الاقتران: طريقة لنقل مقاومة الأمبيسلين من المتبرع إلى المتلقي للإشريكية القولونية
1. الإعداد
- الأوتوكلاف حوالي 1 لتر من وسط لوريا بيرتاني (LB). سيتم استخدام هذا LB المعقم لصنع ما يقرب من 5 مل من LB يحتوي على 0.3 ملي مولار من حمض ديامينوبيميليك (DAP).
- اجمع اللوحات التالية: ألواح أجار LB مع 1X Tet و 0.3 mM DAP ، وألواح أجار LB مع 1X Tet فقط ، وألواح أجار LB مع 1X أمبير / تيت فقط.
- تأكد من أن بعض الجلسرين وعلبة من أطراف الماصات البلاستيكية المعقمة مسبقا في متناول اليد.
- قبل البدء في أي عمل يتضمن الميكروبات ، قم بتعقيم مساحة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية اللازمة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات.
- بمجرد الانتهاء ، قم بتعقيم جميع الأسطح والقفازات بنسبة 70٪ من الإيثانول واغسل يديك.
2. تحضير سلالة المتبرع والمتلقي
- قم بإعداد 5 مل من المزارع البكتيرية للسلالات المانحة والمتلقية وزراعتها طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة. يجب زراعة السلالة المانحة في LB مع 0.3 ملي مولار DAP.
- قم بتدوير 1 مل من كلتا الثقافتين (~ 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق) واغسل الخلايا باستخدام PBS.
- أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- اجمع بين 50 ميكرولتر من الخلايا المتلقية مع 50 ميكرولتر من الخلايا المانحة في أنبوب طرد مركزي دقيق واخلطه عن طريق سحب العينات.
- احتضان خليط الخلية لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. سيؤدي ذلك إلى تعزيز كفاءة الاقتران قبل وأثناء خطوة الطلاء التالية.
- Pipet 100 ميكرولتر من خليط الخلية على صفيحة أجار مع 1X Tet و 0.3 mM DAP. لا تنتشر على الطبق.
- Pipet 100 ميكرولتر من زراعة الخلايا المتلقية على صفيحة أجار مع 1X Tet و 0.3 mM DAP. لا تنتشر على الطبق.
- احتضان كلا اللوحين طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
- اكشط خليط الخلايا المترافقة وزراعة الخلايا المتلقية باستخدام مكشطة خلية معقمة. انقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المعقم وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من PBS.
- دوامة الخلايا وتدويرها برفق (~ 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق).
- أعد تعليق الخلايا في 1 مل من PBS.
- ضع خليط خلية تفاعل الاقتران على صفيحة أجار LB مع 1X أمبير / تيت فقط. في هذه اللوحة ، من المتوقع أن تنمو فقط البكتيريا المتلقية التي نجحت في الحصول على جين مقاومة Amp عن طريق الاقتران.
- ضع الخلايا المتلقية على لوحة أجار LB باستخدام 1X Tet فقط. في هذه اللوحة ، من المتوقع أن تنمو فقط البكتيريا المتلقية غير المترافقة ، والتي لا تحتوي على جين مقاومة Amp.
- احتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
- اختر مستعمرات مفردة من كلتا اللوحين واستخدمها لزراعة المزارع بين عشية وضحاها في 5 مل من الوسائط (37 درجة مئوية مع تهوية عند 220 دورة في الدقيقة).
- اعزل الحمض النووي من الثقافات المعدة مسبقا باستخدام 4.5 مل من إجمالي حجم المزرعة بواسطة الحمض النووي المصغر.
- للقيام بذلك ، قم بتصفية الحمض النووي باستخدام 35 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
- سيولد الحمض النووي النقي نسبة امتصاص (A260/280) تبلغ حوالي 1.8.
- استخدم 0.5 مل المتبقية من كل مزرعة لتحضير مخزون الجلسرين عن طريق صنع خليط 1: 1 من الثقافة البكتيرية و 100٪ من الجلسرين.
- قم بتخزين مخزون الفريزر عند -80 درجة مئوية.
- قم بإعداد مزيجين رئيسيين من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لكل منهما مجموعة مختلفة من البادئات الأمامية والخلفية ، أحدهما يستهدف 500 قطعة من زوج القاعدة داخل جين مقاومة الأمبيسلين والآخر يستهدف جزءا داخل جين التدبير المنزلي.
- تم تصميم بادئات جينات التدبير المنزلي لتضخيم جزء من الحمض النووي داخل ترميز الجينات البكتيرية ل DNA gyrase B (14).
- تم استخدام أحجام الكاشف التالية لتحضير 90 ميكرولتر من كل مزيج رئيسي:
7.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر برايمر أمامي
7.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر برايمر عكسي
75 ميكرولتر من 2X PCR Master Mix
- قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الستة التالية باستخدام مزيج رئيسي سعة 15 ميكرولتر ، و 10 نانوغرام من قالب الحمض النووي ، والماء الخالي من النوكلياز حتى الحجم النهائي 25 ميكرولتر < br / >
تفاعل الاقتران الحمض النووي وبادئات الأمبيسلين
الحمض النووي لتفاعل الاقتران والبادئات التدبير المنزلي
التحكم السلبي في الحمض النووي وبادئات الأمبيسلين
التحكم السلبي الحمض النووي والبادئات التدبير المنزلي
لا يوجد DNA و ampicillin primers
لا يوجد DNA ومواد أولية للتدبير المنزلي - انقل هذه التفاعلات إلى جهاز PCR مع تسخين الكتلة مسبقا إلى 98 درجة مئوية وابدأ في التدوير الحراري في ظل الظروف التالية:
98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية < / > 25-35 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 5-10 ثوان ، 45-72 درجة مئوية لمدة 10 إلى 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 15-30 ثانية لكل كيلو بايت < / > 72 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق < / > استمر في 4 درجات مئوية - قم بتحميل جميع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الستة على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ وقم بتشغيله عند ~ 150 فولت لمدة 20 دقيقة تقريبا.
- تصور منتج الكمبيوتر باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
الخلايا البكتيرية ، مثل الإشريكية القولونية ، قادرة على نقل المعلومات الجينية من خلية إلى أخرى. يختلف الاقتران عن الآليات الأخرى لنقل الحمض النووي ، مثل التنبيغ أو التحويل ، من حيث أنه يتطلب اتصالا جسديا بين الخلايا.
للمضي قدما ، يتطلب الاقتران خلية مانحة تعبر عن عامل الخصوبة ، أو F ، وخلية متلقية بدونها ، خلية F ناقصة. تتطلب العملية خطوتين. الأول هو إنشاء اتصال مباشر من خلية إلى خلية. للقيام بذلك ، تولد الخلية المانحة بنية خيطية خارج الخلية تسمى pilus الجنسي. سمي بهذا الاسم لأن الاقتران هو شكل من أشكال التزاوج للبكتيريا التي تتكاثر لاجنسيا ، ولكن تجدر الإشارة إلى أنه ليس التكاثر الجنسي الحقيقي حيث لا يتم تبادل الأمشاج ولا يتم تكوين ذرية.
الخطوة الثانية هي تسليم الحمض النووي إلى الخلية المتلقية. بعد أن يقيم الجنس البائس اتصالا بين خليتين ، يتم بناء قناة تسمى نظام إفراز النوع الرابع تسمح بنقل الحمض النووي. تبدأ الخلية المانحة بعد ذلك في تكرار الحمض النووي خارج الكروموسومات الذي سيتم نقله بناء على وجود عنصر وراثي يعرف باسم OriT أو أصل النقل. يتم ربط أحد طرفي الحمض النووي المكرر حديثا في القناة من خلال ربط بروتين الحمض النووي. مع تكرار الحمض النووي بشكل أكبر ، يتم ضخه عبر القناة ، ويتم تسهيله بواسطة مجموعة من البروتينات المشفرة بواسطة الجينات الموجودة بالقرب من OriT. بمجرد نقل الحمض النووي بالكامل ، سيشكل إما بلازميد كروموسومي إضافي ، أو قد يندمج في كروموسوم الخلية المتلقية. أيا كانت نقطة نهاية الحمض النووي المنقول ، سيتم بعد ذلك التعبير عن الجينات التي يشفرها. يمكن استخدام هذا التعبير الجيني لتأكيد الاقتران الناجح.
على سبيل المثال ، ضع في اعتبارك سيناريو تعبر فيه السلالة المانحة عن مقاومة الأمبيسلين وتنقل ذلك في الحمض النووي المترافق إلى البكتيريا المتلقية ، لكن السلالة المتلقية لديها أيضا جين مقاومة التتراسيكلين غير موجود في المتبرع. في هذه الحالة ، عندما يتم طلاء الخلايا على وسائط LB التي تحتوي على كل من التتراسيكلين والأمبيسلين ، يجب أن تنمو المستعمرات فقط من البكتيريا المترافقة بنجاح ، والتي ستعبر عن كلا النمطين الظاهريين للمقاومة. لتأكيد الاقتران الناجح بشكل أكبر ، يمكن حصاد الحمض النووي البلازميد من هذه المستعمرات ومن ثم يمكن تضخيم جزء من الحمض النووي الخاص بالبلازميد المنقول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). عندما يتم تشغيل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الرحلان الكهربائي جنبا إلى جنب مع سلم من الأحجام القياسية ، يجب أن يكون جزء PCR بحجم معروف مرئيا على الجل ، مما يؤكد الاقتران الناجح. في هذه التجربة ، سيتم استخدام البلازميد لنقل جين مقاومة الأمبيسلين عن طريق الاقتران من سلالة مانحة إلى سلالة متلقية مقاومة للتتراسيكلين. بعد ذلك ، لتأكيد الاقتران ، سيتم تحضين خليط الاقتران على طبق يحتوي على كل من المضادات الحيوية تاركا فقط البكتيريا المحولة. أخيرا ، سيتم تأكيد الاقتران الناجح باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
قبل البدء في الإجراء ، ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات. بعد ذلك ، قم بتعقيم مساحة العمل باستخدام 70٪ من الإيثانول لمسح السطح.
في هذا الإجراء ، سيتم نقل جين مقاومة الأمبيسلين من سلالة WM3064 من الإشريكية القولونية إلى سلالة J53 من الإشريكية القولونية عن طريق الاقتران. السلالة المانحة WM3064 مقاومة للتتراسيكلين والأمبيسلين وتتطلب حمض ديامينوبيميليك ، أو DAP ، للنمو. السلالة المتلقية J53 مقاومة فقط للتتراسيكلين ولا تتطلب DAP للنمو. هذا يعني أن الخلايا المترافقة بنجاح يجب أن تكون مقاومة للتتراسيكلين والأمبيسلين ويمكن أن تنمو بدون DAP.
قم بإعداد ثقافة سلالة المتبرع عن طريق تلقيح خمسة ملليلتر من LB يحتوي على 0.3 ملليمول من DAP بخردة من مخزون الجلسرين المجمد من سلالة المتبرعين. بعد ذلك ، قم بإعداد السلالة المتلقية عن طريق تلقيح خمسة ملليلتر من مرق LB بدون DAP بخردة من مخزون الجلسرين المتلقي المجمد. قم بزراعة هذه الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة في حاضنة اهتزازية. بمجرد أن تنمو الثقافات إلى OD 600 من اثنين ، قم بإزالة مليلتر واحد من الثقافة من كل منهما وضعها في أنبوبين منفصلين جديدين للطرد المركزي 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي هذه الحصص عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق لتكسير الخلايا البكتيرية. تخلص من المادة الطافية واغسل كل حبيبات ب 250 ميكرولتر من 1X PBS. قم بالطرد المركزي للعينات مرة أخرى ، وبعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق كل حبيبات في 500 ميكرولتر من PBS.
لبدء إجراء الاقتران، قم أولا بدمج 50 ميكرولترا من الخلايا المتلقية مع 50 ميكرولترا من الخلايا المانحة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر واخلطه عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل برفق. بعد ذلك ، قم بوضع ماصة 100 ميكرولتر من ثقافة الخلايا المتلقية على صفيحة 1X أخرى من التتراسيكلين تحتوي على DAP. بعد ذلك ، قم بإعداد التحكم السلبي عن طريق سحب 100 ميكرولتر من ثقافة الخلايا المتلقية فقط على صفيحة أجار غير انتقائية تحتوي على DAP. بعد ذلك ، قم باحتضان لوحات الاقتران والتحكم السلبية طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، خذ مكشطة خلية معقمة واحصد الخلايا من لوحة الاقتران عن طريق جمع المستعمرات. بعد ذلك ، انقل المستعمرات إلى أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مليلتر يحتوي على مليلتر واحد من 1X PBS. كرر هذه العملية لجمع الخلايا المتلقية من اللوحة الأخرى.
بعد ذلك ، دوامة العينات لخلطها. بعد الخلط ، انقل الأنابيب إلى جهاز طرد مركزي لتكسير الخلايا برفق. تخلص من المادة الطافية ، ثم اغسل كريات الخلية في مليلتر واحد من PBS وقم بتدوير الأنابيب لإعادة تعليق الخلايا. بيليه الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية مرة أخرى وأعد تعليق كل من كريات الخلية في مليلتر واحد من PBS. الآن ، باستخدام طرف ماصة معقم ، قم بوضع 100 ميكرولتر من خليط خلية تفاعل الاقتران على صفيحة أجار LB بدون DAP تحتوي على 1X tetracycline و 1X أمبيسلين. كرر طريقة الطلاء باستخدام 100 ميكرولتر من تخفيف عشرة أضعاف من نفس خليط الخلية في PBS على لوحة أجار LB أخرى بدون DAP تحتوي على 1X التتراسيكلين و 1X أمبيسلين.
أخيرا، قم بوضع ماصة 100 ميكرولتر من خليط خلايا التحكم السلبية على صفيحة أجار LB واحدة مع 1X التتراسيكلين فقط. بعد الحضانة الليلية عند 37 درجة مئوية ، يجب أن تكون المستعمرات مرئية. باستخدام طرف ماصة معقم ، اختر مستعمرة واحدة من لوحة تفاعل الاقتران وأضفها إلى أنبوب يحتوي على خمسة ملليلتر من وسائط LB الانتقائية التي تحتوي على كل من المضادات الحيوية. ثم كرر عزل المستعمرة عن طريق اختيار مستعمرة واحدة من لوحة الخلية المتلقية. قم بزراعة هذه الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع تهوية عند 220 دورة في الدقيقة.
في اليوم التالي ، امسح سطح المقعد بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بإزالة الألواح من الحاضنة. استخدم مجموعة أدوات إعداد الحمض النووي المصغرة لعزل الحمض النووي عن 4. 5 ملليلتر من كل ثقافة حسب تعليمات الشركة المصنعة. بعد الانتهاء من إعداد الحمض النووي المصغر ، قم بتصفية الحمض النووي باستخدام 35 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز. أخيرا ، استخدم 0 المتبقي. 5 ملليلتر من كل مزرعة لتحضير مخزون واحد من الجلسرين عن طريق إضافة 0.5 مل من الجلسرين بنسبة 100٪ للتخفيف الفردي. ضع هذه الحصص عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين لحين الحاجة.
لتأكيد الاقتران الناجح بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم أولا بإعداد مزيج رئيسي من تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق إضافة 75 ميكرولترا من المزيج الرئيسي 2X PCR إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك ، أضف 7.5 ميكرولتر لكل من برايمر أمامي 10 ميكرومولار وبرايمر عكسي 10 ميكرومولار مصمم لتضخيم جين مقاومة الأمبيسلين من البلازميد. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج رئيسي ثان من تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق إضافة 75 ميكرولترا من المزيج الرئيسي 2X PCR إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق ثم إضافة 7.5 ميكرولتر لكل من 10 ميكرومولار برايمر أمامي و 10 ميكرومولار برايمر عكسي مصمم لتضخيم جين التدبير المنزلي ، في هذه الحالة الحمض النووي جيراز ب.
الآن ، أضف 15 ميكرولترا من المزيج الرئيسي الأول إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ثم أضف 10 نانوغرام ، أي ما يقرب من ميكرولترين من الحمض النووي التجريبي للقالب إلى نفس الأنبوب. ارفع التفاعل إلى الحجم النهائي البالغ 25 ميكرولتر بالماء الخالي من النوكلياز. كرر هذه الخطوات لإنتاج التفاعلات الخمسة المتبقية ، بحيث تحتوي الأنابيب على المكونات الموضحة هنا. الآن ، انقل هذه التفاعلات إلى جهاز تدوير حراري مع تسخين الكتلة مسبقا إلى 98 درجة مئوية ثم ابدأ البرنامج. بعد الانتهاء من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإزالة الأنابيب من الجهاز. بعد ذلك ، قم بتحميل ميكرولترين من كل تفاعل ممزوج بميكرولترين من صبغة التحميل وأربعة ميكرولترات من علامة الوزن الجزيئي في آبار متتالية من هلام الاغاروز بنسبة 1٪. اضبط الجل على 150 فولت لمدة 20 دقيقة. أخيرا ، تصور الجل باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
في هذه التجربة ، تم تأكيد النقل الناجح لجين مقاومة الأمبيسلين عن طريق الاقتران عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). هنا ، يجب ملاحظة ما يقرب من 500 زوج أساسي بحجم الفرقة في البئر التي تحتوي على الحمض النووي المترافق وبادئات الأمبيسلين ، بئر اثنان في هذا المثال. تم تحميل جين التدبير المنزلي ، DNA gyrase B ، في الآبار الثالثة والخامسة مع الحمض النووي المترافق والحمض النووي للخلية المتلقية ، على التوالي. تعمل النطاقات التي لوحظت في هذه الآبار كعنصر تحكم إيجابي لضمان وجود قالب الحمض النووي وأن تفاعل البوليميراز المتسلسل كان ناجحا. لا ينبغي ملاحظة النطاقات في البئر التي تحتوي على تفاعل الحمض النووي للخلية المتلقية وزوج أمبيسيلين التمهيدي ، حسنا أربعة في هذا المثال ، لأن الخلايا المتلقية ليست مقاومة للأمبيسيلين. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي ملاحظة أي نطاقات في التفاعلات التي تفتقر إلى قالب الحمض النووي ، الآبار السادسة والسابعة هنا. إذا تم استيفاء هذه الشروط ، فسيؤكد ذلك النقل الناجح لجين مقاومة الأمبيسلين ، مما يمنح مقاومة الأمبيسلين من سلالة WM3064 من الإشريكية القولونية إلى سلالة J53 من الإشريكية القولونية.
المصدر: ألكسندر س. جولد 1 ، تونيا إم كولبيتس 1
1 قسم علم الأحياء الدقيقة ، كلية الطب بجامعة بوسطن ، المختبرات الوطنية لأمراض العدوى الناشئة ، بوسطن ،…
1. الإعداد
- الأوتوكلاف حوالي 1 لتر من وسط لوريا بيرتاني (LB). سيتم استخدام هذا LB المعقم لصنع ما يقرب من 5 مل من LB يحتوي على 0.3 ملي مولار من حمض ديامينوبيميليك (DAP).
- اجمع اللوحات التالية: ألواح أجار LB مع 1X Tet و 0.3 mM DAP ، وألواح أجار LB مع 1X Tet فقط ، وألواح أجار LB مع 1X أمبير / تيت فقط.
- تأكد من أن بعض الجلسرين وعلبة من أطراف الماصات البلاستيكية المعقمة مسبقا في متناول اليد.
- قبل البدء في أي عمل يتضمن الميكروبات ، قم بتعقيم مساحة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية اللازمة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات.
- بمجرد الانتهاء ، قم بتعقيم جميع الأسطح والقفازات بنسبة 70٪ من الإيثانول واغسل يديك.
2. تحضير سلالة المتبرع والمتلقي
- قم بإعداد 5 مل من المزارع البكتيرية للسلالات المانحة والمتلقية وزراعتها طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة. يجب زراعة السلالة المانحة في LB مع 0.3 ملي مولار DAP.
- قم بتدوير 1 مل من كلتا الثقافتين (~ 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق) واغسل الخلايا باستخدام PBS.
- أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- اجمع بين 50 ميكرولتر من الخلايا المتلقية مع 50 ميكرولتر من الخلايا المانحة في أنبوب طرد مركزي دقيق واخلطه عن طريق سحب العينات.
- احتضان خليط الخلية لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. سيؤدي ذلك إلى تعزيز كفاءة الاقتران قبل وأثناء خطوة الطلاء التالية.
- Pipet 100 ميكرولتر من خليط الخلية على صفيحة أجار مع 1X Tet و 0.3 mM DAP. لا تنتشر على الطبق.
- Pipet 100 ميكرولتر من زراعة الخلايا المتلقية على صفيحة أجار مع 1X Tet و 0.3 mM DAP. لا تنتشر على الطبق.
- احتضان كلا اللوحين طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
- اكشط خليط الخلايا المترافقة وزراعة الخلايا المتلقية باستخدام مكشطة خلية معقمة. انقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المعقم وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من PBS.
- دوامة الخلايا وتدويرها برفق (~ 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق).
- أعد تعليق الخلايا في 1 مل من PBS.
- ضع خليط خلية تفاعل الاقتران على صفيحة أجار LB مع 1X أمبير / تيت فقط. في هذه اللوحة ، من المتوقع أن تنمو فقط البكتيريا المتلقية التي نجحت في الحصول على جين مقاومة Amp عن طريق الاقتران.
- ضع الخلايا المتلقية على لوحة أجار LB باستخدام 1X Tet فقط. في هذه اللوحة ، من المتوقع أن تنمو فقط البكتيريا المتلقية غير المترافقة ، والتي لا تحتوي على جين مقاومة Amp.
- احتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
- اختر مستعمرات مفردة من كلتا اللوحين واستخدمها لزراعة المزارع بين عشية وضحاها في 5 مل من الوسائط (37 درجة مئوية مع تهوية عند 220 دورة في الدقيقة).
- اعزل الحمض النووي من الثقافات المعدة مسبقا باستخدام 4.5 مل من إجمالي حجم المزرعة بواسطة الحمض النووي المصغر.
- للقيام بذلك ، قم بتصفية الحمض النووي باستخدام 35 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
- سيولد الحمض النووي النقي نسبة امتصاص (A260/280) تبلغ حوالي 1.8.
- استخدم 0.5 مل المتبقية من كل مزرعة لتحضير مخزون الجلسرين عن طريق صنع خليط 1: 1 من الثقافة البكتيرية و 100٪ من الجلسرين.
- قم بتخزين مخزون الفريزر عند -80 درجة مئوية.
- قم بإعداد مزيجين رئيسيين من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لكل منهما مجموعة مختلفة من البادئات الأمامية والخلفية ، أحدهما يستهدف 500 قطعة من زوج القاعدة داخل جين مقاومة الأمبيسلين والآخر يستهدف جزءا داخل جين التدبير المنزلي.
- تم تصميم بادئات جينات التدبير المنزلي لتضخيم جزء من الحمض النووي داخل ترميز الجينات البكتيرية ل DNA gyrase B (14).
- تم استخدام أحجام الكاشف التالية لتحضير 90 ميكرولتر من كل مزيج رئيسي:
7.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر برايمر أمامي
7.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر برايمر عكسي
75 ميكرولتر من 2X PCR Master Mix
- قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الستة التالية باستخدام مزيج رئيسي سعة 15 ميكرولتر ، و 10 نانوغرام من قالب الحمض النووي ، والماء الخالي من النوكلياز حتى الحجم النهائي 25 ميكرولتر < br / >
تفاعل الاقتران الحمض النووي وبادئات الأمبيسلين
الحمض النووي لتفاعل الاقتران والبادئات التدبير المنزلي
التحكم السلبي في الحمض النووي وبادئات الأمبيسلين
التحكم السلبي الحمض النووي والبادئات التدبير المنزلي
لا يوجد DNA و ampicillin primers
لا يوجد DNA ومواد أولية للتدبير المنزلي - انقل هذه التفاعلات إلى جهاز PCR مع تسخين الكتلة مسبقا إلى 98 درجة مئوية وابدأ في التدوير الحراري في ظل الظروف التالية:
98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية < / > 25-35 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 5-10 ثوان ، 45-72 درجة مئوية لمدة 10 إلى 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 15-30 ثانية لكل كيلو بايت < / > 72 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق < / > استمر في 4 درجات مئوية - قم بتحميل جميع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الستة على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ وقم بتشغيله عند ~ 150 فولت لمدة 20 دقيقة تقريبا.
- تصور منتج الكمبيوتر باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
الخلايا البكتيرية ، مثل الإشريكية القولونية ، قادرة على نقل المعلومات الجينية من خلية إلى أخرى. يختلف الاقتران عن الآليات الأخرى لنقل الحمض النووي ، مثل التنبيغ أو التحويل ، من حيث أنه يتطلب اتصالا جسديا بين الخلايا.
للمضي قدما ، يتطلب الاقتران خلية مانحة تعبر عن عامل الخصوبة ، أو F ، وخلية متلقية بدونها ، خلية F ناقصة. تتطلب العملية خطوتين. الأول هو إنشاء اتصال مباشر من خلية إلى خلية. للقيام بذلك ، تولد الخلية المانحة بنية خيطية خارج الخلية تسمى pilus الجنسي. سمي بهذا الاسم لأن الاقتران هو شكل من أشكال التزاوج للبكتيريا التي تتكاثر لاجنسيا ، ولكن تجدر الإشارة إلى أنه ليس التكاثر الجنسي الحقيقي حيث لا يتم تبادل الأمشاج ولا يتم تكوين ذرية.
الخطوة الثانية هي تسليم الحمض النووي إلى الخلية المتلقية. بعد أن يقيم الجنس البائس اتصالا بين خليتين ، يتم بناء قناة تسمى نظام إفراز النوع الرابع تسمح بنقل الحمض النووي. تبدأ الخلية المانحة بعد ذلك في تكرار الحمض النووي خارج الكروموسومات الذي سيتم نقله بناء على وجود عنصر وراثي يعرف باسم OriT أو أصل النقل. يتم ربط أحد طرفي الحمض النووي المكرر حديثا في القناة من خلال ربط بروتين الحمض النووي. مع تكرار الحمض النووي بشكل أكبر ، يتم ضخه عبر القناة ، ويتم تسهيله بواسطة مجموعة من البروتينات المشفرة بواسطة الجينات الموجودة بالقرب من OriT. بمجرد نقل الحمض النووي بالكامل ، سيشكل إما بلازميد كروموسومي إضافي ، أو قد يندمج في كروموسوم الخلية المتلقية. أيا كانت نقطة نهاية الحمض النووي المنقول ، سيتم بعد ذلك التعبير عن الجينات التي يشفرها. يمكن استخدام هذا التعبير الجيني لتأكيد الاقتران الناجح.
على سبيل المثال ، ضع في اعتبارك سيناريو تعبر فيه السلالة المانحة عن مقاومة الأمبيسلين وتنقل ذلك في الحمض النووي المترافق إلى البكتيريا المتلقية ، لكن السلالة المتلقية لديها أيضا جين مقاومة التتراسيكلين غير موجود في المتبرع. في هذه الحالة ، عندما يتم طلاء الخلايا على وسائط LB التي تحتوي على كل من التتراسيكلين والأمبيسلين ، يجب أن تنمو المستعمرات فقط من البكتيريا المترافقة بنجاح ، والتي ستعبر عن كلا النمطين الظاهريين للمقاومة. لتأكيد الاقتران الناجح بشكل أكبر ، يمكن حصاد الحمض النووي البلازميد من هذه المستعمرات ومن ثم يمكن تضخيم جزء من الحمض النووي الخاص بالبلازميد المنقول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). عندما يتم تشغيل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الرحلان الكهربائي جنبا إلى جنب مع سلم من الأحجام القياسية ، يجب أن يكون جزء PCR بحجم معروف مرئيا على الجل ، مما يؤكد الاقتران الناجح. في هذه التجربة ، سيتم استخدام البلازميد لنقل جين مقاومة الأمبيسلين عن طريق الاقتران من سلالة مانحة إلى سلالة متلقية مقاومة للتتراسيكلين. بعد ذلك ، لتأكيد الاقتران ، سيتم تحضين خليط الاقتران على طبق يحتوي على كل من المضادات الحيوية تاركا فقط البكتيريا المحولة. أخيرا ، سيتم تأكيد الاقتران الناجح باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
قبل البدء في الإجراء ، ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات. بعد ذلك ، قم بتعقيم مساحة العمل باستخدام 70٪ من الإيثانول لمسح السطح.
في هذا الإجراء ، سيتم نقل جين مقاومة الأمبيسلين من سلالة WM3064 من الإشريكية القولونية إلى سلالة J53 من الإشريكية القولونية عن طريق الاقتران. السلالة المانحة WM3064 مقاومة للتتراسيكلين والأمبيسلين وتتطلب حمض ديامينوبيميليك ، أو DAP ، للنمو. السلالة المتلقية J53 مقاومة فقط للتتراسيكلين ولا تتطلب DAP للنمو. هذا يعني أن الخلايا المترافقة بنجاح يجب أن تكون مقاومة للتتراسيكلين والأمبيسلين ويمكن أن تنمو بدون DAP.
قم بإعداد ثقافة سلالة المتبرع عن طريق تلقيح خمسة ملليلتر من LB يحتوي على 0.3 ملليمول من DAP بخردة من مخزون الجلسرين المجمد من سلالة المتبرعين. بعد ذلك ، قم بإعداد السلالة المتلقية عن طريق تلقيح خمسة ملليلتر من مرق LB بدون DAP بخردة من مخزون الجلسرين المتلقي المجمد. قم بزراعة هذه الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة في حاضنة اهتزازية. بمجرد أن تنمو الثقافات إلى OD 600 من اثنين ، قم بإزالة مليلتر واحد من الثقافة من كل منهما وضعها في أنبوبين منفصلين جديدين للطرد المركزي 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي هذه الحصص عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق لتكسير الخلايا البكتيرية. تخلص من المادة الطافية واغسل كل حبيبات ب 250 ميكرولتر من 1X PBS. قم بالطرد المركزي للعينات مرة أخرى ، وبعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق كل حبيبات في 500 ميكرولتر من PBS.
لبدء إجراء الاقتران، قم أولا بدمج 50 ميكرولترا من الخلايا المتلقية مع 50 ميكرولترا من الخلايا المانحة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر واخلطه عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل برفق. بعد ذلك ، قم بوضع ماصة 100 ميكرولتر من ثقافة الخلايا المتلقية على صفيحة 1X أخرى من التتراسيكلين تحتوي على DAP. بعد ذلك ، قم بإعداد التحكم السلبي عن طريق سحب 100 ميكرولتر من ثقافة الخلايا المتلقية فقط على صفيحة أجار غير انتقائية تحتوي على DAP. بعد ذلك ، قم باحتضان لوحات الاقتران والتحكم السلبية طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، خذ مكشطة خلية معقمة واحصد الخلايا من لوحة الاقتران عن طريق جمع المستعمرات. بعد ذلك ، انقل المستعمرات إلى أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مليلتر يحتوي على مليلتر واحد من 1X PBS. كرر هذه العملية لجمع الخلايا المتلقية من اللوحة الأخرى.
بعد ذلك ، دوامة العينات لخلطها. بعد الخلط ، انقل الأنابيب إلى جهاز طرد مركزي لتكسير الخلايا برفق. تخلص من المادة الطافية ، ثم اغسل كريات الخلية في مليلتر واحد من PBS وقم بتدوير الأنابيب لإعادة تعليق الخلايا. بيليه الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية مرة أخرى وأعد تعليق كل من كريات الخلية في مليلتر واحد من PBS. الآن ، باستخدام طرف ماصة معقم ، قم بوضع 100 ميكرولتر من خليط خلية تفاعل الاقتران على صفيحة أجار LB بدون DAP تحتوي على 1X tetracycline و 1X أمبيسلين. كرر طريقة الطلاء باستخدام 100 ميكرولتر من تخفيف عشرة أضعاف من نفس خليط الخلية في PBS على لوحة أجار LB أخرى بدون DAP تحتوي على 1X التتراسيكلين و 1X أمبيسلين.
أخيرا، قم بوضع ماصة 100 ميكرولتر من خليط خلايا التحكم السلبية على صفيحة أجار LB واحدة مع 1X التتراسيكلين فقط. بعد الحضانة الليلية عند 37 درجة مئوية ، يجب أن تكون المستعمرات مرئية. باستخدام طرف ماصة معقم ، اختر مستعمرة واحدة من لوحة تفاعل الاقتران وأضفها إلى أنبوب يحتوي على خمسة ملليلتر من وسائط LB الانتقائية التي تحتوي على كل من المضادات الحيوية. ثم كرر عزل المستعمرة عن طريق اختيار مستعمرة واحدة من لوحة الخلية المتلقية. قم بزراعة هذه الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع تهوية عند 220 دورة في الدقيقة.
في اليوم التالي ، امسح سطح المقعد بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بإزالة الألواح من الحاضنة. استخدم مجموعة أدوات إعداد الحمض النووي المصغرة لعزل الحمض النووي عن 4. 5 ملليلتر من كل ثقافة حسب تعليمات الشركة المصنعة. بعد الانتهاء من إعداد الحمض النووي المصغر ، قم بتصفية الحمض النووي باستخدام 35 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز. أخيرا ، استخدم 0 المتبقي. 5 ملليلتر من كل مزرعة لتحضير مخزون واحد من الجلسرين عن طريق إضافة 0.5 مل من الجلسرين بنسبة 100٪ للتخفيف الفردي. ضع هذه الحصص عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين لحين الحاجة.
لتأكيد الاقتران الناجح بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم أولا بإعداد مزيج رئيسي من تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق إضافة 75 ميكرولترا من المزيج الرئيسي 2X PCR إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك ، أضف 7.5 ميكرولتر لكل من برايمر أمامي 10 ميكرومولار وبرايمر عكسي 10 ميكرومولار مصمم لتضخيم جين مقاومة الأمبيسلين من البلازميد. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج رئيسي ثان من تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق إضافة 75 ميكرولترا من المزيج الرئيسي 2X PCR إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق ثم إضافة 7.5 ميكرولتر لكل من 10 ميكرومولار برايمر أمامي و 10 ميكرومولار برايمر عكسي مصمم لتضخيم جين التدبير المنزلي ، في هذه الحالة الحمض النووي جيراز ب.
الآن ، أضف 15 ميكرولترا من المزيج الرئيسي الأول إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ثم أضف 10 نانوغرام ، أي ما يقرب من ميكرولترين من الحمض النووي التجريبي للقالب إلى نفس الأنبوب. ارفع التفاعل إلى الحجم النهائي البالغ 25 ميكرولتر بالماء الخالي من النوكلياز. كرر هذه الخطوات لإنتاج التفاعلات الخمسة المتبقية ، بحيث تحتوي الأنابيب على المكونات الموضحة هنا. الآن ، انقل هذه التفاعلات إلى جهاز تدوير حراري مع تسخين الكتلة مسبقا إلى 98 درجة مئوية ثم ابدأ البرنامج. بعد الانتهاء من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإزالة الأنابيب من الجهاز. بعد ذلك ، قم بتحميل ميكرولترين من كل تفاعل ممزوج بميكرولترين من صبغة التحميل وأربعة ميكرولترات من علامة الوزن الجزيئي في آبار متتالية من هلام الاغاروز بنسبة 1٪. اضبط الجل على 150 فولت لمدة 20 دقيقة. أخيرا ، تصور الجل باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
في هذه التجربة ، تم تأكيد النقل الناجح لجين مقاومة الأمبيسلين عن طريق الاقتران عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). هنا ، يجب ملاحظة ما يقرب من 500 زوج أساسي بحجم الفرقة في البئر التي تحتوي على الحمض النووي المترافق وبادئات الأمبيسلين ، بئر اثنان في هذا المثال. تم تحميل جين التدبير المنزلي ، DNA gyrase B ، في الآبار الثالثة والخامسة مع الحمض النووي المترافق والحمض النووي للخلية المتلقية ، على التوالي. تعمل النطاقات التي لوحظت في هذه الآبار كعنصر تحكم إيجابي لضمان وجود قالب الحمض النووي وأن تفاعل البوليميراز المتسلسل كان ناجحا. لا ينبغي ملاحظة النطاقات في البئر التي تحتوي على تفاعل الحمض النووي للخلية المتلقية وزوج أمبيسيلين التمهيدي ، حسنا أربعة في هذا المثال ، لأن الخلايا المتلقية ليست مقاومة للأمبيسيلين. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي ملاحظة أي نطاقات في التفاعلات التي تفتقر إلى قالب الحمض النووي ، الآبار السادسة والسابعة هنا. إذا تم استيفاء هذه الشروط ، فسيؤكد ذلك النقل الناجح لجين مقاومة الأمبيسلين ، مما يمنح مقاومة الأمبيسلين من سلالة WM3064 من الإشريكية القولونية إلى سلالة J53 من الإشريكية القولونية.
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
الخلايا البكتيرية ، مثل الإشريكية القولونية ، قادرة على نقل المعلومات الجينية من خلية إلى أخرى. يختلف الاقتران عن الآليات الأخرى لنقل الحمض النووي ، مثل التنبيغ أو التحويل ، من حيث أنه يتطلب اتصالا جسديا بين الخلايا.
للمضي قدما ، يتطلب الاقتران خلية مانحة تعبر عن عامل الخصوبة ، أو F ، وخلية متلقية بدونها ، خلية F ناقصة. تتطلب العملية خطوتين. الأول هو إنشاء اتصال مباشر من خلية إلى خلية. للقيام بذلك ، تولد الخلية المانحة بنية خيطية خارج الخلية تسمى pilus الجنسي. سمي بهذا الاسم لأن الاقتران هو شكل من أشكال التزاوج للبكتيريا التي تتكاثر لاجنسيا ، ولكن تجدر الإشارة إلى أنه ليس التكاثر الجنسي الحقيقي حيث لا يتم تبادل الأمشاج ولا يتم تكوين ذرية.
الخطوة الثانية هي تسليم الحمض النووي إلى الخلية المتلقية. بعد أن يقيم الجنس البائس اتصالا بين خليتين ، يتم بناء قناة تسمى نظام إفراز النوع الرابع تسمح بنقل الحمض النووي. تبدأ الخلية المانحة بعد ذلك في تكرار الحمض النووي خارج الكروموسومات الذي سيتم نقله بناء على وجود عنصر وراثي يعرف باسم OriT أو أصل النقل. يتم ربط أحد طرفي الحمض النووي المكرر حديثا في القناة من خلال ربط بروتين الحمض النووي. مع تكرار الحمض النووي بشكل أكبر ، يتم ضخه عبر القناة ، ويتم تسهيله بواسطة مجموعة من البروتينات المشفرة بواسطة الجينات الموجودة بالقرب من OriT. بمجرد نقل الحمض النووي بالكامل ، سيشكل إما بلازميد كروموسومي إضافي ، أو قد يندمج في كروموسوم الخلية المتلقية. أيا كانت نقطة نهاية الحمض النووي المنقول ، سيتم بعد ذلك التعبير عن الجينات التي يشفرها. يمكن استخدام هذا التعبير الجيني لتأكيد الاقتران الناجح.
على سبيل المثال ، ضع في اعتبارك سيناريو تعبر فيه السلالة المانحة عن مقاومة الأمبيسلين وتنقل ذلك في الحمض النووي المترافق إلى البكتيريا المتلقية ، لكن السلالة المتلقية لديها أيضا جين مقاومة التتراسيكلين غير موجود في المتبرع. في هذه الحالة ، عندما يتم طلاء الخلايا على وسائط LB التي تحتوي على كل من التتراسيكلين والأمبيسلين ، يجب أن تنمو المستعمرات فقط من البكتيريا المترافقة بنجاح ، والتي ستعبر عن كلا النمطين الظاهريين للمقاومة. لتأكيد الاقتران الناجح بشكل أكبر ، يمكن حصاد الحمض النووي البلازميد من هذه المستعمرات ومن ثم يمكن تضخيم جزء من الحمض النووي الخاص بالبلازميد المنقول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). عندما يتم تشغيل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الرحلان الكهربائي جنبا إلى جنب مع سلم من الأحجام القياسية ، يجب أن يكون جزء PCR بحجم معروف مرئيا على الجل ، مما يؤكد الاقتران الناجح. في هذه التجربة ، سيتم استخدام البلازميد لنقل جين مقاومة الأمبيسلين عن طريق الاقتران من سلالة مانحة إلى سلالة متلقية مقاومة للتتراسيكلين. بعد ذلك ، لتأكيد الاقتران ، سيتم تحضين خليط الاقتران على طبق يحتوي على كل من المضادات الحيوية تاركا فقط البكتيريا المحولة. أخيرا ، سيتم تأكيد الاقتران الناجح باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
قبل البدء في الإجراء ، ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات. بعد ذلك ، قم بتعقيم مساحة العمل باستخدام 70٪ من الإيثانول لمسح السطح.
في هذا الإجراء ، سيتم نقل جين مقاومة الأمبيسلين من سلالة WM3064 من الإشريكية القولونية إلى سلالة J53 من الإشريكية القولونية عن طريق الاقتران. السلالة المانحة WM3064 مقاومة للتتراسيكلين والأمبيسلين وتتطلب حمض ديامينوبيميليك ، أو DAP ، للنمو. السلالة المتلقية J53 مقاومة فقط للتتراسيكلين ولا تتطلب DAP للنمو. هذا يعني أن الخلايا المترافقة بنجاح يجب أن تكون مقاومة للتتراسيكلين والأمبيسلين ويمكن أن تنمو بدون DAP.
قم بإعداد ثقافة سلالة المتبرع عن طريق تلقيح خمسة ملليلتر من LB يحتوي على 0.3 ملليمول من DAP بخردة من مخزون الجلسرين المجمد من سلالة المتبرعين. بعد ذلك ، قم بإعداد السلالة المتلقية عن طريق تلقيح خمسة ملليلتر من مرق LB بدون DAP بخردة من مخزون الجلسرين المتلقي المجمد. قم بزراعة هذه الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة في حاضنة اهتزازية. بمجرد أن تنمو الثقافات إلى OD 600 من اثنين ، قم بإزالة مليلتر واحد من الثقافة من كل منهما وضعها في أنبوبين منفصلين جديدين للطرد المركزي 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي هذه الحصص عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق لتكسير الخلايا البكتيرية. تخلص من المادة الطافية واغسل كل حبيبات ب 250 ميكرولتر من 1X PBS. قم بالطرد المركزي للعينات مرة أخرى ، وبعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق كل حبيبات في 500 ميكرولتر من PBS.
لبدء إجراء الاقتران، قم أولا بدمج 50 ميكرولترا من الخلايا المتلقية مع 50 ميكرولترا من الخلايا المانحة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر واخلطه عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل برفق. بعد ذلك ، قم بوضع ماصة 100 ميكرولتر من ثقافة الخلايا المتلقية على صفيحة 1X أخرى من التتراسيكلين تحتوي على DAP. بعد ذلك ، قم بإعداد التحكم السلبي عن طريق سحب 100 ميكرولتر من ثقافة الخلايا المتلقية فقط على صفيحة أجار غير انتقائية تحتوي على DAP. بعد ذلك ، قم باحتضان لوحات الاقتران والتحكم السلبية طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، خذ مكشطة خلية معقمة واحصد الخلايا من لوحة الاقتران عن طريق جمع المستعمرات. بعد ذلك ، انقل المستعمرات إلى أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مليلتر يحتوي على مليلتر واحد من 1X PBS. كرر هذه العملية لجمع الخلايا المتلقية من اللوحة الأخرى.
بعد ذلك ، دوامة العينات لخلطها. بعد الخلط ، انقل الأنابيب إلى جهاز طرد مركزي لتكسير الخلايا برفق. تخلص من المادة الطافية ، ثم اغسل كريات الخلية في مليلتر واحد من PBS وقم بتدوير الأنابيب لإعادة تعليق الخلايا. بيليه الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية مرة أخرى وأعد تعليق كل من كريات الخلية في مليلتر واحد من PBS. الآن ، باستخدام طرف ماصة معقم ، قم بوضع 100 ميكرولتر من خليط خلية تفاعل الاقتران على صفيحة أجار LB بدون DAP تحتوي على 1X tetracycline و 1X أمبيسلين. كرر طريقة الطلاء باستخدام 100 ميكرولتر من تخفيف عشرة أضعاف من نفس خليط الخلية في PBS على لوحة أجار LB أخرى بدون DAP تحتوي على 1X التتراسيكلين و 1X أمبيسلين.
أخيرا، قم بوضع ماصة 100 ميكرولتر من خليط خلايا التحكم السلبية على صفيحة أجار LB واحدة مع 1X التتراسيكلين فقط. بعد الحضانة الليلية عند 37 درجة مئوية ، يجب أن تكون المستعمرات مرئية. باستخدام طرف ماصة معقم ، اختر مستعمرة واحدة من لوحة تفاعل الاقتران وأضفها إلى أنبوب يحتوي على خمسة ملليلتر من وسائط LB الانتقائية التي تحتوي على كل من المضادات الحيوية. ثم كرر عزل المستعمرة عن طريق اختيار مستعمرة واحدة من لوحة الخلية المتلقية. قم بزراعة هذه الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع تهوية عند 220 دورة في الدقيقة.
في اليوم التالي ، امسح سطح المقعد بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بإزالة الألواح من الحاضنة. استخدم مجموعة أدوات إعداد الحمض النووي المصغرة لعزل الحمض النووي عن 4. 5 ملليلتر من كل ثقافة حسب تعليمات الشركة المصنعة. بعد الانتهاء من إعداد الحمض النووي المصغر ، قم بتصفية الحمض النووي باستخدام 35 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز. أخيرا ، استخدم 0 المتبقي. 5 ملليلتر من كل مزرعة لتحضير مخزون واحد من الجلسرين عن طريق إضافة 0.5 مل من الجلسرين بنسبة 100٪ للتخفيف الفردي. ضع هذه الحصص عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين لحين الحاجة.
لتأكيد الاقتران الناجح بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم أولا بإعداد مزيج رئيسي من تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق إضافة 75 ميكرولترا من المزيج الرئيسي 2X PCR إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك ، أضف 7.5 ميكرولتر لكل من برايمر أمامي 10 ميكرومولار وبرايمر عكسي 10 ميكرومولار مصمم لتضخيم جين مقاومة الأمبيسلين من البلازميد. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج رئيسي ثان من تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق إضافة 75 ميكرولترا من المزيج الرئيسي 2X PCR إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق ثم إضافة 7.5 ميكرولتر لكل من 10 ميكرومولار برايمر أمامي و 10 ميكرومولار برايمر عكسي مصمم لتضخيم جين التدبير المنزلي ، في هذه الحالة DNA gyrase B.
الآن ، أضف 15 ميكرولترا من المزيج الرئيسي الأول إلى أنبوب PCR ثم أضف 10 نانوجرام ، ما يقرب من اثنين من ميكرولتر من قالب الحمض النووي التجريبي إلى نفس الأنبوب. ارفع التفاعل إلى الحجم النهائي البالغ 25 ميكرولتر بالماء الخالي من النوكلياز. كرر هذه الخطوات لإنتاج التفاعلات الخمسة المتبقية ، بحيث تحتوي الأنابيب على المكونات الموضحة هنا. الآن ، انقل هذه التفاعلات إلى جهاز تدوير حراري مع تسخين الكتلة مسبقا إلى 98 درجة مئوية ثم ابدأ البرنامج. بعد الانتهاء من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإزالة الأنابيب من الجهاز. بعد ذلك ، قم بتحميل ميكرولترين من كل تفاعل ممزوج بميكرولترين من صبغة التحميل وأربعة ميكرولترات من علامة الوزن الجزيئي في آبار متتالية من هلام الاغاروز بنسبة 1٪. اضبط الجل على 150 فولت لمدة 20 دقيقة. أخيرا ، تصور الجل باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
في هذه التجربة ، تم تأكيد النقل الناجح لجين مقاومة الأمبيسلين عن طريق الاقتران عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). هنا ، يجب ملاحظة ما يقرب من 500 زوج أساسي بحجم الفرقة في البئر التي تحتوي على الحمض النووي المترافق وبادئات الأمبيسلين ، بئر اثنان في هذا المثال. تم تحميل جين التدبير المنزلي ، DNA gyrase B ، في الآبار الثالثة والخامسة مع الحمض النووي المترافق والحمض النووي للخلية المتلقية ، على التوالي. تعمل النطاقات التي لوحظت في هذه الآبار كعنصر تحكم إيجابي لضمان وجود قالب الحمض النووي وأن تفاعل البوليميراز المتسلسل كان ناجحا. لا ينبغي ملاحظة النطاقات في البئر التي تحتوي على تفاعل الحمض النووي للخلية المتلقية وزوج أمبيسيلين التمهيدي ، حسنا أربعة في هذا المثال ، لأن الخلايا المتلقية ليست مقاومة للأمبيسيلين. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي ملاحظة أي نطاقات في التفاعلات التي تفتقر إلى قالب الحمض النووي ، الآبار السادسة والسابعة هنا. إذا تم استيفاء هذه الشروط ، فسيؤكد ذلك النقل الناجح لجين مقاومة الأمبيسلين ، مما يمنح مقاومة الأمبيسلين من سلالة WM3064 من الإشريكية القولونية إلى سلالة J53 من الإشريكية القولونية.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the sex pilus and what role does it play in bacterial conjugation?
The sex pilus is an extracellular filamentous structure generated by the donor cell to establish direct cell-to-cell contact with the recipient cell. This physical contact is essential for conjugation to proceed. The sex pilus is encoded by the F (fertility) factor and serves as the initial bridge between donor and recipient cells before DNA transfer begins.
Q2: How does the Type IV secretion system facilitate DNA transfer during conjugation?
After the sex pilus establishes contact, a conduit called the Type IV secretion system is built between the two cells. This multiprotein complex allows DNA to be actively transported from the donor to the recipient. The system works with coupling proteins to pump replicated DNA through the channel, enabling the transfer of genetic material encoding traits like ampicillin resistance.
Q3: Why is selective plating used to confirm successful conjugation in this experiment?
Selective plating uses antibiotics to isolate only successfully conjugated cells. The donor strain requires diaminopimelic acid (DAP) to survive, while the recipient lacks ampicillin resistance. Plating on media with both tetracycline and ampicillin without DAP eliminates donor cells and non-conjugated recipients, leaving only recipient cells that acquired ampicillin resistance through conjugation.
Q4: What is the origin of transfer (OriT) and why is it important for conjugation?
The origin of transfer (OriT) is a genetic element on the plasmid that signals where DNA replication and transfer should begin. A relaxase enzyme cleaves at the nic site within the OriT sequence and covalently attaches to the DNA strand, initiating the formation of the relaxosome complex. This complex is essential for directing which DNA gets replicated and transferred to the recipient cell.
Q5: How does PCR confirm the successful transfer of ampicillin resistance genes?
PCR amplifies a specific DNA sequence from the transferred plasmid using primers designed for the ampicillin resistance gene. Successfully conjugated cells contain this gene and produce a visible band of known size on an agarose gel. A housekeeping gene serves as a positive control, while recipient-only DNA should show no amplification, confirming the resistance gene was successfully transferred.
Q6: How does conjugation differ from other bacterial DNA transfer mechanisms?
Conjugation requires direct physical contact between donor and recipient cells through the sex pilus, unlike transduction or transformation. It is unidirectional, with DNA flowing from donor to recipient, and naturally occurs in bacteria. This process has contributed to the spread of antibiotic resistance and can be manipulated in laboratory settings using selective pressures for horizontal gene transfer.
Q7: What happens to transferred DNA once it enters the recipient cell?
Once transferred, the DNA can either form an extrachromosomal plasmid or integrate into the recipient cell's chromosome. Regardless of its final location, the genes encoded on the transferred DNA are then expressed in the recipient cell. This gene expression produces the new phenotype, such as ampicillin resistance, which can be detected through selective plating or PCR analysis.
الفصول في هذا الفيديو
0:01
Concepts
3:53
Preparation of Donor and Recipient Strains
6:01
Conjugation
9:27
Data Analysis by Polymerase Chain Reaction (PCR)
11:29
Results