تحليل الجينات من المجتمعات الميكروبية البحرية باستخدام Transcriptomics البيئية

يبدأ هذا الإجراء بالحصول على الكتلة الحيوية الميكروبية البحرية من عينات المياه عن طريق الترشيح المسبق من خلال مرشحات خمسة وثلاثة ميكرومترات ، تليها التجميع على مرشح 0.22 ميكرومتر. ثم يتم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الكائنات الحية المحتجزة على مرشح 0.22 ميكرومتر. تتم إزالة الحمض النووي الريبي الخاص بنا من إجمالي الحمض النووي الريبي عن طريق التحلل الأنزيمي الانتقائي والتهجين الطرحي المخصب ، ويتم تضخيم Mr.N خطيا عبر مخلفات polyA والنسخ في المختبر.

ثم يتم تحويل الحمض النووي الريبي المضاد للمعنى إلى قرص مضغوط مزدوج تقطعت به السبل باستخدام سداسي عشوائي. يمكن استنساخ القرص المضغوط NA الناتج وتسلسله أو تسلسله مباشرة. مرحبا ، أنا راشيل بيرسكي من مختبر الدكتورة ماريان موران في قسم علوم البحار بجامعة جورجيا.

سنعرض لكم اليوم إجراء للنظر في التعبير الجيني من العينات البيئية. استخدام النسخ الفوقية البيئية. سيوضح لك سكوت جيفورد كيفية معالجة العينات البيئية لجمع الحمض النووي الريبي.

سأوضح لك كيفية استخراج الحمض النووي الريبي من العينات و Johanna RINs. سيوضح AON إزالة الحمض النووي الريبي. ستمر ماريا كوستا بعد ذلك بخطوات تضخيم الحمض النووي الريبي وتوليف CD NA.

لذلك دعونا نبدأ. لبدء جمع الحمض النووي الريبي البيئي ، قمنا بإعداد نظام خط الترشيح عن طريق وضع أحد طرفي الأنبوب في الماء بالعمق المطلوب لأخذ العينات وإرفاق الطرف المقابل بمرشح كبير الحجم بحجم ثلاثة ميكرومتر يضع المضخة بين طرفي الأنبوب. ثم يتم توصيل مرشح الميكرومتر الثلاثة ببرج المرشح 0.22 ميكرومتر ويتم توجيه التدفق الخارجي من برج 0.22 ميكرومتر إلى شحنة متدرجة.

قم بتشغيل عدة لترات من الماء عبر النظام للشطف. عند الانتهاء ، قم بإزالة الأنبوب من الماء أثناء تشغيل المضخة لتطهير المياه المتبقية من الخط. بعد ذلك ، استخدم زوجا من الملقط لوضع مرشح 0.22 ميكرومتر على برج المرشح وإغلاقه.

ضع نهاية الخط مرة أخرى في الماء وقم بتشغيل المضخة. اسمح بتطهير الهواء من كل من المرشحات ومراقبة حجم المياه التي تمت تصفيتها باستخدام الكاربوي. بمجرد تصفية الحجم المطلوب ، قم بإزالة الخط من الماء وقم بإخراج الماء المتبقي من النظام.

بمجرد أن يجف الفلتر ، قم بإزالة لوحة المرشح العلوية بسرعة وقم بطي ورق الترشيح. ضع الفلتر في عبوة دوامة وقم بتجميده في النيتروجين السائل. قبل أن نبدأ التجربة ، من المهم ملاحظة أنه نظرا لأن الحمض النووي الريبي موجود في كل مكان وأن الحمض النووي الريبي المرسال يتحلل بسرعة ، يجب اتباع الاحتياطات القياسية للعمل في بيئة خالية من الريبونوكلياز ، بما في ذلك أسطح العمل والماصات.

مع وضع ذلك في الاعتبار ، يجب ارتداء قفازات نظيفة عند التعامل مع أي مواد مستخدمة في هذا الإجراء. ويجب معالجة العينات في أقصر وقت ممكن. لبدء استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من مرشح 0.22 ميكرومتر ، نقوم بإعداد أنابيب ديكور الخرز عن طريق إضافة ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت RLT مع إضافة بيتا ميتو إيثانول إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا.

ثم يضاف مل إلى ملليلتر من حبات الحمض النووي الريبي من مجموعة استخراج التربة المتنقلة. قم بإزالة الفلتر المجمد بسرعة من الفريزر واحتفظ به في العبوة العالمية. حطمها بمطرقة.

أضف الفلتر المحطم إلى الأنبوب المخروطي المحضر سعة 50 مليلتر وأغلق غطاء الأنبوب بدوامة العطر أو شريط المختبر لمدة 10 دقائق. ثم قم بالطرد المركزي لأنبوب 50 مليلتر بسرعة 5 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المحللة وانقله إلى أنبوب سعة 15 مليلتر قبل الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق.

عند 5 ، 000 مرة G ، يتم نقل المادة الطافية بعد ذلك إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر ويضاف حجم واحد من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى المحللة. باستخدام حقنة 10 ملليلتر ، ارسم المحللة لأعلى من خلال إبرة قياس 18 إلى 21 وقم بتمريرها مرة أخرى حوالي خمس مرات. خطوات الاستخراج اللاحقة ، استخدم KaiGen R ومجموعة صغيرة سهلة باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، وتطبيق المحللة على العمود المقدم إما باستخدام مشعب الفراغ أو مع الطرد المركزي المتكرر.

حدد إجمالي طيف الحمض النووي الريبي ضوئيا. بعد تحديد إجمالي إنتاجية الحمض النووي الريبي ، نستخدم مجموعة Ambien turbo الخالية من الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإزالة أي تلوث بالحمض النووي. الآن بعد أن اكتملت عمليات استخراج الحمض النووي الريبي ، سأقوم بتسليم إجمالي الحمض النووي الريبي إلى جوانا ، التي ستقوم بخطوتي إزالة RRNA الأولى والثانية.

شكرا راشيل. لبدء إزالة RRNA ، قم بخلط الطرد المركزي برفق والطرد المركزي ل mRNA 10 مرات فقط قبل استخدامه في أنبوب معقم خال من الحمض النووي الريبي 0.5 مليلتر ، اجمع بين الأحجام المناسبة لمثبط الحمض النووي الريبي العازل للتفاعل 10 مرات ، وعينة الحمض النووي الريبي الإجمالية ونوكلاز خارجي المنهي. وفقا لبروتوكول مركز الزلزال ، احتضن التفاعل عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في جهاز تدوير حراري بغطاء ساخن أو حمام مائي.

بعد ذلك ، قم بإنهاء التفاعل بترسيب الإيثانول الفينول عن طريق إضافة الماء الخالي من الحمض النووي الريبي أولا إلى الحجم الإجمالي البالغ 200 ميكرولتر ثم إضافة حجم واحد من محلول كلوروفورم الفينول واحد إلى واحد إلى جهاز الطرد المركزي mRNA. اجمع المرحلة المائية ثم قم بترسيب الإيثانول والاعتداء بنسبة مائة بالمائة. هذه نقطة توقف محتملة.

يمكن تخزين الحمض النووي الريبي عند سالب 80 درجة مئوية حتى يصبح المرء جاهزا لاستخدام العينة في التطبيقات النهائية. بمجرد الانتهاء من أول تخصيب mRNA ، سنستخدم مجموعات إثراء ميكروب Ambien والميكروبات السريعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإزالة أي RRNA متبقي من عينتنا. لتسهيل إزالة RRNA حقيقيات النواة ، سنستخدم مجموعة تخصيب الميكروب.

يتم تحديد جميع الأحجام من خلال قراءة تعليمات الشركة المصنعة. لبدء الماصة ، 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. أضف خمسة إلى 100 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي بحد أقصى 30 ميكرولتر ودوامة.

أضف برفق ميكرولترين من مزيج oligo الالتقاط لخمسة ميكروغرامات من الحمض النووي الريبي في مخزن مؤقت ملزم واضغط على الأنبوب برفق. قم بتدوير الخليط لفترة وجيزة. قم بتغيير طبيعة الخليط على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل ركوع الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

خلال هذه الحضانة ، قم بإعداد حبات oligo mag عن طريق غسلها مرة واحدة في ماء خال من النوكلياز ومرة واحدة في مخزن مؤقت ملزم والتقاط الخرزات على حامل مغناطيسي بين الغسل. قم بتخزين الخرز على الثلج وقم بتسخينه إلى درجة حرارة الغرفة. قبل خمس دقائق من الاستخدام ، قم بتسخين محلول الغسيل إلى 37 درجة مئوية في كتلة حرارية.

أضف مزيج oligo لالتقاط الحمض النووي الريبي إلى حبات oligo mag المغسولة ، ودفن برفق ، واخلط الأنبوب وقم بالدوران. احتضن المزيج لفترة وجيزة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي وانتظر حوالي ثلاث دقائق قبل شفط الرنا المرسال المحتوي على المادة الطافية ثم نقله إلى أنبوب تجميع على الجليد.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الغسيل الدافئ مسبقا إلى الخرز الملتقط. والدوامة بلطف التقط الخرزات واستعادة الأحمق الطاف. هذا المادة الطافية مع Mr.NA في أنبوب التجميع على الجليد.

ضع أنبوب تجميع على الجليد أثناء التحضير لإزالة RRNA بدائية النواة باستخدام مجموعة Ambi microbe Express ، والتي سنستخدمها لإزالة بدائية النواة المتبقية ، RRNA. استخدم المحلل الحيوي أو Experion للتحقق من تلوث RRNA و MR. جودة NA. هذه نقطة توقف محتملة.

يمكن تخزين الحمض النووي الريبي عند سالب 80 درجة مئوية. بمجرد إزالة RRNA ، سنستخدم مجموعة البكتيريا الخاصة برسالة Ambien AMP وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتضخيم mRNA الخاص بنا. والآن بعد أن أصبح لدينا عينة نقية من mRNA ، سأسلم التجربة إلى ماريا ، التي ستأخذك من خلال تضخيم mRNA وتخليق CDNA.

شكرا لك هانا. قبل أن نبدأ في تضخيم الرنا المرسال ، احسب أحجام كل مكون من مكونات رسالة Ambien AMP اثنين من مجموعات البكتيريا الرئيسية عبر الإنترنت ، نبدأ بولي الأدينيل لقالب الحمض النووي الريبي عن طريق وضع ما يصل إلى 1000 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي في أنبوب دقيق معقم خال من الحمض النووي الريبي. استخدم 6.5 ميكرولتر من العينة ولا يوجد ماء خال من الحمض النووي الريبي في المخزن المؤقت الأول لتصنيع الحمض النووي الريبي من خلال النسخ في المختبر.

يوصى باستخدام فرن أو حاضنة تهجين بسبب درجة حرارتها الموحدة. ولأنه من المهم للغاية ألا يتشكل التكثيف داخل الأنابيب ، فإننا نوصي بشدة بحضانة تفاعل النسخ في المختبر لمدة 14 ساعة. لتعظيم عائد الحمض النووي الريبي لأعلى عائد A RNA ، قم بإجراء IBT في حجم تفاعل نهائي 40 ميكرولتر ، قم بتخزين A RNA عند سالب 80 درجة مئوية في quats تساوي حوالي 10 ميكرولتر.

بمجرد تضخيم الحمض النووي الريبي ، فقد حان الوقت لتجميع التكميلي أو CDNA. استنساخ ريبوت عالمي Promega. تستخدم مجموعة نظام التوليف CDNA لتصنيع CD NA من NA. توفر المجموعة تعليمات لتحويل ميكروغرامين ، NA إلى CD NA. نوصي بإدخال ستة إلى 10 ميكروغرامات في NA وقياس التفاعلات وفقا لذلك.

قم بتنظيف القرص المضغوط NA باستخدام ترسيب الإيثانول أو نظام تنظيف الحمض النووي لمعالج promega. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، يمكن تسلسل عينات التخزين عند سالب 80 درجة مئوية CDNA المزدوج الذي تقطعت به السبل مباشرة في هذه المرحلة من 10 لترات من مياه البحر ، واستخرجنا ما يقرب من 10 ميكروغرامات من الحمض النووي الريبي البيئي وقمنا بتضخيمه عند 20 ضعفا من خلال تحويل MR المضخم. تم إنشاء NA إلى CDNA المزدوج الذي تقطعت به السبل بكميات كافية من المواد لتسلسل وتحليل النصوص البيئية. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تقييم التعبير الجيني من المجتمعات الميكروبية البحرية باستخدام النسخ الفوقية البيئية.

تذكر دائما أنه عند القيام بهذا الإجراء ، يتحلل الحمض النووي الريبي بسرعة والحمض النووي الريبي في كل مكان. لذا اتخذ الاحتياطات القياسية للعمل في بيئة خالية من نواة الضلع وقم بمعالجة العينات في أسرع وقت ممكن. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.