Name: إعداد شريحة الأفقي للشبكية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: تعلم تقنية جديدة لتقطيع شبكية العين تحافظ على شكل التفرعات العصبية. تُحسّن هذه الطريقة دراسة الدوائر العصبية الوظيفية في علم الأعصاب.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر الدكاترة. H. ريتشارد Masland وكانيكو Akimichi لإعطائنا النصائح واقتراحات قيمة لتأسيس الداخلي لإعداد شريحة الأفقي للشبكية العين.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد كتلة آغار (30 ملغم / لتر ، أي بنسبة 3 ٪ ، في الماء المقطر). حل أولا والميكروويف وسكبه في صحن الزجاج. الحفاظ على طبق في الثلاجة على 4 درجة مئوية. نصيحة : يجب أن تكون على استعداد كتلة آغار مقدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد درجات الحرارة المنخفضة ذوبان agarose هلام (25 ملغم / لتر ، أي بنسبة 2.5 ٪ في المتوسط). حل وأنها الميكروويف. يبقيه في حمام ماء ساخن على 35 درجة مئوية. نصيحة : حافظ على agarose هلام يست ساخنة جدا. إذا كان الجو حارا جدا ، فإنه يأخذ وقتا طويلا لتكون طدت ، وهلام قد قتل في شبكية العين . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الحيوان ، واستأصل an مقلة العين وفتحه بمثابة فنجان العين. لتسييل النكتة الزجاجي ، وغارقة في فنجان العين فتح لمدة 10 دقيقة في هيالورونيداز في المتوسط ​​(0.07 ملغ / مل) ، إذا بالضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أجار في كتلة (على سبيل المثال ، 1 سم × 1.5 سم لشبكية العين الماوس) ، وترتبط بقوة على المسرح vibratome بواسطة الغراء الفورية. الحفاظ على كتلة آغار الرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان النصل في 5 درجة في تقطيع اللحم. خفض بلطف السطح العلوي من كتلة آغار بسرعة تقريبا. 50 ميكرون / ثانية ، التكرار. 50 هرتز. نصيحة : تأكد من أن السطح العلوي من كتلة آغار ناعمة ومسطحة تماما. قد تكون هناك حاجة تخفيضات عدة (على الأقل 3 مرات) للحصول على سطح أملس ومسطحة من كتلة آغار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف فنجان العين مع وسيط وبدون هيالورونيداز. عزل الشبكية من الظهارة الصبغية ووضعه مبصرة جنب على قطعة من ورق الترشيح. تعلق بحزم لشبكية العين ورقة الترشيح ، والفراغ في شبكية العين على ورقة الترشيح عدة مرات. نصيحة : تأكد من أن تعلق في الشبكية إلى ورقة الترشيح مسطح تماما. بعد وضع شبكية العين على ورقة الترشيح ، وقطع ورقة فائض التصفية المحيطة الشبكية (Fig.2A). ورقة فائض التصفية كثيرا ما يمنع شفرة من الخوض في الطبقة المناسبة لشبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمسح برفق المتوسطة الزائد على الكتلة آغار والمكان بعناية على شبكية العين ورقة الترشيح على كتلة آغار. بحزم لوضع ورقة الترشيح على كتلة آغار ، نعلق الغراء الفورية على حافة ورقة الترشيح. نصيحة : لتجنب صدع unexpectable ، ضع الشبكية الأمامية وممكن على السطح العلوي من كتلة آغار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصب بلطف agarose هلام درجات الحرارة المنخفضة لإذابة على شبكية العين. انتظر 1 دقيقة وتصب بلطف المتوسطة على ذلك لتبريده. الجل agarose يصبح توطد بسرعة. نصيحة : حار جدا agarose هلام تقتل الشبكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع مكانة نصل الى عدة مئات ميكرومتر فوق السطح العلوي للكتلة آغار وخفض بلطف الجزء العلوي من هلام agarose طدت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض أسفل موقف النصل. قطع الشبكية على مستوى الثلث القريبة من الطبقة النووية الداخلية (تقريبا في ما بين 200 و 250 ميكرومتر فوق السطح العلوي للكتلة آغار). نصيحة : سوف سرعة الكثير من النصل تلف شبكية العين بشدة. تقريبا. 50 ميكرون / ثانية (50 هرتز) هو الخيار المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحظ أن الخلايا عديم الاستطالات هي الآن وجها لأسفل. اختيار بعناية شريحة من شبكية العين مع هلام agarose عزز وضعه وجها في برلمان أو طبق. نصيحة : لأن شبكية العين الماوس صغيرة ومتموجة ، فمن الصعب الحصول على شريحة مثالية الأفقي في طبقة المناسب. يجوز لل&quot;منحرف&quot; شريحة هي وسيلة بديلة للحصول على شريحة النسبية المسطحة من شبكية العين. للحصول على شريحة المائلة ، وضعت ورقة أخرى في تصفية بين شبكية العين على ورقة الترشيح وكتلة أغار على النحو المبين في Fig.2B. على الرغم من أنك لا يمكن أن نتوقع الكمال شريحة أفقية ، وهناك دائما بعض المناطق حيث سوما الخلية هو عديم الاستطالات على سطح الشريحة. </li></ol>

<ol><li>Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+spatiotemporal+patterns+of+dendritic+Ca2%2B+signals+in+goldfish+retinal+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells.</a> Brain Res. , 64-73 (2004).</li>
<li>Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+currents+stabilize+the+membrane+potential+in+dendrites+of+mouse+amacrine+cells%3A+patch-clamp+recordings+and+single-cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell.</a> , 328-340 (2004).</li>
<li>MA, M. acN. eil, RH, M. asland <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. , 971-982 (1998).</li>
</ol>

وأجريت جميع البروتوكولات التجريبية وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية للاستخدام الحيواني.

هناك مزايا عديدة مهمة إعداد شريحة الأفقي للشبكية العين. الأول ، هو الحفاظ على التشكل من الخلايا التي تعمل على توسيع التشعبات أفقيا ، مثل خلايا عديم الاستطالات والخلايا الأفقية. فقد تبين أن هناك أكثر من 20 نوعا من الخلايا في الشبكية عديم الاستطالات (ماكنيل وMasland ، 1998) ، بحيث أنه من المهم جدا لمقارنة مورفولوجيا الخلايا مع الخاصية الفسيولوجية. الثانية ، في شبكية العين كلها جبل ، وتغطية واسعة من الخلايا ال...

<table><tbody><tr><td>آجار</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1296</td><td></td></tr><tr><td>أجاروز L</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>317-01182</td><td>أجاروز منخفض درجة حرارة الانصهار</td></tr><tr><td>هيالورونيداز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>النوع I-S، 300 U/mg</td></tr><tr><td>وسط زراعي</td><td></td><td></td><td>بتركيز mM: 102 NaCl، و3.1 KCl، و2.0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;، و1.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;، و23 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;، و10 جلوكوز، مع الحفاظ على pH 7.8، أو محلول Ames&amp;rsquo; (Sigma)</td></tr><tr><td>ميكروويف</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>حمام مائي ساخن</td><td></td><td></td><td>35 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>قاطعة Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>مرشحات غشائية MF</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP01300</td><td>ورق ترشيح، حجم المسام 0.45 &amp;#181;m</td></tr><tr><td>أدوات تشريح</td><td></td><td></td><td>ملقط، شفرة، ملقط صغير، ملقط دقيق، &lt;em&gt;إلى أخره&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td>غراء فوري</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;مثل&lt;/em&gt; Alonalpha، وKrazy Glu</td></tr><tr><td>حقنة 50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>مرشح حقنة</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr></tbody></table>

إعداد شريحة الأفقي للشبكية

Horizontal Slice Preparation of the Retina

تقليديا قد استخدمت شريحة الرأسي وإعداد كامل جبل الشبكية لدراسة وظيفة الدوائر الشبكية. ومع ذلك ، فإن العديد من الخلايا العصبية للشبكية ، مثل خلايا عديمة المحوار ، وتوسيع هذه التشعبات أفقيا ، بحيث يفترض أن مورفولوجيا الخلايا لتكون تضررت بشدة في شرائح عمودية. في إعداد كل جبل ، وخاصة بالنسبة للتصحيح ، المشبك التسجيلات والخلايا العصبية للشبكية في الطبقة الوسطى لا يمكن الوصول إليها بسهولة بسبب تغطية واسعة من الخلايا الدبقية endfeets ق (مولر الخلية). هنا ، نحن تصف الرواية تشريح طريقة للحفاظ على مورفولوجيا شجيري الخلايا العصبية في الشبكية سليمة. قدم شريحة أفقيا في الطبقة الداخلية للشبكية باستخدام تقطيع vibratome بعد جزءا لا يتجزأ من شبكية العين في هلام ذوبان agarose درجات الحرارة المنخفضة. في هذا التحضير شريحة أفقية من شبكية العين ، درسنا وظيفة الخلايا العصبية للشبكية مقارنة مورفولوجيا بهم ، وذلك باستخدام التصحيح ، المشبك تسجيل والكالسيوم تقنية التصوير ، وكيمياء سيتولوجية مناعية وحيدة الخلية RT - PCR.

تقليديا قد استخدمت شريحة الرأسي وإعداد كامل جبل الشبكية لدراسة وظيفة الدوائر الشبكية. هنا ، نحن تصف الرواية تشريح طريقة للحفاظ على مورفولوجيا شجيري الخلايا العصبية في الشبكية سليمة.

تقليدياً، استُخدمت الشريحة العمودية وتحضير الشبكية الكاملة لدراسة وظيفة الدوائر الشبكية. ومع ذلك، فإن العديد من...

لقد وصل المنتج الأسطوري، وهذه ورقة صور.

horizontal-slice-preparation-of-the-retina

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

الرئيسيات غير البشرية هي الأنواع الهامة متعدية لفهمنا للتنمية ، والشيخوخة. يجوز للمنظمة التشريحي للشبكية الرئيسيات توفير معلومات هامة في الظروف العادية والمرضية لدى البشر.

عبارة في الدماغ : تشريح العين الرئيسيات

نحن هنا وصف الإجراء لتوليد داكنة تكييفها شرائح من شبكية العين الماوس للتسجيلات الكهربية.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

نحن تصف إعداد شرائح رقيقة من الشبكية المائية نمر السلمندر...

في وقت واحد تسجيلات خلية كاملة من المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية الدرجة الثانية في البرمائيات إعداد شريحة الشبكية

الشبكية العصبية على فأرة الحاسوب الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أيام هي على رأس 4٪ كتلة الجيلاتين. بعد عزل طبقة مبصرة (200 ميكرون) من خلال vibratome، هي المصنفة مبصرات بعد التفكك الميكانيكية والأنزيمية للثقافة. طبقة مستقبلة للضوء يمكن استخدامها لالجزيئية، التحاليل البيوكيميائية أو الزرع.

Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة

سنوضح كيفية تحضير شرائح الشبكية من عين الفأر وتسجيل استجابات الضوء في الخلايا العصبية في الشبكية. يتم إجراء الإجراء بأكمله في ظروف مظلمة.

تسجيل الخفيفة أثار-الردود بعد المشبكي في الخلايا العصبية في الظلام تكييفها، الاستعدادات ماوس الشبكية شريحة عن طريق تقنيات المشبك التصحيح

وصفنا بروتوكول لمراقبة كا 2+ ديناميكية في محطات محوار مبصرات مخروط باستخدام إعداد شريحة فيفو السابقين في شبكية العين الماوس. هذا البروتوكول يسمح دراسات شاملة للمخروط الكالسيوم 2+ الإشارات في نظام المهم نموذج الثدييات، والفأر.

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

وضعنا إعداد شريحة الأفقي للشبكية العين الكبار الثدييات مع الطائرة من باجتزاء موازية لسطح الشبكية. لم اقتطاع الحقول الجذعية من الخلايا العصبية للشبكية موجهة nonradially، والسماح للدراسة معالجة الإشارات مع تقنيات التصحيح، المشبك والتصوير.

إعداد شرائح أفقية من الكبار شبكية العين الفأر للدراسات الكهربية

التصوير نسيج الشبكية يمكن أن توفر معلومات الخلايا المفردة التي لا يمكن جمعها من الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية. ويصف هذا البروتوكول إعداد الشرائح الشبكية من الزرد لتصوير [كنفوكل]. فلوري وراثيا ترميز أجهزة الاستشعار أو الأصباغ مؤشر يسمح التصور للعديد من العمليات البيولوجية في أنواع مختلفة من الخلايا الشبكية.

إعداد شرائح الشبكية الطازجة من الزرد الكبار السابقين فيفو التصوير تجارب

يقدم هذا العمل إعدادا بديلا لشبكية العين المسطحة حيث تتيح إزالة أجسام الخلايا المستقبلة للضوء انتشارا أسرع للأجسام المضادة وتحسين وصول ماصة التصحيح إلى الخلايا العصبية الداخلية للشبكية للكيمياء المناعية والتهجين في الموقع وتجارب الفيزيولوجيا الكهربية.

انقسام الشبكية كتحضير مسطح محسن لدراسة الخلايا العصبية للطبقة النووية الداخلية في شبكية الفقاريات

تظهر شبكية العين تنظيما مكانيا معقدا عبر هيكلها الرقائقي. تتطلب تقنيات النسخ المكاني والتسلسل المكانية الحديثة أقساما &lt; الأنسجة بسمك 20 ميكرومتر ، مما يحد من قابليتها لتطبيق أبحاث الشبكية. تنتج طريقة التقطيع بالتبريد المجمدة حديثا أقساما رقيقة من شبكية العين مع الحفاظ على العلاقات المكانية المستوية ، مما يتيح رسم خرائط جزيئية شاملة عبر الصفائح.

أون الوجه التقطيع بالتبريد لشبكية العين الفأرية للتحليل الجزيئي المكاني عالي الأبعاد

تعلم تقنية جديدة لتقطيع شبكية العين تحافظ على شكل التفرعات العصبية. تُحسّن هذه الطريقة دراسة الدوائر العصبية الوظيفية في علم الأعصاب.

إعداد شريحة الأفقي للشبكية

استكشف المزيد من الفيديوهات