تحليل الجينات من المجتمعات الميكروبية البحرية باستخدام Transcriptomics البيئية

تبدأ هذه العملية بالحصول على الكتلة الحيوية الميكروبية البحرية من عينات المياه عن طريق الترشيح الأولي باستخدام مرشحات بمسامية 5 و 3 ميكرومتر، يليه الجمع على مرشح بمسامية 0.22 ميكرومتر. ثم يتم استخلاص الـ RNA الكلي من الكائنات التي استُبقيت على مرشح الـ 0.22 ميكرومتر. ويُزال الـ RNA الريبوزومي من الـ RNA الكلي عن طريق التحلل الإنزيمي الانتقائي والتهجين الطرحي، ثم يتم تضخيم Mr.N المخصب خطياً عبر إضافة ذيل polyA والنسخ في المختبر.

يتم بعد ذلك تحويل الـ RNA المضاد للمعنى المُضخم إلى cDNA مزدوج السلاسل باستخدام سداسيات عشوائية. ويمكن استنساخ الـ cDNA الناتج وتسلسله أو إخضاعه مباشرةً للتسلسل بالبيروسيكوينس. مرحباً، أنا ريتشل بيرسكي من مختبر الدكتورة ماريان موران في قسم علوم البحار بجامعة جورجيا.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لفحص التعبير الجيني من العينات البيئية، وذلك باستخدام الميتا-ترانسكريبتوميكس البيئية. سيوضح لكم سكوت جيفورد كيفية معالجة العينات البيئية لجمع الـ RNA.

سأوضح لكم كيفية استخلاص RNA من العينات وتحديد قيم RIN. وسيقوم AON بتوضيح عملية إزالة RNA. ومن ثم ستشرح Maria Kosta خطوات تضخيم RNA وتصنيع cDNA.

فلنبدأ الآن. لبدء عملية جمع الحمض النووي الريبوزي (RNA) البيئي، نقوم بإعداد نظام خط الترشيح عن طريق وضع أحد طرفي الأنبوب في الماء عند العمق المطلوب لأخذ العينات، وتوصيل الطرف المقابل بمرشح عالي السعة بحجم 3 µm، مع وضع المضخة بين طرفي الأنبوب. بعد ذلك، يتم توصيل مرشح 3 µm ببرج ترشيح 0.22 µm، ويوجه التدفق الخارج من برج 0.22 µm إلى وعاء مدرج.

قم بتمرير عدة لترات من الماء عبر النظام للشطف. عند الانتهاء، قم بإزالة الأنابيب من الماء أثناء تشغيل المضخة لتفريغ الماء المتبقي من الخط. بعد ذلك، استخدم ملقطاً لوضع مرشح بمسامية 0.22 micrometer على برج الترشيح ثم أغلقه.

أعد طرف الأنبوب إلى الماء وقم بتشغيل المضخة. اسمح بتفريغ الهواء من كلا المرشحين وراقب حجم الماء المُرشح في القارورة. وبمجرد ترشيح الحجم المطلوب، أخرج الأنبوب من الماء وقم بتفريغ ما تبقى من الماء في النظام.

بمجرد جفاف المرشح، قم بإزالة لوحة الترشيح العلوية بسرعة واطوِ ورقة الترشيح. ضع المرشح في وعاء whirl pack وقم بتجميده فورياً في النيتروجين السائل. قبل البدء في التجربة، من المهم ملاحظة أنه نظراً لانتشار جزيئات RNAs في كل مكان وتحلل mRNAs بسرعة، يجب اتباع الاحتياطات القياسية للعمل في بيئة خالية من الريبونوكلياز، بما في ذلك أسطح العمل والماصات.

ومع وضع ذلك في الاعتبار، يجب ارتداء قفازات نظيفة عند التعامل مع أي من المواد المستخدمة في هذا الإجراء. كما يجب معالجة العينات في أقصر وقت ممكن. وللبدء في استخلاص الـ RNA الكلي من مرشح 0.22 µm، نقوم بتجهيز أنابيب الخرز عن طريق إضافة 8 mL من محلول RLT المنظم المضاف إليه beta-mercaptoethanol إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL.

ثم يُضاف من واحد إلى اثنين ملي لتر من حبيبات RNA من طقم استخلاص التربة MoBio PowerSoil. يُخرج المرشح المجمد بسرعة من المجمّد مع إبقائه في عبوة World Pack، ثم يُحطم باستخدام مطرقة.

أضف المرشح المهشم إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter مُجهز، وأحكم إغلاق غطاء الأنبوب باستخدام شريط Parafilm أو شريط مختبري، ثم قم بالرج الدوامي لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بطرد الأنبوب سعة 50 milliliter مركزياً عند 5,000 RPM لمدة دقيقة واحدة. وفي درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المستخلص الخلوي وانقله إلى أنبوب سعة 15 milliliter قبل إجراء عملية الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق.

عند 5,000 ×g، يتم نقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد سعة 50 milliliter، ثم يُضاف حجم واحد من ethanol بتركيز 100% إلى المستخلص الخلوي. وباستخدام حقنة سعة 10 milliliter، يتم سحب المستخلص الخلوي عبر إبرة بقياس 18 إلى 21 gauge ثم دفعه للخارج نحو خمس مرات. وفي خطوات الاستخلاص اللاحقة، يُستخدم kit KaiGen R and easy mini وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، مع تطبيق المستخلص الخلوي على العمود الموفر باستخدام المانيفولد المفرغ أو عن طريق الطرد المركزي المتكرر.

قم بقياس كمية RNA الكلية باستخدام مقياس الطيف الضوئي. وبعد تحديد حصيلة RNA الكلية، نستخدم طقم Ambien turbo DNA free وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لإزالة أي ملوثات من DNA. والآن بعد اكتمال عمليات استخلاص RNA، سأقوم بتسليم RNA الكلي إلى Johanna، التي ستتولى تنفيذ خطوتي إزالة RRNA الأولى والثانية.

شكراً يا راشيل. لبدء عملية إزالة RRNA، امزجي بلطف وقومي بإجراء طرد مركزي قصير لمحلول التفاعل بتركيز 10x الخاص بـ mRNA فقط قبل الاستخدام. في أنبوب معقم خالٍ من RNA بسعة 0.5 milliliter، اجمعي الأحجام المناسبة من محلول التفاعل بتركيز 10x، ومثبط RNA، وعينة RNA الكلية، وإنزيم terminator exonuclease. وفقاً لبروتوكول epicenter، يتم تحضين التفاعل عند 30 °C لمدة 60 دقيقة في جهاز thermocycler بغطاء مسخن أو في حمام مائي.

بعد ذلك، أوقف التفاعل عن طريق الترسيب باستخدام الفينول والإيثانول، وذلك بإضافة الماء الخالٍ من الـ RNases أولاً ليصل الحجم الإجمالي إلى 200 µL، ثم إضافة حجم واحد من محلول الفينول والكلوروفورم بنسبة واحد إلى واحد إلى الـ mRNA ثم إجراء عملية الطرد المركزي. اجمع الطور المائي ثم قم بالترسيب باستخدام إيثانول بتركيز 100% وملح. وتعد هذه الخطوة نقطة توقف محتملة.

يمكن تخزين RNA في درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى يتم الاستعداد لاستخدام العينة في التطبيقات اللاحقة. وبمجرد الانتهاء من عملية إثراء mRNA الأولى، سنستخدم مجموعتي Ambien microbe enrich وmicrobe express وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لإزالة أي rRNA متبقٍ من عينتنا. ولتسهيل إزالة rRNA حقيقي النواة، سنستخدم مجموعة microbe enrich.

يتم تحديد جميع الأحجام من خلال قراءة تعليمات الشركة المصنعة. للبدء، يتم سحب 300 µL من محلول الربط (binding buffer) باستخدام الماصة ووضعه في أنبوب سعة 1.5 mL. أضف من 5 إلى 100 µg من إجمالي الـ RNA في حجم أقصى قدره 30 µL ثم قم بالرج باستخدام جهاز الرج الميكانيكي (vortex).

أضف بلطف 2 µL من خليط قليغونات الالتقاط (capture oligo mix) المخصصة لـ 5 µg من RNA في محلول الربط، ثم اطرق الأنبوب بلطف. قم بتدوير الخليط لفترة وجيزة في جهاز الطرد المركزي لترسيب المكونات. قم بمسخ الخليط عند 70 °C لمدة 10 دقائق، قبل تبريده تدريجياً ليبقى عند 37 °C لمدة ساعة واحدة.

خلال فترة الحضن هذه، قم بتحضير خرزات mag oligo من خلال غسلها مرة واحدة في ماء خالٍ من النوكلياز ومرة واحدة في محلول الربط، مع تثبيت الخرزات على حامل مغناطيسي بين عمليات الغسل. احفظ الخرزات على الثلج ثم اتركها لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. وقبل خمس دقائق من الاستخدام، قم بتسخين محلول الغسل إلى 37 °C في كتلة تسخين.

أضف خليط قليلات النوكليوتيد (oligo mix) لالتقاط الـ RNA إلى حبيبات المغناطيس المغلفة بالقليلات النوكليوتيدات المغسولة، ثم اخلط الأنبوب بلطف وقم بتدويره في جهاز الطرد المركزي. حضّن الخليط لفترة وجيزة عند 37 °C لمدة 15 دقيقة. ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي وانتظر لمدة ثلاث دقائق تقريبًا قبل سحب السائل الطافي الذي يحتوي على الـ mRNA ومن ثم نقله إلى أنبوب تجميع على الثلج.

بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول الغسل المسخن مسبقاً إلى الخرز الماص. ثم قم برج الخرز الماص بلطف باستخدام جهاز Vortex واسترجع السائل الطافي. ضع هذا السائل الطافي الذي يحتوي على mRNA في أنبوب الجمع على الثلج.

ضع أنبوب التجميع على الثلج أثناء التحضير لإزالة RRNA بدائيات النوى باستخدام طقم ambi microbe express، والذي سنستخدمه لإزالة RRNA بدائيات النوى المتبقية. استخدم bioanalyzer أو Experion للتحقق من تلوث RRNA وجودة MR.NA. هذه نقطة توقف محتملة.

يمكن تخزين RNA عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. وبمجرد إزالة RRNA، سنستخدم طقم Ambien message AMP two bacteria وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لتضخيم mRNA الخاص بنا. والآن بعد أن حصلنا على عينة نقية من mRNA، سأقوم بتسليم التجربة إلى ماريا، التي ستصحبكم خلال عملية تضخيم mRNA وتخليق CDNA.

شكراً لكِ يا هانا. قبل أن نبدأ بتضخيم mRNA، احسبي أحجام كل مكون من المزيج الرئيسي لمجموعة Ambien message AMP two bacteria عبر الإنترنت، ثم نبدأ بعملية إضافة تيل polyadenylation لـ RNA القالب عن طريق وضع ما يصل إلى 1000 nanograms من RNA الكلي في أنبوب micro fuge معقم وخالٍ من RNA. استخدمي 6.5 µL من العينة وبدون RNA free water في المنظم الأول لتخليق RNA من خلال النسخ في المختبر in vitro transcription.

يُنصح باستخدام فرن تهجين أو حاضنة نظرًا لدرجة حرارتهما الموحدة. ولأنه من الضروري للغاية عدم تشكّل تكثيف داخل الأنابيب، فإننا نوصي بشدة بفترة تحضين لتفاعل النسخ في المختبر (in vitro transcription) لمدة 14 ساعة. ولتحقيق أقصى قدر من إنتاج RNA، وللحصول على أعلى عائد من RNA، يُجرى تفاعل IBT في حجم تفاعل نهائي قدره 40 µL، ويُحفظ RNA عند درجة حرارة -80 °C في حصص تبلغ حوالي 10 µL.

بمجرد تضخيم الـ RNA، يحين وقت تخليق الحمض النووي المتمم أو الـ cDNA. تُستخدم مجموعة نظام تخليق الـ cDNA ribot Clone الشاملة من Promega لتخليق الـ cDNA من الـ RNA. توفر المجموعة تعليمات لتحويل 2 µg من الـ RNA إلى cDNA. ونوصي باستخدام كمية مدخلة تتراوح بين 6 إلى 10 µg من الـ RNA وتعديل حجم التفاعلات وفقاً لذلك.

قم بتنقية الـ CD NA باستخدام إما الترسيب بالإيثانول أو نظام Promega Wizard لتنقية الـ DNA. وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، تُحفظ العينات في درجة حرارة 80- °C. يمكن في هذه المرحلة إجراء تسلسل مباشر لـ CDNA مزدوج السلسلة. من 10 liters من مياه البحر، استخلصنا ما يقرب من 10 micrograms من الـ RNA البيئي وقمنا بتضخيمه بمقدار 20 ضعفاً؛ ومن خلال تحويل الـ MR.NA المُضخّم إلى CDNA مزدوج السلسلة، تم توليد كميات كافية من المواد لإجراء التسلسل والتحليل للنُسخ البيئية. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تقييم التعبير الجيني للمجتمعات الميكروبية البحرية باستخدام الميتا-ترانسكريبتوميكس البيئية.

تذكر دائماً عند تنفيذ هذا الإجراء أن الـ mRNA يتحلل بسرعة وأن الـ RNAs منتشرة في كل مكان. لذا، اتخذ الاحتياطات القياسية للعمل في بيئة خالية من الريبونوكلياز وقم بمعالجة العينات بأسرع ما يمكن. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.