الاقتران: طريقة لنقل مقاومة الأمبيسلين من المتبرع إلى المتلقي للإشريكية القولونية

الخلايا البكتيرية ، مثل الإشريكية القولونية ، قادرة على نقل المعلومات الجينية من خلية إلى أخرى. يختلف الاقتران عن الآليات الأخرى لنقل الحمض النووي ، مثل التنبيغ أو التحويل ، من حيث أنه يتطلب اتصالا جسديا بين الخلايا.

للمضي قدما ، يتطلب الاقتران خلية مانحة تعبر عن عامل الخصوبة ، أو F ، وخلية متلقية بدونها ، خلية F ناقصة. تتطلب العملية خطوتين. الأول هو إنشاء اتصال مباشر من خلية إلى خلية. للقيام بذلك ، تولد الخلية المانحة بنية خيطية خارج الخلية تسمى pilus الجنسي. سمي بهذا الاسم لأن الاقتران هو شكل من أشكال التزاوج للبكتيريا التي تتكاثر لاجنسيا ، ولكن تجدر الإشارة إلى أنه ليس التكاثر الجنسي الحقيقي حيث لا يتم تبادل الأمشاج ولا يتم تكوين ذرية.

الخطوة الثانية هي تسليم الحمض النووي إلى الخلية المتلقية. بعد أن يقيم الجنس البائس اتصالا بين خليتين ، يتم بناء قناة تسمى نظام إفراز النوع الرابع تسمح بنقل الحمض النووي. تبدأ الخلية المانحة بعد ذلك في تكرار الحمض النووي خارج الكروموسومات الذي سيتم نقله بناء على وجود عنصر وراثي يعرف باسم OriT أو أصل النقل. يتم ربط أحد طرفي الحمض النووي المكرر حديثا في القناة من خلال ربط بروتين الحمض النووي. مع تكرار الحمض النووي بشكل أكبر ، يتم ضخه عبر القناة ، ويتم تسهيله بواسطة مجموعة من البروتينات المشفرة بواسطة الجينات الموجودة بالقرب من OriT. بمجرد نقل الحمض النووي بالكامل ، سيشكل إما بلازميد كروموسومي إضافي ، أو قد يندمج في كروموسوم الخلية المتلقية. أيا كانت نقطة نهاية الحمض النووي المنقول ، سيتم بعد ذلك التعبير عن الجينات التي يشفرها. يمكن استخدام هذا التعبير الجيني لتأكيد الاقتران الناجح.

على سبيل المثال ، ضع في اعتبارك سيناريو تعبر فيه السلالة المانحة عن مقاومة الأمبيسلين وتنقل ذلك في الحمض النووي المترافق إلى البكتيريا المتلقية ، لكن السلالة المتلقية لديها أيضا جين مقاومة التتراسيكلين غير موجود في المتبرع. في هذه الحالة ، عندما يتم طلاء الخلايا على وسائط LB التي تحتوي على كل من التتراسيكلين والأمبيسلين ، يجب أن تنمو المستعمرات فقط من البكتيريا المترافقة بنجاح ، والتي ستعبر عن كلا النمطين الظاهريين للمقاومة. لتأكيد الاقتران الناجح بشكل أكبر ، يمكن حصاد الحمض النووي البلازميد من هذه المستعمرات ومن ثم يمكن تضخيم جزء من الحمض النووي الخاص بالبلازميد المنقول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). عندما يتم تشغيل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الرحلان الكهربائي جنبا إلى جنب مع سلم من الأحجام القياسية ، يجب أن يكون جزء PCR بحجم معروف مرئيا على الجل ، مما يؤكد الاقتران الناجح. في هذه التجربة ، سيتم استخدام البلازميد لنقل جين مقاومة الأمبيسلين عن طريق الاقتران من سلالة مانحة إلى سلالة متلقية مقاومة للتتراسيكلين. بعد ذلك ، لتأكيد الاقتران ، سيتم تحضين خليط الاقتران على طبق يحتوي على كل من المضادات الحيوية تاركا فقط البكتيريا المحولة. أخيرا ، سيتم تأكيد الاقتران الناجح باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

قبل البدء في الإجراء ، ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات. بعد ذلك ، قم بتعقيم مساحة العمل باستخدام 70٪ من الإيثانول لمسح السطح.

في هذا الإجراء ، سيتم نقل جين مقاومة الأمبيسلين من سلالة WM3064 من الإشريكية القولونية إلى سلالة J53 من الإشريكية القولونية عن طريق الاقتران. السلالة المانحة WM3064 مقاومة للتتراسيكلين والأمبيسلين وتتطلب حمض ديامينوبيميليك ، أو DAP ، للنمو. السلالة المتلقية J53 مقاومة فقط للتتراسيكلين ولا تتطلب DAP للنمو. هذا يعني أن الخلايا المترافقة بنجاح يجب أن تكون مقاومة للتتراسيكلين والأمبيسلين ويمكن أن تنمو بدون DAP.

قم بإعداد ثقافة سلالة المتبرع عن طريق تلقيح خمسة ملليلتر من LB يحتوي على 0.3 ملليمول من DAP بخردة من مخزون الجلسرين المجمد من سلالة المتبرعين. بعد ذلك ، قم بإعداد السلالة المتلقية عن طريق تلقيح خمسة ملليلتر من مرق LB بدون DAP بخردة من مخزون الجلسرين المتلقي المجمد. قم بزراعة هذه الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة في حاضنة اهتزازية. بمجرد أن تنمو الثقافات إلى OD 600 من اثنين ، قم بإزالة مليلتر واحد من الثقافة من كل منهما وضعها في أنبوبين منفصلين جديدين للطرد المركزي 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي هذه الحصص عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق لتكسير الخلايا البكتيرية. تخلص من المادة الطافية واغسل كل حبيبات ب 250 ميكرولتر من 1X PBS. قم بالطرد المركزي للعينات مرة أخرى ، وبعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق كل حبيبات في 500 ميكرولتر من PBS.

لبدء إجراء الاقتران، قم أولا بدمج 50 ميكرولترا من الخلايا المتلقية مع 50 ميكرولترا من الخلايا المانحة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر واخلطه عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل برفق. بعد ذلك ، قم بوضع ماصة 100 ميكرولتر من ثقافة الخلايا المتلقية على صفيحة 1X أخرى من التتراسيكلين تحتوي على DAP. بعد ذلك ، قم بإعداد التحكم السلبي عن طريق سحب 100 ميكرولتر من ثقافة الخلايا المتلقية فقط على صفيحة أجار غير انتقائية تحتوي على DAP. بعد ذلك ، قم باحتضان لوحات الاقتران والتحكم السلبية طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، خذ مكشطة خلية معقمة واحصد الخلايا من لوحة الاقتران عن طريق جمع المستعمرات. بعد ذلك ، انقل المستعمرات إلى أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مليلتر يحتوي على مليلتر واحد من 1X PBS. كرر هذه العملية لجمع الخلايا المتلقية من اللوحة الأخرى.

بعد ذلك ، دوامة العينات لخلطها. بعد الخلط ، انقل الأنابيب إلى جهاز طرد مركزي لتكسير الخلايا برفق. تخلص من المادة الطافية ، ثم اغسل كريات الخلية في مليلتر واحد من PBS وقم بتدوير الأنابيب لإعادة تعليق الخلايا. بيليه الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية مرة أخرى وأعد تعليق كل من كريات الخلية في مليلتر واحد من PBS. الآن ، باستخدام طرف ماصة معقم ، قم بوضع 100 ميكرولتر من خليط خلية تفاعل الاقتران على صفيحة أجار LB بدون DAP تحتوي على 1X tetracycline و 1X أمبيسلين. كرر طريقة الطلاء باستخدام 100 ميكرولتر من تخفيف عشرة أضعاف من نفس خليط الخلية في PBS على لوحة أجار LB أخرى بدون DAP تحتوي على 1X التتراسيكلين و 1X أمبيسلين.

أخيرا، قم بوضع ماصة 100 ميكرولتر من خليط خلايا التحكم السلبية على صفيحة أجار LB واحدة مع 1X التتراسيكلين فقط. بعد الحضانة الليلية عند 37 درجة مئوية ، يجب أن تكون المستعمرات مرئية. باستخدام طرف ماصة معقم ، اختر مستعمرة واحدة من لوحة تفاعل الاقتران وأضفها إلى أنبوب يحتوي على خمسة ملليلتر من وسائط LB الانتقائية التي تحتوي على كل من المضادات الحيوية. ثم كرر عزل المستعمرة عن طريق اختيار مستعمرة واحدة من لوحة الخلية المتلقية. قم بزراعة هذه الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع تهوية عند 220 دورة في الدقيقة.

في اليوم التالي ، امسح سطح المقعد بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بإزالة الألواح من الحاضنة. استخدم مجموعة أدوات إعداد الحمض النووي المصغرة لعزل الحمض النووي عن 4. 5 ملليلتر من كل ثقافة حسب تعليمات الشركة المصنعة. بعد الانتهاء من إعداد الحمض النووي المصغر ، قم بتصفية الحمض النووي باستخدام 35 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز. أخيرا ، استخدم 0 المتبقي. 5 ملليلتر من كل مزرعة لتحضير مخزون واحد من الجلسرين عن طريق إضافة 0.5 مل من الجلسرين بنسبة 100٪ للتخفيف الفردي. ضع هذه الحصص عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين لحين الحاجة.

لتأكيد الاقتران الناجح بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم أولا بإعداد مزيج رئيسي من تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق إضافة 75 ميكرولترا من المزيج الرئيسي 2X PCR إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك ، أضف 7.5 ميكرولتر لكل من برايمر أمامي 10 ميكرومولار وبرايمر عكسي 10 ميكرومولار مصمم لتضخيم جين مقاومة الأمبيسلين من البلازميد. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج رئيسي ثان من تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق إضافة 75 ميكرولترا من المزيج الرئيسي 2X PCR إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق ثم إضافة 7.5 ميكرولتر لكل من 10 ميكرومولار برايمر أمامي و 10 ميكرومولار برايمر عكسي مصمم لتضخيم جين التدبير المنزلي ، في هذه الحالة الحمض النووي جيراز ب.

الآن ، أضف 15 ميكرولترا من المزيج الرئيسي الأول إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ثم أضف 10 نانوغرام ، أي ما يقرب من ميكرولترين من الحمض النووي التجريبي للقالب إلى نفس الأنبوب. ارفع التفاعل إلى الحجم النهائي البالغ 25 ميكرولتر بالماء الخالي من النوكلياز. كرر هذه الخطوات لإنتاج التفاعلات الخمسة المتبقية ، بحيث تحتوي الأنابيب على المكونات الموضحة هنا. الآن ، انقل هذه التفاعلات إلى جهاز تدوير حراري مع تسخين الكتلة مسبقا إلى 98 درجة مئوية ثم ابدأ البرنامج. بعد الانتهاء من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإزالة الأنابيب من الجهاز. بعد ذلك ، قم بتحميل ميكرولترين من كل تفاعل ممزوج بميكرولترين من صبغة التحميل وأربعة ميكرولترات من علامة الوزن الجزيئي في آبار متتالية من هلام الاغاروز بنسبة 1٪. اضبط الجل على 150 فولت لمدة 20 دقيقة. أخيرا ، تصور الجل باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية.

في هذه التجربة ، تم تأكيد النقل الناجح لجين مقاومة الأمبيسلين عن طريق الاقتران عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). هنا ، يجب ملاحظة ما يقرب من 500 زوج أساسي بحجم الفرقة في البئر التي تحتوي على الحمض النووي المترافق وبادئات الأمبيسلين ، بئر اثنان في هذا المثال. تم تحميل جين التدبير المنزلي ، DNA gyrase B ، في الآبار الثالثة والخامسة مع الحمض النووي المترافق والحمض النووي للخلية المتلقية ، على التوالي. تعمل النطاقات التي لوحظت في هذه الآبار كعنصر تحكم إيجابي لضمان وجود قالب الحمض النووي وأن تفاعل البوليميراز المتسلسل كان ناجحا. لا ينبغي ملاحظة النطاقات في البئر التي تحتوي على تفاعل الحمض النووي للخلية المتلقية وزوج أمبيسيلين التمهيدي ، حسنا أربعة في هذا المثال ، لأن الخلايا المتلقية ليست مقاومة للأمبيسيلين. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي ملاحظة أي نطاقات في التفاعلات التي تفتقر إلى قالب الحمض النووي ، الآبار السادسة والسابعة هنا. إذا تم استيفاء هذه الشروط ، فسيؤكد ذلك النقل الناجح لجين مقاومة الأمبيسلين ، مما يمنح مقاومة الأمبيسلين من سلالة WM3064 من الإشريكية القولونية إلى سلالة J53 من الإشريكية القولونية.