What is Rapid Amplification of cDNA Ends and why is it used?

Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a PCR-based method that amplifies unknown nucleotide sequences at the ends of mRNA molecules. It is used when only a partial sequence of a novel mRNA is known. RACE allows researchers to determine missing sequences and identify transcript variants, even without prior knowledge of the complete sequence.

What are the structural features of eukaryotic mRNA ends?

Eukaryotic mature mRNAs have distinctive structural features at both ends. The five-prime end contains a methylated guanosine residue connected via a five-prime to five-prime triphosphate linkage, called the five-prime cap. The three-prime end typically has a poly(A) tail consisting of 20 to 250 adenylate residues that serves as a binding site for non-specific primers.

How does three-prime RACE differ from five-prime RACE?

Three-prime RACE amplifies sequences up to the three-prime end using a gene-specific primer and an oligo(dT) primer that binds the poly(A) tail, detecting transcript variants and different three-prime UTRs. Five-prime RACE first attaches a poly(A) tail at the five-prime end, then amplifies to that end, identifying differential five-prime splice variants and alternative five-prime UTRs.

Why are nested primers used in RACE protocols?

Nested primers are used in a second round of PCR to increase specificity and yield. Because the non-specific oligo(dT) primer and gene-specific primer can cause off-target amplification through random mispriming, nested primers bind downstream of the first set, amplifying only the target cDNA and reducing non-specific products.

What role does reverse transcription play in RACE?

Reverse transcription is the initial step in RACE that synthesizes complementary DNA (cDNA) from isolated mRNA templates. An oligo(dT) primer and reverse transcriptase enzyme generate single-stranded cDNA from the mRNA, creating a template pool from which the target cDNA's unknown ends can be extended and amplified during subsequent PCR reactions.

How are RACE products separated and identified?

RACE products are separated using agarose gel electrophoresis, which separates different transcripts based on their sizes, producing distinct bands. The band of interest is then excised from the gel, purified using a spin column kit, and sequenced to obtain the complete transcript sequence.

What primer design specifications are important for RACE?

Gene-specific primers for RACE should be approximately 24 nucleotides long with a melting temperature (Tm) ranging from 55 to 65 degrees Celsius to ensure high specificity. A second nested primer should be designed downstream of the first primer, also specific for the target sequence, to improve specificity in the second PCR round.

التضخيم السريع لنهايات (كدنا)

0 مشاهدة09:44 دقيقة

1. إعداد التجربة ل 3 'RACE

صمم برايمر محدد مقاس 5 بوصات للجين ذي الأهمية (التمهيدي الخاص بالجين 1 ، GSP-1). يجب أن يكون محددا للغاية ، لأنه التمهيدي الوحيد الذي يقدم الخصوصية. لذلك ، سيكون من الأفضل وجود برايمر طويل نسبيا (الطول النموذجي حوالي 24 نيوكليوتيد ، يتراوح Tm من 55-65 درجة مئوية).
صمم برايمر ثان متداخلا (GSP-2) ، أي يجب أن يكون التمهيدي موجودا 3 بوصات من GSP-1. هذه الخطوة اختيارية ، لكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني باستخدام برايمر متداخل سيزيد من إنتاجية وخصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل للجين محل الاهتمام. يتم سرد البادئات المستخدمة لتضخيم dSmad2 cDNAs في الجدول 2.

2. تخليق (كدنا)

استخرج الحمض النووي الريبي من العينات باستخدام طريقة أو مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. عالج العينات باستخدام DNase لتجنب تضخيم الحمض النووي الجيني. في مثالنا ، استخرجنا الحمض النووي الريبي من 10 ذباب بالغ كامل.
قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم واضبطه باستخدام الماء الخالي من RNase بحد أقصى 100 نانوغرام / ميكرولتر إذا لزم الأمر.
قم بإعداد (كدنا) في تفاعل النسخ العكسي (RT) ، باستخدام مجموعة موصى بها ل RACE. قم بإعداد مزيج رئيسي ، مع الكواشف التالية لكل عينة:
- 4 ميكرولتر مخزن مؤقت للنسخ العكسي (5x)
- 2 ميكرولتر أوليغو (dT) ₂₀ برايمر (أوليغو يتكون من 20 ديوكسي ثيميدين) - 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (بحد أقصى 1 ميكروغرام) - 3 ميكرولتر ddH₂O
- 1 ميكرولتر من النسخ العكسي
- الإجمالي: 20 ميكرولتر
احتضان التفاعل لمدة 90 دقيقة عند 42 درجة مئوية. قم بتضمين عنصر تحكم سلبي مع حذف النسخ العكسي.
قم بإلغاء تنشيط النسخ العكسي عن طريق الحضانة عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
من أجل تخفيف مستويات الحمض النووي من أجل تفاعل البوليميراز المتسلسل الفعال ، أضف 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر.

3. تضخيم شظايا (كدنا)

قم بإعداد مزيج PCR للتضخيم في الجولة الأولى باستخدام بوليميراز Taq عالي الدقة (HF):
- 4 ميكرولتر 5x HF Taq polymerase buffer
- 0.4 ميكرولتر dNTP مزيج (10 ملي لكل منهما)
- 1 ميكرولتر GSP1 التمهيدي (10 ميكرومتر)
- 1 ميكرولتر أوليغو (dT) 20 برايمر (10 ميكرومتر)
- 1 ميكرولتر قالب cDNA
- 0.2 ميكرولتر HF Taq DNA polymerase
- 12.4 ميكرولتر ddH2O
- المجموع: 20 ميكرولتر
قم بتشغيل PCR باستخدام برنامج PCR1 (الجدول 1). قم بتضمين عنصر تحكم سلبي باستخدام منتج الحمض النووي الريبي الأصلي كقالب بدون RT. علاوة على ذلك ، يمكن تضمين عنصر تحكم "بدون برايمر".
اختياري: تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل لزيادة الخصوصية وكمية منتجات (كدنا). قم بتخفيف 1 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل والتحكم السلبي 1:20 في المخزن المؤقت TE. استخدمها كقالب لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الثانية:
- 4 ميكرولتر 5x HF Taq polymerase buffer
- 0.4 ميكرولتر dNTP مزيج (10 ملي لكل منهما)
- 1 ميكرولتر GSP2 التمهيدي (10 ميكرومتر)
- 1 ميكرولتر أوليغو (dT) ₂₀ برايمر (10 ميكرومتر)
- 1 ميكرولتر قالب منتج PCR
- 0.2 ميكرولتر HF Taq DNA polymerase
- 12.4 ميكرولتر ddH2O
- المجموع: 20 ميكرولتر
تشغيل PCR الثاني باستخدام برنامج PCR2 (الجدول 1)

4. عزل شظايا (كدنا)

قم بإعداد جل الاغاروز بنسبة 1-2٪ مع محلول TAE ، باستخدام بروميد الإيثيديوم أو صبغة الحمض النووي البديلة.
امزج 5 ميكرولتر من العينة مع 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الهلام 6x.
قم بتحميل العينات وسلم الحمض النووي 1 كيلو بايت كعلامة وقم بتشغيل الجل عند 120 فولت لمدة 45 دقيقة تقريبا أو حتى تصبح مقدمة الصبغة ~ 75٪ من الطريق إلى أسفل الجل. تأكد من عدم نفاد العينات من الجل.
افحص العصابات الهلامية تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية. لمزيد من المعالجة للمنتجات ، استخدم الأشعة فوق البنفسجية منخفضة الكثافة ، وحدد موقع العصابات المضخمة واقطعها من الجل باستخدام مشرط.
قم بتنقية الحمض النووي من الجل باستخدام طريقة مثل التجميد والضغط أو مجموعة.
قم بتخزين شظايا (كدنا) المنقاة عند -20 درجة مئوية أو استخدمها على الفور لمزيد من التطبيقات ، مثل التسلسل أو الاستنساخ.

عادة ، مع mRNAs الجديدة ، لا يعرف سوى جزء من تسلسلها الكامل. يمكن تحديد تسلسلات النيوكليوتيدات المفقودة في نهايات الرنا المرسال باستخدام طريقة قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل تسمى التضخيم السريع لنهايات (كدنا) ، أو RACE.

في حقيقيات النوى ، تتمتع mRNAs الناضجة بسمات هيكلية مميزة في كلا الطرفين. في نهاية الخمسة أولية ، يحتوي معظمها على بقايا غوانوزين ميثيلية متصلة ب mRNA عبر ارتباط ثلاثي فوسفات من خمسة أوليات إلى خمسة رئيسيات. يعرف هذا أيضا باسم الحد الأقصى المكون من خمسة رئيسيات. في الطرف ثلاثي النوى ، تحتوي معظم حقيقيات النوى على ذيل من 20 إلى 250 بقايا أدينيلات ، تسمى ذيل بولي (أ).

الآن ، إذا كان تسلسل النيوكليوتيدات حتى لجزء صغير معروفا في أي مكان داخل mRNA ، فيمكن تضخيم التسلسل حتى نهايته ثلاثية الأعداد الأولية باستخدام برايمر خاص بالجين وأوليغو (dT) التمهيدي غير المحدد الذي يلدن إلى ذيل بولي (A) في الطرف ثلاثي الأوليات. تسمى هذه المجموعة الفرعية من تقنية RACE ثلاثية الأعداد الأولية RACE ، وتسمح باكتشاف متغيرات النسخ والمناطق غير المترجمة ثلاثية الرئيسيات المختلفة ، أو UTRs.

يمكن تضخيم التسلسل في النهاية الخماسية الأولية بالمثل. للقيام بذلك ، يتم إرفاق ذيل بولي (A) أولا في الطرف المكون من خمسة أولي. بعد ذلك ، باستخدام أوليغو (dT) التمهيدي غير المحدد الذي يلدن بالذيل الملحق وبرايمر خاص بالجين ، يمكن تضخيم التسلسل حتى النهاية الخمسة. تعرف هذه المجموعة الفرعية من RACE باسم RACE خماسي الأعداد الأولية وتستخدم للعثور على متغيرات لصق تفاضلية خماسية أولية و UTRs البديلة ذات الخمسة أولية.

لإجراء RACE ثلاثي الأعداد الأولية لتحديد النصوص المختلفة المشفرة بواسطة جين معين ، يتم عزل الحمض النووي الريبي أولا عن الكائن الحي أو الأنسجة ذات الأهمية. بعد ذلك ، يتم تصنيع (كدنا) من mRNAs المعزولة مع تفاعل نسخ عكسي يستخدم أوليغو (dT) التمهيدي وإنزيم النسخ العكسي ، والذي يولد الحمض النووي التكميلي من قالب الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، من مجموعة cDNA التي تم إنشاؤها ، يتم تمديد الطرف ثلاثي الأعداد الأولية غير المعروف ل cDNA المستهدف عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل ، باستخدام أوليغو (dT) التمهيدي غير المحدد وبرايمر خاص بالجين ، ويتم تضخيمه أثناء تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

ومع ذلك ، نظرا للطبيعة العامة للبرايمر غير المحدد والخطأ العشوائي بواسطة التمهيدي الخاص بالجين ، يمكن أن تلدين إلى cDNA غير المستهدف ، مما يؤدي إلى تضخيمها أيضا. للتغلب على هذه المشكلة ، يتم إجراء جولة ثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات متداخلة ، والتي تربط مجرى المجموعة الأولى من البادئات. تعمل هذه المجموعة الثانية من البادئات على تضخيم (كدنا) ذي الأهمية ولكن ليس المنتج غير المحدد ، مما يزيد من خصوصية التفاعل وإنتاجيته.

أخيرا ، يتم فصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ، والذي يفصل بين نسخ مختلفة من الجين المستهدف بناء على أحجامها ، مما ينتج عنه نطاقات مميزة. يمكن بعد ذلك استئصال نطاق الاهتمام وتنقيته وتسلسله أخيرا للحصول على التسلسل الكامل للنص.

في هذا الفيديو ، سنوضح تقنية RACE ثلاثية الأعداد الأولية لتحديد وعزل النصوص المختلفة المشفرة بواسطة ذبابة الفاكهة dSmad2 الجين.

قبل البدء في توليف وتضخيم (كدنا) ، استخدم برنامج تصميم التمهيدي لإنشاء برايمر محدد من خمسة أوليات للجين محل الاهتمام ، dSmad2 في هذا المثال. للتأكد من أن التمهيدي محدد للغاية ، يجب أن يكون حوالي 24 نيوكليوتيد وتتراوح درجة حرارته من 55 إلى 65 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتصميم برايمر متداخل ثان يقع بثلاثة أوليات من التمهيدي الأول ، وهو خاص أيضا بالتسلسل المستهدف.

للبدء ، استخرج الحمض النووي الريبي من 10 ذباب بالغ كامل باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي المتوفرة تجاريا. بمجرد استخراج الحمض النووي الريبي ، أعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. بالنسبة لتفاعل 50 ميكرولتر ، أضف 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل إلى كل أنبوب عينة ، وقم بزيادة حجم التفاعل بإضافة 24 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. ثم أضف 1 ميكرولتر من DNase I لمنع تضخيم الحمض النووي الجيني. أخيرا ، احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بعد علاج DNase ، قم بتعطيل الإنزيم باستخدام 1 ميكرولتر من 25 مللي مولار EDTA في كل أنبوب من الأنبوب. أضف العينة إلى عمود الدوران لتنقية الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، استخدم مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم لقياس تركيز الحمض النووي الريبي. اضبط التركيز على 100 نانوجرام لكل ميكرولتر عن طريق إضافة ماء خال من النوكلياز.

الآن ، قم بإعداد مزيج رئيسي لتفاعل النسخ العكسي. بالإضافة إلى عينات الحمض النووي للاختبار ، قم بتضمين عنصر تحكم سلبي واحد عن طريق حذف النسخ العكسي من الأنبوب المناسب. احتضان التفاعلات لمدة 90 دقيقة عند 42 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتعطيل النسخ العكسي عن طريق احتضان الأنابيب عند 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بتخفيف مستويات الحمض النووي عن طريق إضافة 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE إلى كل أنبوب ليصل إجمالي التفاعل إلى 100 ميكرولتر.

الآن بعد أن تم تصنيع (كدنا) ، قم بتضخيم الجين محل الاهتمام عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). للقيام بذلك ، قم أولا بإعداد مزيج PCR للتضخيم في الجولة الأولى. بالإضافة إلى قالب (كدنا) ، قم بتضمين تفاعل تحكم سلبي يستخدم القالب من المنتج غير المنسوخة عكسيا ، بالإضافة إلى تفاعل لا يحتوي على التمهيدي الخاص بالجين كعنصر تحكم بدون تمهيدي.

بمجرد تحضير التفاعلات ، قم بإجراء تضخيم PCR في جهاز تدوير حراري مزود بغطاء ساخن. بعد ذلك ، قم بتخفيف المنتجات من 1 إلى 20 عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من منتجات PCR إلى 19 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. باستخدام هذه المنتجات المخففة ، قم بإعداد مزيج PCR للتضخيم في الجولة الثانية. ثم استخدم جهاز تدوير حراري لتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني.

لعزل شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد جل الاغاروز بنسبة 1٪ عن طريق إضافة 1 جرام من الاغاروز لكل 100 مل من محلول TAE. نذوب المزيج لمدة دقيقتين في الميكروويف ، ثم نضيف بقعة SYBR Safe أو بروميد الإيثيديوم. يسكب المزيج المنصهر في صينية هلام ويترك حتى يتماسك.

أثناء تثبيت الجل ، ضع ماصة 1 ميكرولتر قطرات من صبغة التحميل 6X على قطعة من البارافيلم تتوافق مع عدد العينات. أضف 5 ميكرولتر من العينة إلى كل قطرة. الآن ، قم بتحميل العينات ، جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي 1 كيلو قاعدة ، على الجل. قم بتشغيل الجل على حرارة 120 فولت لمدة 45 دقيقة تقريبا أو حتى تصل مقدمة الصبغة إلى 75٪ من الطريق إلى أسفل الجل.

عند الانتهاء من تشغيل الجل ، تحقق من أشرطة الجل الموجودة أسفل مصباح الأشعة فوق البنفسجية. حدد موقع العصابات واقطعها باستخدام مشرط. قم بتنقية شظايا (كدنا) باستخدام مجموعة أعمدة الدوران المتوفرة تجاريا. بمجرد تنقيتها ، يمكن تخزين شظايا الحمض النووي (كدنا) عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر أو استخدامها على الفور لمزيد من التحليل.

قبل هذه التجربة ، تم شرح نسختين ذبابة الفاكهة dSmad2 في قاعدة بيانات ذبابة الفاكهة الجينومية ، FlyBase. بناء على التضفير المتوقع لهذا الجين ، يجب تحديد منتجين بواسطة بروتوكول RACE ثلاثي الأصناف.

ومع ذلك ، تكشف نتائج هذه التجربة عن ثلاثة نسخ مختلفة ل dSmad2. من بين المنتجات المتوقعة ، هناك نسخة واحدة هي السائدة ، ويتم التعبير عن نسخة واحدة على مستوى أقل. بالإضافة إلى ذلك ، تم اكتشاف منتج أصغر لم يتم وصفه سابقا ، مرئي في 750 زوجا أساسيا.

المصدر: Pablo Sanchez Bosch², Sean Corcoran² and Katja Brückner^1,2,3
¹مركز إيلي وإيديث الواسع لطب التجديد وأبحاث الخلايا الجذعية
² قسم بيولوجيا الخلية…

Browse More Videos

RACE RACE RACE Oligo dT