Name: Microinjection من البويضات المورق القيطم (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: تعلم تقنية الحقن الدقيق في بويضات Xenopus laevis لدراسة آليات النقل النووي السيتوبلازمي باستخدام المجهر الإلكتروني. هذه الطريقة تساعد الباحثين على فهم عمليات الاستيراد النووي الخلوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر ديفيد Theilmann (المحيط الهادئ الأغذية الزراعية مركز البحوث ، سمرلاند ، كولومبيا البريطانية) لتوفير AcMNPV الفيروسة العصوية ومفيدة للمناقشة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المؤسسة الكندية للابتكار (CFI) ، والمعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CIHR) ، ومؤسسة مايكل سميث للبحوث الصحية (MSFHR) ، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) .

الجزء 1 : إعداد البويضات لالقيطم microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطعة صغيرة (حوالى 2 سم) من المبيض المورق القيطم في أنبوب 50 مل مخروطي يحتوي على 20 مل من محلول كولاجيناز (5 ملغ / مل كولاجيناز في الكالسيوم الخالية تعديل بارت والمالحة : مم 0.82 88 مم كلوريد الصوديوم ، 1 ملم بوكل ، MgSO 4 ، 10 Hepes ملم ، ودرجة الحموضة 7.5). يستخدم كولاجيناز لإزالة الخلايا التي تحيط جريب البويضات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب على منصة شاكر والصخور برفق (عند 100 دورة في الدقيقة) لمدة ساعة. هذه المرة يختلف مع الكثير من كولاجيناز مختلفة. هكذا بعد ساعة واحدة ، أخذ عينة صغيرة من البويضات وفحصها تحت المجهر تشريح. وينبغي أن يكون صحيح دي folliculated البويضات مفصولة عن بعضها البعض جيدا ، وينبغي أن يكون من السهل ادخال ابرة الزجاج في البويضة. إذا ليست كافية البويضات دي folliculated ، وتركوا في حل كولاجيناز ودققت مرة أخرى في كل خمس دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البويضات ثلاث مرات مع المالحة تعديل بارت في (MBS : 88 مم كلوريد الصوديوم ، 1 ملم بوكل ، 0.82 ملي MgSO 4 ، 0.33 ملي كا (NO 3) 2 ، 0.41 ملي CaCl 2 ، 10 Hepes ملم ، ودرجة الحموضة 7.5) ، ونقل لهم لصحن قطره 100 ملم بتري تحتوي MBS زائد 1 ٪ البنسلين الستربتوميسين /. والبويضات هي الآن جاهزة للmicroinjected. إذا كان سيتم تنفيذ microinjection في يوم آخر ، وتخزين البويضات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح ، حدد البويضات الناضجة للمرحلة السادسة microinjection. هذه البويضات تكون كبيرة ، وعلى النقيض جيدة بين نصف الكرة السوداء والحيوان دسم نصف الكرة الملونة النباتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سادسا نقل البويضات في مرحلة ناضجة لوحة microwell (نونك ، 10 حجم جيدا ميكرولتر). وينبغي أن يتم ذلك بعناية ، وذلك باستخدام pipettor 200 ميكرولتر مع طرف ماصة أنه تم قطع في نهاية السماح شفط undisrupted من البويضات. </li></ol> الجزء 2 : Microinjection من البويضات القيطم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الركيزة استيراد لتكون microinjected بإضافة كمية صغيرة من اللون الأزرق برومفينول 1 ٪ ، للمساعدة في التصور من microinjection. على سبيل المثال ، أن نضيف 1 ميكرولتر من اللون الأزرق برومفينول إلى 10 ميكرولتر من الركيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريط صغير من Parafilm على طبق بتري قطرها 100 ملم ، والاستغناء عن انخفاض 5 ميكرولتر من الحل ليتم حقنه في الشريط Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبرة حقن ملء معايرة سابقا (التي تم الحصول عليها عن طريق سحب 6.6 ميكرولتر micropipette دروموند مع بولير + لحقن ماتيتش) مع الحل ليتم حقنه. لهذا ، تم تعيين microinjector على وضع الطموح. لمعايرة إبرة الحقن جعل علامات نقطة على كل إبرة 0.5 مم ، والتي تتوافق مع حجم 50 NL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحقن حشوية ، إدراج غيض من الإبرة إلى بويضة في نصف الكرة النباتي ، وقريب جدا من الكرة الأرضية الحيوان ، بزاوية حوالي 45 درجة. بدوره الإعداد لmicroinjector microinject وmicroinject كل بويضة مع 50 من الركيزة NL الاستيراد. تستخدم علامات نقطة على الإبرة لرصد مبلغ الركيزة التي تم حقنها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات لحقن طبق صغير بيتري (35 ملم القطر) مليئة MBS ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة عن المبلغ المطلوب من الوقت (ويتم اختيار النقاط الزمنية وذلك للسماح للمراقبة الركيزة الاستيراد المرتبطة الشخصيات ، وهذا يحدث بين 10 و 30 دقائق للبروتينات والفيروسات التي تنقل نحو نشط للمجلس الوطنى ، وهذا الوقت يعتمد أيضا على موقع الحقن وحجم البروتين / فيروس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال الحضانة ، ونقل البويضات إلى قارورة زجاجية تحتوي على 4 ميلي غلوتارالدهيد 2 ٪ في MBS ، والإصلاح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li></ol> الجزء 3 : تشريح الضفدع من البويضات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، وغسل البويضات 3 مرات مع MBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات في طبق بتري صغيرة مليئة العازلة الملح منخفضة (LSB : 1 ملم بوكل ، 0.5 ملي MgCl 2 ، 10 HEPES ملم ، ودرجة الحموضة 7.5). باستخدام مجهر تشريح تشريح وملاقط ، وإزالة القطب نباتية من كل بويضة. ومن المفيد لاستقرار البويضة يتم تشريح مع زوج واحد من ملاقط ، في حين يستخدم هذا الزوج الأخرى مثل المقص لإزالة القطب نباتية. عند هذه النقطة كان من الممكن لتقييم نجاح microinjection وجود مسحة زرقاء في العصارة الخلوية. هو استمرار للبروتوكول فقط للالبويضات التي تم microinjected بنجاح. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت العينات لتكون على استعداد لEM ، تشريح هذه الخطوة يجعل من الاسهل بكثير للعثور على نواة عندما التشذيب وsectioning العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح البويضات تشريح غلوتارالدهيد مرة أخرى مع 2 ٪ في LSB لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التثبيت ، وغسل البويضات تشريح ثلاث مرات مع LSB. </li></ol> الجزء 4 : إعداد البويضات المصبوبة لتضمينها ورقيقة Sectioning EM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات إلى شريحة تشريح الكآبة. نضح قدر من السائل ونقاط البيعsible ، ثم سرعان ما (بحيث لا تجف) تغطية البويضات تشريح مع ذوبان agarose منخفضة 2 ٪. بينما لا تزال لينة agarose ، استخدام غيض ماصة للفصل بين البويضات من بعضها البعض ، وضمان أن كل بويضة هو وجه أعلى أو إلى أسفل (وليس جانبيا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لترسيخ agarose لمدة 10 دقائق تقريبا. مرة واحدة في agarose يتصلب ، واستخدام شفرة حلاقة لقطع agarose الى قطع صغيرة ، كل منها تحتوي على واحد البويضة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البويضات agarose جزءا لا يتجزأ في قارورة زجاجية 4 مل ، وبعد إصلاح لهم 1 ٪ أوسو 4 في LSB لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينة ثلاث مرات في LSB. إذا لزم الأمر ، وتخزين العينة في 4 درجات مئوية خلال الليل والاستمرار في البروتوكول في اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى بالتسلسل العينات في سلسلة الصاعد من الكحول (50 ، 70 ، والايثانول 90 ٪ لمدة 20 دقيقة لكل منهما). ويتبع هذا من قبل اثنين من التغييرات في الإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 15 دقيقة لكل منهما. يذوى أخيرا العينات مع الأسيتون 100 ٪ لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسلل العينات مع مزيج من EPON 01:01 (Fluka) والأسيتون لمدة ساعة واحدة ، تليها تسلل بمزيج من 02:01 EPON والأسيتون لمدة ساعتين ، وأخيرا في EPON نقية على الأقل ست ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات من مكان في قوالب تضمين شقة مليئة EPON النقي الطازج. والبويضات موجهة بطريقة أن الجانب النواة أقرب إلى موقع الحقن -- في هذه الحالة جانب البويضات التي تم تشريح -- سيتم مقطوع الأولى. هذه الخطوة يحسن من فرص تصور استيراد الركيزة المختار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، وتتبلمر EPON لمدة يومين في 60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل رؤية العينات ، يتم قطع الكتل ومقطوع ثم باستخدام مشراح مستدق. يتم نقل المقاطع على شبكات EM ملون باستخدام الإجراء العادي ، وتصور مع انتقال المجهر الالكتروني ، ونحن لن يظهر هذا الجزء من البروتوكول كما هو معيار EM الداخلي. </li></ol> الجزء 5 : نتائج الممثل : إذا كان البروتوكول قد حققت نجاحا ، ومن ثم ينبغي المغلف النووية (شمال شرق) والشخصيات تكون مرئية بوضوح في EM micrographs. اعتمادا على الركيزة وحقن مقدار الوقت بين الحقن والتثبيت ، يجب أن تكون مرئية الركيزة في مواجهة حشوية لمجلس الشعب ، في مجلس الشعب ، أو على وجه النووية للمجلس الوطنى. الشكل 1 يبين NE المقطع العرضي مع السيتوبلازم المتاخمة (ج) و النواة (ن) من القيطم البويضة التي تم حقنها capsids من AcMNPV الفيروسة العصوية ، المحتضنة في 4 درجات مئوية لمدة أربع ساعات ، والمجهزة لتضمين والباب رقيقة EM كما هو موضح. النصال أشر إلى الشخصيات. يشار إلى الالتحام قفيصة في مواجهة حشوية لمجلس الشعب بواسطة سهم أبيض. في المقابل ، يظهر الشكل 2 NE المقطع العرضي مع السيتوبلازم المتاخمة (ج) و النواة (ن) من القيطم البويضة التي تم حقنها بفيروس البارفو مع اللحظة من الفئران (MVM) ، حضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات ، و وتجهيزها لتضمين القسم رقيقة EM كما هو موضح. باستخدام هذه التقنية ، وجدنا أن يدفع MVM اضطرابات في الشرق الأدنى (كوهين وPanté ، 2005). بين قوسين تشير فواصل في الشرق الأدنى. النصال أشر إلى الشخصيات. يشار capsids MVM المفترضة المرتبطة NE بواسطة السهام البيضاء. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="الشكل 1" width="600" height="459" /> الشكل 1 : صورة مجهرية إلكترون من شريحة NE مع السيتوبلازم المتاخمة (ج) و النواة (ن) من البويضة القيطم الذي تم حقنه بمادة capsids للزينة MNPV الفيروسة العصوية ، المحتضنة في 4 درجات مئوية لمدة أربع ساعات ، ومعالجتها لل التضمين والباب رقيقة EM كما هو موضح. النصال أشر إلى الشخصيات. يشار Capsids بواسطة السهام البيضاء. شريط الحجم : 100 نانومتر. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="الشكل 2" width="600" height="264" /> الشكل 2 : صورة مجهرية إلكترون من شريحة NE مع السيتوبلازم المتاخمة (ج) و النواة (ن) من القيطم البويضة التي تم حقنها بفيروس البارفو مع اللحظة من الفئران (MVM) ، حضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات ، و وتجهيزها لتضمين القسم رقيقة EM كما هو موضح. النصال أشر إلى الشخصيات. بين قوسين تشير فواصل في الشرق الأدنى. يشار capsids MVM المفترضة المرتبطة NE بواسطة السهام البيضاء. شريط الحجم : 100 نانومتر.

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
</ol>

Microinjection من البويضات القيطم جنبا إلى جنب مع رقيقة sectioning EM هو أداة فعالة للغاية لدراسة نقل النواة للهيولى. وقد استخدم هذا النظام لخريطة خطوات متميزة من الاستيراد عن طريق مجلس الشعب ، على سبيل المثال من التفاعل ركيزة النووية مع استيراد المكونات الهيكلية للمجلس الوطنى مثل خيوط حشوية وسلة النووية (التي استعرضها Panté ، 2006). كما تم استخدامه لدراسة استيراد النووية النووية تكرار الفيروسات (Panté وKann ، 2002 ؛ رابي وآخرون ، 2003 ؛ كوهين وPanté ، 2...

microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection من البويضات المورق القيطم تليها رقيقة sectioning المجهر الإلكتروني (EM) هو نظام ممتاز لدراسة نقل النواة للهيولى. بسبب نواته كبيرة وكثافة عالية من المسام المجمعات النووية (الشخصيات) ، يمكن أن يكون النقل النووي بسهولة في البويضة القيطم. وقد اكتسبت الكثير من التبصر في آليات الاستيراد والتصدير النووي من خلال استخدام هذا النظام (استعرضها Panté ، 2006). بالإضافة إلى ذلك ، فقد استخدمنا microinjection من البويضات لتشريح الضفدع مسارات استيراد النووية عدة من الفيروسات التي تتكاثر في النواة المضيفة. نحن هنا لشرح microinjection هيولي من البويضات القيطم مع ركيزة استيراد النووية. نعرض أيضا إعداد البويضات لحقن التصور بواسطة رقيقة sectioning EM ، بما في ذلك تشريح ، والجفاف ، وتضمينها في البويضات الى الراتنج الايبوكسي التضمين. أخيرا ، ونحن نقدم نتائج ممثل عن البويضات التي تم microinjected مع قفيصة من nucleopolyhedrovirus الفيروسة العصوية californica Autographa (AcMNPV) أو فيروس البارفو اللحظة من الفئران (MVM) ، ومناقشة التطبيقات الممكنة لهذه التقنية.

هنا علينا أن نظهر للحشوية microinjection<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات مع ركيزة استيراد النووية ، فضلا عن التحضير للحقن البويضات عن التصور بواسطة المجهر الإلكتروني رقيقة sectioning.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

يُعد الحقن المجهري لبويضات ضفدع Xenopus laevis متبوعاً بالمجهر الإلكتروني (EM) باستخدام المقاطع الرقيقة نظاماً ممتازاً لدراسة التفاعل بين النواة والسيتوبلازم...

يعد الحقن المجهري لبويضات Opus Lavu، المتبوع بتقنية المجهر الإلكتروني للمقاطع الرقيقة، نظاماً ممتازاً لدراسة النقل النووي السيتوبلازمي. في هذه التجربة، يتم إزالة الغلاف الخارجي للبويضات باستخدام الكولاجيناز، ثم تُختار البويضات في المرحلة السادسة وتوضع في طبق متعدد الآبار. بعد ذلك، يتم حقن البويضات مجهرياً بمادة ركيزة للاستيراد النووي بعد تحضين البويضات في درجة حرارة الغرفة للسماح للركيزة بدخول النواة.يتم تثبيت الخلايا وتشريحها. ثم تُطمر الخلايا المشرحة في أغار منخفض درجة الانصهار، وتُثبّت مرة أخرى باستخدام رباعي أكسيد الأوزميوم، ثم تُجفف وتُطمر في راتنج إيبوكسي. وتُقطع العينات المغمورة في الإيبوكسي باستخدام الميكروتوم الفائق، ثم توضع المقاطع على شبكة نحاسية مخصصة للعينات الإلكترونية.بعد الصبغ، يتم فحص المقاطع تحت مجهر إلكتروني نافذ. مرحبًا، أنا سارة كوهين من مختبر الدكتورة نيلي باني في قسم علم الحيوان بجامعة كولومبيا البريطانية. وأنا شيلي أو، من مختبر باني أيضًا.سنعرض لكم اليوم إجراءً للحقن المجهري لخلايا Xenopus laevis. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الاستيراد النووي للشحنات مثل الفيروسات. لذا، لنبدأ الآن.لبدء التجربة، ضع قطعة صغيرة بطول حوالي سنتيمترين من مبيض Zenap Lavis في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على 20 ملليلتر من محلول الكولاجيناز. يعمل الكولاجيناز على إزالة الخلايا الجريبية التي تحيط بالخلايا، ثم ضع الأنبوب على منصة الرجّ وقم برجّه بلطف بسرعة 100 RPM لمدة 30 دقيقة. تختلف هذه المدة باختلاف دفعات الكولاجيناز المستخدمة.وبعد مرور ساعة واحدة، خذ عينة صغيرة من الخلايا وافحصها تحت مجهر تشريحي. يجب أن تكون الخلايا التي تم نزع أوراقها بشكل صحيح منفصلة جيداً عن بعضها البعض. أدخل إبرة زجاجية في إحدى الخلايا للتأكد من أنها تنزلق بسهولة.إذا لم تكن الخلايا قد فقدت تيجانها بشكل كافٍ، اتركها في محلول الكولاجيناز وافحصها مرة أخرى كل خمس دقائق. وبمجرد أن تصبح الخلايا غير منتظمة الشكل بشكل كافٍ، اغسلها ثلاث مرات بمحلول ملحي معدل، ثم انقلها إلى طبق بتري بقطر 100 مليمتر يحتوي على MBS مضافاً إليه 1% Penicillin streptomycin. وباستخدام مجهر تشريحي، اختر الخلايا الناضجة في المرحلة السادسة لإجراء الحقن المجهري.تتميز هذه الخلايا بحجمها الكبير مع تباين جيد بين نصف الكرة الحيواني الأسود ونصف الكرة الخضري ذو اللون الكريمي. انقل الخلايا الناضجة في المرحلة السادسة إلى طبق متعدد الآبار. وللقيام بذلك، استخدم ماصة سعة 200 µL مع طرف ماصة مقطوع الطرف للسماح بشفط البويضات دون إتلافها، ثم انقل البويضات بعناية إلى الطبق متعدد الآبار.نستخدم طبقاً يحتوي على آبار دقيقة بحجم بئر 10 µL، وقد أصبحت مواقع EO الآن جاهزة للحقن المجهري. قم بتحضير الركيزة المراد حقنها مجهرياً عن طريق إضافة 1 µL من brom phenol blue بتركيز 1% إلى 10 µL من الركيزة. تتيح صبغة brom phenol blue إمكانية رؤية عملية الحقن المجهري.بعد ذلك، ضع شريطاً صغيراً من البارافورم على طبق بتري بقطر 100 مليمتر، ثم وزع قطرة بحجم 5 µL من محلول الحقن على شريط البارافورم. تالياً، قم بتجهيز إبرة الحقن عن طريق سحب ماصة Drummond دقيقة بحجم 6.6 µL باستخدام جهاز Matt Puller. عاير إبرة الحقن من خلال وضع علامات نقطية على الإبرة كل 0.5 مليمتر، وهو ما يعادل حجماً مقداره 50 نانولتر. اضبط المحقن الدقيق على وضع السحب، ثم املأ الإبرة بمحلول الحقن المخصص للحقن السيتوبلازمي.أدخل طرف الإبرة في خلية في نصف الكرة النباتي، على مقربة شديدة من نصف الكرة الحيواني بزاوية 45 درجة تقريبًا. بعد ذلك، قم بتحويل إعدادات المحقن الدقيق إلى وضع الحقن الدقيق، واحقق كل خلية بـ 50 nanoliters من مادة الركيزة المستوردة. راقب علامات النقاط الموجودة على الإبرة لمتابعة كمية الركيزة التي تم حقنها عند اكتمال عمليات الحقن.انقل الخلايا إلى طبق بتري بقطر 35 مليمتر مملوء بمحلول MBS. قم بتحضين الخلايا في درجة حرارة الغرفة للمدة الزمنية المطلوبة. اختر نقاطاً زمنية تتيح مراقبة ركيزة الاستيراد المرتبطة بالمعقدات المسامية النووية أو NPCs.نستخدم عادةً نقاطاً زمنية تتراوح بين 10 و30 دقيقة للبروتينات والفيروسات التي تُنقل بنشاط نحو معقد المسام النووية (NPC). تعتمد هذه النقاط الزمنية أيضاً على موقع الحقن وحجم البروتين أو الفيروس. عند اكتمال فترة الحضن، انقل الخلايا إلى قارورة زجاجية سعة 4 مل تحتوي على 2% glutaraldehyde في محلول MBS، وقم بالتثبيت طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول MBS، وبذلك نكون جاهزين لتشريح الخلايا.انقل الخلايا إلى طبق بتري صغير مملوء بمحلول منظم منخفض الملوحة. وباستخدام مجهر تشريحي وملاقط تشريح، قم بإزالة القطب النباتي من كل خلية بيضية. ومن المفيد تثبيت الخلية البيضية بزوج من الملاقط بينما يُستخدم الزوج الآخر كالمقص لإزالة القطب النباتي؛ حيث تجعل خطوة التشريح هذه العثور على النواة أسهل بكثير عند تقليم العينات وتقطيعها للفحص بالمجهر الإلكتروني.في هذه المرحلة، تشير المسحة الزرقاء في السيتوسول إلى نجاح عملية الحقن المجهري؛ لذا يجب استبعاد الخلايا التي لم يتم حقنها مجهرياً بنجاح. بعد ذلك، يتم تثبيت الخلايا المشرحة مرة أخرى باستخدام 2% glutaraldehyde في LSB لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وبعد التثبيت، تُغسل الخلايا المشرحة ثلاث مرات باستخدام LSB. وبمجرد غسل الخلايا، نصبح مستعدين لتجهيز البويضات المحقونة لعمليتي التضمين والتقطيع الرقيق بواسطة em.انقل البويضات التي تم تشريحها إلى شريحة مقعرة، واشفط أكبر قدر ممكن من السائل، ثم تصرف بسرعة حتى لا تجف. غطِّ الخلايا المشرحة بـ 2% low melting agarose بينما لا يزال agarose ليناً. استخدم رأس ماصة لفصل الخلايا عن بعضها البعض ولضمان أن تكون كل خلية إما للأعلى أو للأسفل، وليس جانبيًا.اترك الأجار ليتصلب لمدة 10 دقائق تقريبًا. وبمجرد تصلب الأجار، استخدم شفرة حلاقة لتقطيع الأجار إلى قطع صغيرة تحتوي كل منها على خلية واحدة تم تشريحها. بعد ذلك، ضع الخلايا المدمجة في الأجار في قارورة زجاجية سعة 4 مل، وباستخدام جهاز خلط دوار، قم بتثبيتها باستخدام 1% osmium tetroxide في LSB لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.بعد التثبيت لمدة ساعة واحدة، اغسل العينة ثلاث مرات في LSB إذا لزم الأمر. تُحفظ العينة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل، ثم يُستكمل البروتوكول في اليوم التالي. يتم تجفيف العينات بالتسلسل في ethanol بتركيز 50% و70% و90% لمدة 20 دقيقة لكل تركيز، ثم تُجفف مرتين في ethanol بتركيز 100% لمدة 15 دقيقة في كل مرة.أخيرًا، قم بتجفيف العينات باستخدام أسيتون 100% لمدة 15 دقيقة. بعد اكتمال خطوات التجفيف، قم بتغلغل العينات باستخدام خليط بنسبة واحد إلى واحد من epon و flua والأسيتون لمدة ساعة واحدة، يليه التغلغل باستخدام خليط بنسبة اثنين إلى واحد من epon والأسيتون لمدة ساعتين، وأخيرًا في epon نقي لمدة ست ساعات على الأقل. عند اكتمال خطوة التغلغل النهائية، ضع العينات في قوالب تضمين مسطحة مملوءة بـ epon نقي وطازج.قم بتوجيه الخلايا بحيث يتم تقطيع الجانب من النواة الأقرب إلى موقع الحقن أولاً. في هذه الحالة، سيتم تقطيع جانب الخلايا الذي تم تشريحه أولاً، حيث تعمل هذه الخطوة على تحسين فرصة رؤية استيراد المادة المختارة.بمجرد توجيه الخلايا بشكل صحيح، قم ببلمرة الإيبون لمدة يومين عند 60 °C. بعد خطوة البلمرة، احصل على مقاطع بسمك 50 nanometer من العينات المدمجة في الإيبوكسي باستخدام الميكروتوم الفائق (ultra microtome). اجمع المقاطع على شبكة عينات نحاسية للمجهر الإلكتروني، وقم بصبغ العينات وفحصها باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ.إذا نجح البروتوكول، فيجب أن يكون الغلاف النووي ومعقدات الثقوب النووية (NPCs) مرئية بوضوح في الصور المجهرية الإلكترونية. واعتماداً على المادة المحقونة والمدة الزمنية الفاصلة بين الحقن والتثبيت، يجب أن تكون المادة مرئية عند الوجه السيتوبلازمي لـ NPC أو عند الوجه النووي لـ NPC. تظهر هذه النتيجة التمثيلية مقطعاً عرضياً للغلاف النووي مع السيتوبلازم والنواة المجاورة من خلية zenap تم حقنها بكابسيدات فيروس vao.تشير رؤوس السهام A-C-M-N-P-V إلى معقدات الثقوب النووية (NPCs)، ويشير سهم أبيض إلى قفيصة مرتبطة بالوجه السيتوبلازمي لـ NPC. في المقابل، يوضح هذا الشكل مقطعاً عرضياً للغلاف النووي مع السيتوبلازم والنواة المجاورتين لبويضة zenap تم حقنها بفيروس البارفو الخاص بالفئران. وباستخدام هذه التقنية، وجدنا أن MVM يحفز حدوث تمزقات في الغلاف النووي.تشير الأقواس إلى الفجوات في الغلاف النووي. تشير رؤوس الأسهم إلى معقدات الثقوب النووية (NPCs)، بينما تشير الأسهم البيضاء إلى كبسيدات MVM المفترضة المرتبطة بالغلاف النووي. لقد شرحنا لكم للتو كيفية الحقن المجهري وتشريح xap levu cytes.عند إجراء هذا البروتوكول، من المهم تذكر أن دفعات الكولاجيناز المختلفة تتباين في فعاليتها. لذا، يجب اختبار الكولاجيناز بعناية لتحديد الوقت الأمثل لإزالة التاج. كما يمكن تخزين الخلايا بعد خطوة إزالة التاج والغسل بمحلول MBS عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل البدء في عملية الحقن المجهري.أخيرًا، حافظ دائمًا على بقاء العينات في الثلج وتجنب جفاف الأنسجة تمامًا. يجب أن تظل العينات مغمورة بالكامل خلال جميع خطوات التجفيف والتغلغل. وبهذا نكون قد انتهينا.شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

القيطم ظهائر الجنينية هي نموذج مثالي لنظام دراسة سلوكيات الخلية مثل التنمية وتغير شكل القطبية خلال التشكل الظهارة. ويتزايد الأنسجة التقليدية لعينات محددة يجري استكمالها التصوير الخلية الحية مبائر. هنا نظهر طرق لعزل الأنسجة الضفادع وتصور الخلايا الظهارية العيش والهيكل الخلوي وذلك باستخدام الخلايا الحية المجهري متحد البؤر.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

إإكسبلنتس زراعة العصبية من...

يزدرع الثقافات العصبية من<em&gt; القيطم المورق</em

نصف طرق التلاعب بالبويضات غير الناضجة Xenopus laevis ، والنضج المختبري للبويضات إلى البويضات ، وحقن المنوية داخل الهيولى. يسمح هذا البروتوكول بتدهور بعض بروتينات الأم والإفراط في التعبير عن الجينات ذات الأهمية عند الإخصاب ، وبالتالي فهو ذو قيمة لدراسة أدوار عوامل محددة في التطور الجنيني المبكر.

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

يحدث التحكم في تخليق البروتين بشكل أساسي في خطوة بدء الترجمة ، حيث ترتبط أوجه القصور باضطرابات متنوعة. لفهم مسببات أسبابهم بشكل أفضل ، وصفنا هنا بروتوكولا باستخدام بويضات Xenopus laevis لتقييم ترجمة نسخة mos في وجود طفرة لعامل بدء الترجمة eIF4G1.

القيطم المورق نموذجا لتحديد الترجمة انخفاض قيمة

مخطوطة يوفر هنا مجموعة بسيطة من طرق لتحليل إفراز ونشر بروابط الموسومة fluorescently في القيطم. ويوفر هذا السياق لاختبار قدرة بروتينات أخرى لتعديل توزيع يجند والسماح التجارب التي قد تعطي نظرة ثاقبة آليات تنظيم التدرجات محدثة التخلق.

باستخدام تحليل متحد البؤر من<em&gt; القيطم المورق</em&gt; بالتحقيق المغيرون من WNT وShh على محدثة التخلق التدرجات

نصف بويضة Xenopus ونظام غطاء حيواني للتعبير عن استنساخ الجينات القادرة على إحداث استجابة في الأديم الظاهر المختص ، ونناقش تقنيات التحليل اللاحق لهذه الجينات. هذا النظام مفيد في التحديد الوظيفي لمجموعة واسعة من المنتجات الجينية.

الاستنساخ وظيفية باستخدام<em&gt; القيطم</em&gt; نظام التعبير البويضة

هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخدام خرائط المصير ومتتبعات النسب لاستهداف الحقن في الأريمات الفردية التي تؤدي إلى ظهور كلية أجنة Xenopus laevis.

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

تم وصف الإجراءات المحسنة لعزل البصيلات المفردة ، والحقن المجهري للحمض النووي الريبي السيتوبلازمي ، وإزالة طبقات الخلايا المحيطة ، والتعبير البروتيني في بويضات Xenopus. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة بسيطة لتغييرات المحلول السريع في التجارب الفيزيولوجية الكهربية مع القنوات الأيونية ذات البوابات الترابطية.

القيطم البويضات: طرق الأمثل ل microinjection، إزالة طبقات الخلية مسامي، والتغييرات الحل السريع في التجارب الكهربية

توضح هذه المقالة تعزيز التقليدية الجهد المشبك فلوروميتري (فف) حيث يتم استخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية (فوا) بدلا من الأصباغ ماليميد، لتحقيق إعادة ترتيب الهيكلي في القنوات الأيونية. ويشمل الإجراء زينوبوس البويضات حقن الحمض النووي، رنا / فوا سوينجكتيون، والقياسات الحالية والضوضاء في وقت واحد.

الجهد المشبك فلوروميتري في<em&gt; القيطم</em&gt; البويضات باستخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية

يهدف هذا البروتوكول إلى توضيح كيفية حقن خليط الحمض النووي/DOTAP بالميكروين في عيون الأجنة القديمة من Xenopus laevis في يوم من الأيام، وكيفية تصوير وإعادة بناء البروتين الفلورسنت الأخضر الفردي (GFP) الذي يعبر عن الأربور اللافسونية البصرية في العقول المتوسطة التكتال سليمة ، والذين يعيشون Xenopus الضفادع.

الحقن المجهري للحمض النووي في براعم العيون في أجنة Xenopus laevis والتصوير من GFP التعبير عن الأشجار Axonal البصرية في سليمة، وحيا Xenopus Tadpoles

نقدم هنا بروتوكولا للتعبير عن بروتينات تقاطع الفجوة في بويضات Xenopus وتسجيل تيار التقاطع بين بويضتين محددتين باستخدام مكبر صوت تجاري مصمم لتسجيل مشبك جهد البويضة المزدوج في وضع قياس التيار الجانبي العالي.

تسجيل فجوة تقاطع التيار من البويضات Xenopus

تعلم تقنية الحقن الدقيق في بويضات Xenopus laevis لدراسة آليات النقل النووي السيتوبلازمي باستخدام المجهر الإلكتروني. هذه الطريقة تساعد الباحثين على فهم عمليات الاستيراد النووي الخلوية.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

استكشف المزيد من الفيديوهات