناء إعداد الكفاءة ، وطرق التحويل ، وما إلى ذلك). عند حساب TE ، من المهم مراعاة التخفيف (إن وجد) الذي تم إجراؤه قبل الطلاء ودمجها في حساب العدد الإجمالي ل cfu. يتم حساب كفاءة التحويل (TE) بالمعادلة التالية: < p class = "jove_content" >

أولا اقسم cfu على ميكروغرام من الحمض النووي ، في هذا المثال 0.0001 ميكروغرام. ثم اقسم النتيجة على عامل التخفيف. في هذا المثال ، تم استخدام تخفيف 1/10 وتم طلاء 100 ميكرولتر من محلول 1 مل (التخفيف: 1/10 × 100 ميكرولتر / 1000 ميكرولتر = 0.01).

< p class = "jove_content" >