نقل العاثيات: طريقة لنقل مقاومة الأمبيسلين من المتبرع إلى المتلقي بكتريا قولونية
المصدر: ألكسندر س. جولد 1 ، تونيا إم كولبيتس 1
1 قسم علم الأحياء الدقيقة ، كلية الطب بجامعة بوسطن ، المختبرات الوطنية لأمراض العدوى الناشئة ، بوسطن ،…
1. الإعداد
- قبل البدء في أي عمل يتضمن ميكروبات ، قم بتعقيم مساحة العمل باستخدام 70٪ من الإيثانول. استخدم دائما معدات الوقاية الشخصية اللازمة (معطف المختبر والقفازات).
- تأكد من أن ألواح أجار LB التي تحتوي على 1x أمبيسلين، ومحلول محللة العاثية P1 المتوفر تجاريا، والكلوروفورم، وسيترات الصوديوم 1 M، والجلسرين، وعلبة من أطراف الماصات البلاستيكية المعقمة مسبقا وموزعات الخلايا في متناول اليد.
- قم بإعداد LB معقم عن طريق التعقيم واستخدمه لعمل ثلاث أجزاء من محلول ملح LB سعة 1 مل
- ملي مولار MgCl2 (952.11-2.3803 ميكروغرام) ، 5 ملي CaCl2 (11.098 مجم) ، 0.1-0.2٪ جلوكوز (100-200 ميكروجرام)
- ملي مولار MgSO4 (12.0366 مجم) ، 5 ملي كلوريدالكالسيوم 2 (11.098 مجم)
- ملي مولار سترات الصوديوم (25.806 مجم)
- بمجرد الانتهاء ، قم بتعقيم جميع الأسطح وكذلك القفازات بنسبة 70٪ من الإيثانول وغسل اليدين.
2. بروتوكول
- تحضير محلول العاثية المانحة
- قم بإعداد 1 مل من المتبرع W3110 سلالة الإشريكية القولونية في LB مع 1x أمبيسلين ينمو طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع تهوية واهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
- خفف هذه المزرعة الليلية 1: 100 في 1 مل من LB الطازج المكملة ب 10-25 ملي MgCl2 و 5 ملي CaCl2 و 0.1-0.2٪ جلوكوز.
- قم بزراعة هذا التخفيف البكتيري عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
- بمجرد أن تصل هذه الخلايا إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المبكرة (نمو ملحوظ وعكارة طفيفة) ، أضف 40 ميكرولتر من العاثية P1 المتوفرة تجاريا واتركها عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
- قبل إضافة العاثيات ، يجب أن تكون الكثافة البصرية المقاسة عند 600 نانومتر من هذه الخلايا حوالي 0.4 (6).
- راقب الخلايا لمدة 1-3 ساعات حتى تتحلل المزرعة.
- سيؤدي التحلل إلى زيادة الحطام الخلوي بالإضافة إلى انخفاض ملحوظ في التعكر (أي سيتم اعتبار الخلايا محللة بمجرد أن يتمكن المرء من الرؤية من خلال المزرعة).
- أضف عدة قطرات (50-100 ميكرولتر) من الكلوروفورم إلى المحللة واخلطها عن طريق الدوامة.
- يقوم الكلوروفورم بتعقيم محللة العاثية عن طريق قتل أي خلايا مانحة متبقية ، تاركا العاثية فقط ويزيد من عيار هذا المحلل.
تعمل - أجهزة الطرد المركزي على تحلل 14,000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين لإزالة الحطام ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
- أضف بضع قطرات من الكلوروفورم واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن يوم واحد.
- التنبيغ
- قم بإعداد مزرعة 1 مل من سلالة J53 المتلقية E. coli المزروعة بين عشية وضحاها في LB عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
- انقل 100 ميكرولتر من محللة العاثية المانحة (2.1) إلى أنبوب ميكروفيج سعة 1.5 مل واحتضانه مع غطاء مفتوح عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تسمح هذه الحضانة بتبخر أي كلوروفورم متبقي في محلول محللة P1 قبل إضافته إلى الخلايا المتلقية.
قم بتنظيف - خلايا سلالة الحبيبات المتلقية برفق عن طريق الطرد المركزي عند 6,000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- أعد تعليق هذه الخلايا في 300 ميكرولتر من LB الطازج الذي يحتوي على 100 ملي ملي MgSO4 و 5 ملي CaCl2. (تتطلب العاثية P1 أن يكون الكالسيوم معديا).
- قم بإعداد تفاعلين باستخدام خلايا البكتيريا المتلقية ومحللة العاثية المانحة المحضرة: 1) تفاعل التنبيغ الذي يجمع بين 100 ميكرولتر من سلالة J53 المتلقية الإشريكية القولونية و 100 ميكرولتر من محللة العاثية المانحة ، و 2) التحكم السلبي الذي يجمع بين 100 ميكرولتر من سلالة J53 المتلقية بكتريا قولونية و 100 ميكرولتر من LB تحتوي على 100 ملي مولار MgSO4 و 5 ملي مولار كلوريدالهواء 2.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
- أضف 1 مل رطل و 200 ميكرولتر 1 متر سترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني = 5.5) واحتضنه لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
- يستخدم السترات لتقليل عدوى P1 عن طريق مخلب الكالسيوم ، مما يمنع تحلل البكتيريا المتلقية. يسمح
- حضانة هذا المحلول بالتعبير عن علامة مقاومة الأمبيسيلين.
- خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 6,000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- أعد تعليق كريات الخلايا في 100 ميكرولتر من LB مع 100 ملي مولار سترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.5). الحل الكامل للدوامة واللوحة لكلا التفاعلين على لوحين من ألواح أجار LB.
- يجب أن تحتوي لوحة LB على 1x أمبير للعينة المنقولة ولا يوجد أمبير للتحكم السلبي.
- يتطلب تلوث العاثيات P1 على هذه اللوحة إعادة الخطوط قبل تحضير مخزون الفريزر.
- إذا لم تتم إزالة العاثية ، فلن تنمو الثقافات المزروعة من هذه المستعمرات إلا في وجود مخلب الكالسيوم.
- اختر حوالي 3-4 مستعمرات من كلا اللوحين وخطها مرة أخرى على لوحين أجار LB موزعين على 100 ميكرولتر من سترات الصوديوم 1 M (الرقم الهيدروجيني = 5.5).
- يجب أن تحتوي لوحة LB على 1x أمبير للعينة المنقولة ولا يوجد أمبير للتحكم السلبي.
- احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية طوال الليل للسماح للمستعمرات الخالية من العاثيات بالنمو.
- اختر المستعمرات من كلا اللوحين واستخدمها لزراعة المزارع بين عشية وضحاها في 5 مل من LB عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
- اعزل الحمض النووي من هذه الثقافات عن طريق تحضير الحمض النووي المصغر باستخدام 4.5 مل من إجمالي حجم الثقافة.
- حمض نووي باستخدام 35 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
- قم بقياس التركيز الناتج بواسطة Nanodrop. سيولد الحمض النووي النقي نسبة امتصاص (A260/280) تبلغ حوالي 1.8.
- استخدم 0.5 مل المتبقية من كل مزرعة لتحضير 1 مل من مخزون الجلسرين عن طريق صنع خليط 1: 1 من الجلسرين بنسبة 100٪ والثقافة البكتيرية.
- قم بتخزين مخزون الجلسرين البكتيري عند -80 درجة مئوية.
- تأكيد التحويل بواسطة qPCR
- قم بإعداد مزيجين رئيسيين من qPCR لستة تفاعلات qPCR ، ثلاثة باستخدام بادئات qPCR لجين مقاومة الأمبيسلين ، والثلاثة الأخرى باستخدام بادئات qPCR لجين التدبير المنزلي (14.5 ميكرولتر لكل تفاعل): 12.5 ميكرولتر مزيج عازلة qPCR + 1 ميكرولتر برايمر أمامي + 1 ميكرولتر برايمر عكسي.
- في هذه التجربة ، استخدمنا مزيج SYBR Green الرئيسي.
- تم تصميم بادئات جينات التدبير المنزلي لتضخيم جزء من الحمض النووي داخل ترميز الجين البكتيري ل DNA gyrase B (7).
- لكل تفاعل qPCR ، اجمع 100 ميكروغرام من الحمض النووي من كل تفاعل (10.5 ميكرولتر) مع 14.5 ميكرولتر من مزيج qPCR الرئيسي.
- باستخدام جهاز qPCR وبروتوكول التدوير الحراري المدرج في الجدول 1 ، تم قياس التضخيم لمقاومة الأمبيسلين وجينات التدبير المنزلي لجميع التفاعلات الستة.
- تم استخدام قيم Cq الناتجة عن qPCR لحساب كفاءة النقل الطبيعية لجين مقاومة الأمبيسلين (الشكل 3) ، مما يؤكد النقل الناجح لجين مقاومة الأمبيسلين.
- قيمة Cq ، أو قيمة القياس الكمي للدورة ، للعينة هي أقدم رقم دورة PCR يتم عنده اكتشاف إشارة تجاوزت عتبة الخلفية. تتوافق قيم Cq المنخفضة مع المزيد من التسلسل المستهدف ، والعكس صحيح.
- يمكن حساب كفاءة التنبيغ الطبيعية للجين داخل العينة باستخدام قيم Cq هذه عن طريق طرح قيمة جين التدبير المنزلي من قيمة الجين المستهدف ، مما يولد قيمة ΔCq ، والتي يمكن استخدامها لحساب كفاءة التحويل الطبيعية بمقدار 2 (-ΔCq).
- قم بإعداد مزيجين رئيسيين من qPCR لستة تفاعلات qPCR ، ثلاثة باستخدام بادئات qPCR لجين مقاومة الأمبيسلين ، والثلاثة الأخرى باستخدام بادئات qPCR لجين التدبير المنزلي (14.5 ميكرولتر لكل تفاعل): 12.5 ميكرولتر مزيج عازلة qPCR + 1 ميكرولتر برايمر أمامي + 1 ميكرولتر برايمر عكسي.
الجدول 1: بروتوكول التدوير الحراري qPCR
يمكن للبكتيريا أن تتكيف بسرعة مع بيئة سريعة التغير عن طريق تبادل المواد الوراثية وإحدى الطرق التي يمكنهم من خلالها القيام بذلك هي عن طريق التنبيغ ، وتبادل المواد الوراثية بوساطة الفيروسات البكتيرية. العاثية ، التي غالبا ما يتم اختصارها إلى العاثية ، هي نوع من الفيروسات التي تصيب البكتيريا عن طريق الالتصاق أولا بسطح المضيف ثم حقن الحمض النووي الخاص بها في الخلية البكتيرية. ثم يحط الحمض النووي للخلية المضيفة ويكرر جينومها الفيروسي ، بينما يختطف آلية الخلية لتصنيع العديد من نسخ بروتيناتها. ثم تقوم بروتينات العاثيات هذه بتجميع جينومات العاثيات ذاتيا وتعبئتها لتشكيل ذرية متعددة. ومع ذلك ، نظرا لانخفاض دقة آلية تغليف الحمض النووي ، في بعض الأحيان ، تقوم العاثيات بتعبئة شظايا من الحمض النووي البكتيري في قفيصة العاثية. بعد إحداث تحلل المضيف ، يتم إطلاق ذرية العاثية ، وبمجرد أن تصيب هذه العاثية خلية مضيفة أخرى ، فإنها تنقل جزء الحمض النووي لمضيفها السابق. يمكن بعد ذلك إعادة تجميع هذا ودمجه بشكل دائم في كروموسوم المضيف الجديد ، وبالتالي التوسط في نقل الجينات بين البكتيريا.
يتطلب إجراء نقل العاثيات في المختبر سلالة مانحة تحتوي على جين ذي أهمية ، وسلالة متلقية تفتقر إليها ، وعاثية يمكن أن تصيب كلتا السلالتين ، وطريقة لاختيار البكتيريا المنقولة. في معظم الحالات ، سيكون هذا وسط نمو صلب انتقائي يدعم نمو البكتيريا المنقولة ولكنه يمنع نمو البكتيريا غير المنقولة. للبدء ، يتم زراعة السلالة المانحة التي تحتوي على الجين محل الاهتمام في وسط نمو سائل. عندما تنقسم جميع البكتيريا بنشاط في مرحلة السجل من نموها ، يتم تلقيح الثقافة بالعاثية المستهدفة. بعد ثلاث إلى أربع ساعات من الحضانة ، عندما تقوم جميع البكتيريا تقريبا بتحلل جزيئات العاثيات وإطلاقها ، يتم تلقيح محللة العاثية المانحة في مزرعة حديثة النمو للسلالة البكتيرية المتلقية. بعد حضانة قصيرة مدتها ساعة واحدة ، يجب أن تحتوي المزرعة الآن على مزيج من الخلايا البكتيرية المنقولة وغير المنقولة ويتم فحصها بحثا عن الخلايا المنقولة عن طريق نشر جزء من المعلق على وسط نمو صلب انتقائي مناسب. عند مزيد من الحضانة ، يجب أن تنمو الخلايا المنقولة وتتكاثر لإنتاج مستعمرات مرئية. يمكن بعد ذلك اختيار هذه المستعمرات لمزيد من التحليل باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق لتأكيد التحويل الناجح بشكل أكبر ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة أو تسلسل الحمض النووي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.
قبل البدء في الإجراء ، ارتد أي معدات حماية شخصية مناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات. بعد ذلك ، قم بتعقيم مساحة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسح السطح.
بعد ذلك ، قم بإعداد ثلاثة أجزاء من مليلتر واحد من محلول ملح LB. الآن ، قم بإعداد ثقافة سلالة المتبرع عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من الإشريكية القولونية إلى قارورة مخروطية سعة 15 مليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من وسط نمو LB مع 500 ميكروغرام من الأمبيسلين. بعد ذلك ، قم بزراعة الثقافة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، امسح سطح المقعد بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل إزالة المزرعة من حاضنة الاهتزاز. بعد ذلك ، قم بتخفيف الثقافة الليلية من واحد إلى 100 عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من سلالة المتبرع إلى 990 ميكرولتر من LB الطازج المكمل بمحلول الملح.
اترك التخفيف البكتيري ينمو عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة. بمجرد وصول الخلايا إلى مرحلة السجل المبكرة ، قم بإزالة المزرعة من الحاضنة ، وأضف 40 ميكرولترا من العاثية P1 إلى المزرعة واحتضانها مرة أخرى. استمر في مراقبة الخلايا لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات حتى تتحلل المزرعة. بعد ذلك ، أضف 50 إلى 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى المحللة واخلطها عن طريق الدوامة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحللات لإزالة الحطام ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. أضف بضع قطرات من الكلوروفورم إلى المادة الطافية وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة لا تزيد عن يوم واحد.
لبدء إجراء التنبيغ ، احصل على ثقافة مليلتر واحد من السلالة المتلقية. بعد ذلك ، قم بنقل 100 ميكرولتر من محللة العاثيات المانحة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع فتح الغطاء لمدة 30 دقيقة للسماح لأي كلوروفورم متبقي بالتبخر. بينما تحتضن العاثية المانحة ، قم بتكبيل خلايا سلالة المتلقي عن طريق الطرد المركزي اللطيف. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من LB الطازج الذي يحتوي على 100 مللي مولار من كبريتات المغنيسيوم وخمسة مللي مولار من كلوريد الكالسيوم.
بعد ذلك ، قم بإعداد تفاعل التحويل عن طريق الجمع بين 100 ميكرولتر من السلالة المتلقية و 100 ميكرولتر من محللة العاثية المانحة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك ، قم بإعداد التحكم السلبي عن طريق الجمع بين 100 ميكرولتر من السلالة المتلقية و 100 ميكرولتر من LB مع كبريتات المغنيسيوم وكلوريد الكالسيوم. بعد الحضانة ، أضف 200 ميكرولتر من سترات الصوديوم المولية ومليلتر واحد من LB إلى كلا الأنبوبين ، واخلطهم عن طريق الماصة برفق لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، بعد احتضان الأنابيب لمدة ساعة ، قم بتقطيع الخلايا برفق عن طريق الطرد المركزي.
بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا المحببة في 100 ميكرولتر من LB مع 100 مللي مولر سترات الصوديوم. قم بتدوير المحاليل وماصة العينة المنقولة بالكامل على صفيحة أجار LB مع 1X أمبيسلين. أخيرا، قم بوضع الماصة بالكامل لخليط خلايا التحكم السالبة على صفيحة أجار LB بدون أمبيسلين. بعد احتضان الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، استخدم طرف ماصة معقمة لاختيار ثلاث إلى أربع مستعمرات من لوحة التحويل وخطها على صفيحة أجار LB جديدة تحتوي على 1X أمبيسلين و 100 ميكرولتر من سترات الصوديوم المولارية. كرر طريقة الطلاء هذه للتحكم السلبي على لوحة أجار LB أخرى تحتوي على 100 ميكرولتر فقط من سترات الصوديوم المولارية. بعد ذلك ، احتضن الصفائح عند 37 درجة مئوية طوال الليل للسماح للمستعمرات الخالية من العاثيات بالنمو.
في اليوم التالي ، امسح سطح المقعد بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل إزالة الأطباق من الحاضنة. باستخدام طرف ماصة معقم ، اختر ثلاث مستعمرات من لوحة التنبيغ وأضفها إلى أنبوب منفصل يحتوي على خمسة ملليلتر من وسائط LB. بعد ذلك ، حدد ثلاث مستعمرات من لوحة التحكم السلبية وأضفها إلى أنبوب آخر يحتوي على خمسة ملليلتر من وسائط LB. قم بزراعة الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة. بعد تعقيم سطح المقعد كما هو موضح سابقا ، استخدم مجموعة أدوات التحضير المصغرة للحمض النووي لعزل الحمض النووي من 4.5 مل من كل مزرعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بمسح الحمض النووي ب 35 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز وقم بقياس التركيز الناتج بواسطة مقياس الطيف الضوئي المختبري. أخيرا ، قم بإعداد مخزون الجلسرين عن طريق إضافة 0.5 مل المتبقية من كلا المحاليل البكتيرية إلى 0.5 مل من الجلسرين بنسبة 100٪.
لتأكيد التنبيغ ، قم أولا بإعداد مزيجين رئيسيين من qPCR ل 24 تفاعل qPCR. بالنسبة للمزيج الرئيسي الأول ، أضف 150 ميكرولترا من مزيج المخزن المؤقت qPCR إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق و 12 ميكرولترا لكل من برايمر أمامي وعكسي مصمم لتضخيم جين مقاومة الأمبيسلين. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج qPCR الرئيسي الثاني عن طريق إضافة 150 ميكرولترا من مزيج qPCR الرئيسي إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق ثم إضافة 12 ميكرولترا لكل من التمهيدي الأمامي والتمهيدي العكسي المصمم لتضخيم جين التدبير المنزلي.
لكل تفاعل qPCR ، اجمع بين 100 ميكروغرام من الحمض النووي التجريبي من كل تفاعل مع 14.5 ميكرولتر من مزيج qPCR الرئيسي. الآن ، قم بإعداد ردود الفعل المتبقية كما هو موضح سابقا. انقل التفاعلات إلى جهاز تدوير حراري مسخن مسبقا إلى 94 درجة مئوية ثم ابدأ البرنامج. أخيرا ، استخدم التقدير الكمي للدورة ، أو Cq ، القيم التي تم إنشاؤها بواسطة qPCR لحساب كفاءة التنبيغ الطبيعية لجين مقاومة الأمبيسلين.
تم جدولة قيم الكمية للدورة ، أو Cq ، للجينات ذات الأهمية لكل من الضوابط السلبية والعينات المنقولة. تشير قيم Cq المنخفضة ، عادة أقل من 29 دورة ، مثل العينات المحولة في هذا المثال إلى كميات عالية من التسلسل المستهدف.
يتماستخدام جين التدبير المنزلي ، الذي تم جدولته هنا أيضا ، كعنصر تحكم في التحميل لتطبيع كمية الحمض النووي في كل تفاعل وكعنصر تحكم إيجابي لضمان عمل qPCR. شريطة تحميل نفس الكميات من جين التدبير المنزلي ، يتم العثور عليه بنفس المعدل نسبيا في كل عينة.
بعد ذلك ، لحساب قيمة دلتا Cq لكل عينة ، اطرح قيمة Cq لجين التدبير المنزلي لكل عينة من قيمة Cq للجين المستهدف المقابل لها. على سبيل المثال ، دلتا Cq لعنصر التحكم السلبي الأول هو 13.54. بعد ذلك، استخدم هذه القيمة لحساب كفاءة التحويل الطبيعية لكل عينة باستخدام الصيغة الموضحة هنا. أخيرا ، يمكن حساب متوسط كفاءة التحويل الطبيعي لكل مجموعة عينة.
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
يمكن للبكتيريا أن تتكيف بسرعة مع بيئة سريعة التغير عن طريق تبادل المواد الوراثية وإحدى الطرق التي يمكنهم من خلالها القيام بذلك هي عن طريق التنبيغ ، وتبادل المواد الوراثية بوساطة الفيروسات البكتيرية. العاثية ، التي غالبا ما يتم اختصارها إلى العاثية ، هي نوع من الفيروسات التي تصيب البكتيريا عن طريق الالتصاق أولا بسطح المضيف ثم حقن الحمض النووي الخاص بها في الخلية البكتيرية. ثم يحط الحمض النووي للخلية المضيفة ويكرر جينومها الفيروسي ، بينما يختطف آلية الخلية لتصنيع العديد من نسخ بروتيناتها. ثم تقوم بروتينات العاثيات هذه بتجميع جينومات العاثيات ذاتيا وتعبئتها لتشكيل ذرية متعددة. ومع ذلك ، نظرا لانخفاض دقة آلية تغليف الحمض النووي ، في بعض الأحيان ، تقوم العاثيات بتعبئة شظايا من الحمض النووي البكتيري في قفيصة العاثية. بعد إحداث تحلل المضيف ، يتم إطلاق ذرية العاثية ، وبمجرد أن تصيب هذه العاثية خلية مضيفة أخرى ، فإنها تنقل جزء الحمض النووي لمضيفها السابق. يمكن بعد ذلك إعادة تجميع هذا ودمجه بشكل دائم في كروموسوم المضيف الجديد ، وبالتالي التوسط في نقل الجينات بين البكتيريا.
يتطلب إجراء نقل العاثيات في المختبر سلالة مانحة تحتوي على جين ذي أهمية ، وسلالة متلقية تفتقر إليها ، وعاثية يمكن أن تصيب كلتا السلالتين ، وطريقة لاختيار البكتيريا المنقولة. في معظم الحالات ، سيكون هذا وسط نمو صلب انتقائي يدعم نمو البكتيريا المنقولة ولكنه يمنع نمو البكتيريا غير المنقولة. للبدء ، يتم زراعة السلالة المانحة التي تحتوي على الجين محل الاهتمام في وسط نمو سائل. عندما تنقسم جميع البكتيريا بنشاط في مرحلة السجل من نموها ، يتم تلقيح الثقافة بالعاثية المستهدفة. بعد ثلاث إلى أربع ساعات من الحضانة ، عندما تقوم جميع البكتيريا تقريبا بتحلل جزيئات العاثيات وإطلاقها ، يتم تلقيح محللة العاثية المانحة في مزرعة حديثة النمو للسلالة البكتيرية المتلقية. بعد حضانة قصيرة مدتها ساعة واحدة ، يجب أن تحتوي المزرعة الآن على مزيج من الخلايا البكتيرية المنقولة وغير المنقولة ويتم فحصها بحثا عن الخلايا المنقولة عن طريق نشر جزء من المعلق على وسط نمو صلب انتقائي مناسب. عند مزيد من الحضانة ، يجب أن تنمو الخلايا المنقولة وتتكاثر لإنتاج مستعمرات مرئية. يمكن بعد ذلك اختيار هذه المستعمرات لمزيد من التحليل باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق لتأكيد التحويل الناجح بشكل أكبر ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة أو تسلسل الحمض النووي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.
قبل البدء في الإجراء ، ارتد أي معدات حماية شخصية مناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات. بعد ذلك ، قم بتعقيم مساحة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسح السطح.
بعد ذلك ، قم بإعداد ثلاثة أجزاء من مليلتر واحد من محلول ملح LB. الآن ، قم بإعداد ثقافة سلالة المتبرع عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من الإشريكية القولونية إلى قارورة مخروطية سعة 15 مليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من وسط نمو LB مع 500 ميكروغرام من الأمبيسلين. بعد ذلك ، قم بزراعة الثقافة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، امسح سطح المقعد بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل إزالة المزرعة من حاضنة الاهتزاز. بعد ذلك ، قم بتخفيف الثقافة الليلية من واحد إلى 100 عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من سلالة المتبرع إلى 990 ميكرولتر من LB الطازج المكمل بمحلول الملح.
اترك التخفيف البكتيري ينمو عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة. بمجرد وصول الخلايا إلى مرحلة السجل المبكرة ، قم بإزالة المزرعة من الحاضنة ، وأضف 40 ميكرولترا من العاثية P1 إلى المزرعة واحتضانها مرة أخرى. استمر في مراقبة الخلايا لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات حتى تتحلل المزرعة. بعد ذلك ، أضف 50 إلى 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى المحللة واخلطها عن طريق الدوامة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحللات لإزالة الحطام ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. أضف بضع قطرات من الكلوروفورم إلى المادة الطافية وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة لا تزيد عن يوم واحد.
لبدء إجراء التنبيغ ، احصل على ثقافة مليلتر واحد من السلالة المتلقية. بعد ذلك ، قم بنقل 100 ميكرولتر من محللة العاثيات المانحة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع فتح الغطاء لمدة 30 دقيقة للسماح لأي كلوروفورم متبقي بالتبخر. بينما تحتضن العاثية المانحة ، قم بتكبيل خلايا سلالة المتلقي عن طريق الطرد المركزي اللطيف. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من LB الطازج الذي يحتوي على 100 مللي مولار من كبريتات المغنيسيوم وخمسة مللي مولار من كلوريد الكالسيوم.
بعد ذلك ، قم بإعداد تفاعل التحويل عن طريق الجمع بين 100 ميكرولتر من السلالة المتلقية و 100 ميكرولتر من محللة العاثية المانحة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك ، قم بإعداد التحكم السلبي عن طريق الجمع بين 100 ميكرولتر من السلالة المتلقية و 100 ميكرولتر من LB مع كبريتات المغنيسيوم وكلوريد الكالسيوم. بعد الحضانة ، أضف 200 ميكرولتر من سترات الصوديوم المولية ومليلتر واحد من LB إلى كلا الأنبوبين ، واخلطهم عن طريق الماصة برفق لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، بعد احتضان الأنابيب لمدة ساعة ، قم بتقطيع الخلايا برفق عن طريق الطرد المركزي.
بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا المحببة في 100 ميكرولتر من LB مع 100 مللي مولر سترات الصوديوم. قم بتدوير المحاليل وماصة العينة المنقولة بالكامل على صفيحة أجار LB مع 1X أمبيسلين. أخيرا، قم بوضع الماصة بالكامل لخليط خلايا التحكم السالبة على صفيحة أجار LB بدون أمبيسلين. بعد احتضان الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، استخدم طرف ماصة معقمة لاختيار ثلاث إلى أربع مستعمرات من لوحة التحويل وخطها على صفيحة أجار LB جديدة تحتوي على 1X أمبيسلين و 100 ميكرولتر من سترات الصوديوم المولارية. كرر طريقة الطلاء هذه للتحكم السلبي على لوحة أجار LB أخرى تحتوي على 100 ميكرولتر فقط من سترات الصوديوم المولارية. بعد ذلك ، احتضن الصفائح عند 37 درجة مئوية طوال الليل للسماح للمستعمرات الخالية من العاثيات بالنمو.
في اليوم التالي ، امسح سطح المقعد بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل إزالة الأطباق من الحاضنة. باستخدام طرف ماصة معقم ، اختر ثلاث مستعمرات من لوحة التنبيغ وأضفها إلى أنبوب منفصل يحتوي على خمسة ملليلتر من وسائط LB. بعد ذلك ، حدد ثلاث مستعمرات من لوحة التحكم السلبية وأضفها إلى أنبوب آخر يحتوي على خمسة ملليلتر من وسائط LB. قم بزراعة الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع التهوية والاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة. بعد تعقيم سطح المقعد كما هو موضح سابقا ، استخدم مجموعة أدوات التحضير المصغرة للحمض النووي لعزل الحمض النووي من 4.5 مل من كل مزرعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بمسح الحمض النووي ب 35 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز وقم بقياس التركيز الناتج بواسطة مقياس الطيف الضوئي المختبري. أخيرا ، قم بإعداد مخزون الجلسرين عن طريق إضافة 0.5 مل المتبقية من كلا المحاليل البكتيرية إلى 0.5 مل من الجلسرين بنسبة 100٪.
لتأكيد التنبيغ ، قم أولا بإعداد مزيجين رئيسيين من qPCR ل 24 تفاعل qPCR. بالنسبة للمزيج الرئيسي الأول ، أضف 150 ميكرولترا من مزيج المخزن المؤقت qPCR إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق و 12 ميكرولترا لكل من برايمر أمامي وعكسي مصمم لتضخيم جين مقاومة الأمبيسلين. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج qPCR الرئيسي الثاني عن طريق إضافة 150 ميكرولترا من مزيج qPCR الرئيسي إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق ثم إضافة 12 ميكرولترا لكل من التمهيدي الأمامي والتمهيدي العكسي المصمم لتضخيم جين التدبير المنزلي.
لكل تفاعل qPCR ، اجمع بين 100 ميكروغرام من الحمض النووي التجريبي من كل تفاعل مع 14.5 ميكرولتر من مزيج qPCR الرئيسي. الآن ، قم بإعداد ردود الفعل المتبقية كما هو موضح سابقا. انقل التفاعلات إلى جهاز تدوير حراري مسخن مسبقا إلى 94 درجة مئوية ثم ابدأ البرنامج. أخيرا ، استخدم التقدير الكمي للدورة ، أو Cq ، القيم التي تم إنشاؤها بواسطة qPCR لحساب كفاءة التنبيغ الطبيعية لجين مقاومة الأمبيسلين.
تم جدولة قيم الكمية للدورة ، أو Cq ، للجينات ذات الأهمية لكل من الضوابط السلبية والعينات المنقولة. تشير قيم Cq المنخفضة ، عادة أقل من 29 دورة ، مثل العينات المحولة في هذا المثال إلى كميات عالية من التسلسل المستهدف.
يتم استخدام جين التدبير المنزلي ، الذي تم جدولته هنا أيضا ، كعنصر تحكم في التحميل لتطبيع كمية الحمض النووي في كل تفاعل وكعنصر تحكم إيجابي لضمان عمل qPCR. شريطة تحميل نفس الكميات من جين التدبير المنزلي ، يتم العثور عليه بنفس المعدل نسبيا في كل عينة.
بعد ذلك ، لحساب قيمة دلتا Cq لكل عينة ، اطرح قيمة Cq لجين التدبير المنزلي لكل عينة من قيمة Cq للجين المستهدف المقابل لها. على سبيل المثال ، دلتا Cq لعنصر التحكم السلبي الأول هو 13.54. بعد ذلك، استخدم هذه القيمة لحساب كفاءة التحويل الطبيعية لكل عينة باستخدام الصيغة الموضحة هنا. أخيرا ، يمكن حساب متوسط كفاءة التحويل الطبيعي لكل مجموعة عينة.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does a bacteriophage transfer DNA between bacterial cells?
A bacteriophage attaches to a bacterial cell surface and injects its DNA, then replicates its genome while hijacking the host's machinery. Due to low-fidelity DNA packaging, the phage occasionally packages bacterial DNA fragments into its capsid. When this phage infects another cell, it transfers the bacterial DNA, which can recombine and integrate into the new host's chromosome, mediating gene transfer between bacteria.
Q2: What are the key requirements for performing phage transduction in the laboratory?
Phage transduction requires a donor strain containing the gene of interest, a recipient strain lacking it, a phage capable of infecting both strains, and a selective growth media that supports transduced bacteria while inhibiting non-transduced ones. The selective media is essential for screening and identifying which bacterial cells successfully received the transferred genetic material.
Q3: Why is chloroform added to the phage lysate during preparation?
Chloroform is added to the phage lysate to inhibit bacterial growth and preserve the phage particles. After centrifugation removes debris, the supernatant containing phage is treated with chloroform and stored at four degrees Celsius for no more than one day, ensuring the phage remains viable for the transduction procedure.
Q4: What role do magnesium sulfate and calcium chloride play in transduction?
Magnesium sulfate and calcium chloride are added to the recipient strain suspension to enhance phage attachment and DNA transfer efficiency. These divalent cations stabilize the phage-bacterial cell interaction, increasing the likelihood of successful transduction by promoting optimal conditions for DNA uptake by recipient cells.
Q5: How does qPCR confirm successful transduction of the ampicillin resistance gene?
qPCR measures cycle quantification (Cq) values for the ampicillin resistance gene and a housekeeping gene. Low Cq values below 29 cycles indicate high target sequence amounts in transduced samples. Delta Cq values normalize results against the housekeeping gene, and normalized transduction efficiency is calculated to confirm the gene transfer occurred in recipient cells.
Q6: What is the purpose of the negative control in phage transduction experiments?
The negative control combines recipient strain with LB medium containing magnesium sulfate and calcium chloride, but without phage lysate. This control undergoes identical steps as the transduction reaction, allowing researchers to verify that any ampicillin resistance detected in transduced samples resulted from phage-mediated gene transfer, not contamination or spontaneous resistance.
Q7: Why is sodium citrate used during the transduction procedure?
Sodium citrate is added after the one-hour incubation period to chelate divalent cations and halt phage-mediated DNA transfer. This stops the transduction reaction at a defined time point, preventing continued gene transfer and allowing researchers to accurately assess the efficiency of the transduction event that occurred during the incubation window.