Name: Microinjection من مرنا والعقاقير أليغنوكليوتيد Morpholino اسماك الزرد في الأجنة. (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: تعلم تقنية حقن دقيقة لإدخال مرنا وأوليغونوكليوتيدات مورفولينو في أجنة أسماك الزرد. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة التعبير الجيني ووظائف الجينات في علم الأحياء التنموي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة PKD لZS. وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا لمركز يال الثروة الحيوانية (YARC) والمؤسسية رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية للجنة (IACUC).

الجزء 1 : إعداد micropipettes وألواح غرفة microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتعال micropipettes عن طريق التسخين وسحب الأنابيب الزجاجية البورسليكات الشعرية (البنك الآلات الدقيقة ، وشركة ، 1B100 - 4) في جهاز مجتذب micropipette (سوتر الآلات ، وشركة يلهب / براون P - 97). مخزن في طبق بتري على أعلى كمية صغيرة من الطين أو شريط لاصق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب agarose 1.5 ٪ (الاميركي Bioanlytical ، شركة ، AB00972 - 00500) في لوحات 1X المتوسطة E3 مصبوب مع اسفين على شكل أحواض من شأنها أن تكون بمثابة طريقة سهلة لعقد أجنة خلال حقن (كما هو موضح في كتاب &#39;اسماك الزرد&quot;) 1. دعونا لوحات أجار الغرفة ترسيخ قبل استخدام وتخزين عند 4 درجة مئوية. </li></ol> الجزء 2 : إعداد RNA نهج واحد قوي للدراسات وظائف الجينات والحمض النووي الريبي لmicroinject في المختبر توج كتب في الأجنة الزرد. توج الجيش الملكي النيبالي سلوك مشابه إلى mRNAs حقيقية النواة الموجودة في الجسم الحي بسبب وجود تمثيلي CAP. الزرد الباحثين الاستفادة بشكل روتيني لهذا الأسلوب أو overexpress misexpress الجين اهتمامهم. في هذه التظاهرة ، فإننا سوف microinject مستخرج EGFP الموسومة واستخدام كامل يعيش الجنين GFP - التعبير بوصفها قراءات مرئية عن طريق الحقن ناجحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء في المختبر CAP رد فعل على النص نسخ الحمض النووي الريبي اهتمامك. في المختبر ، ونحن ادخال بشكل روتيني [كدنا] من الاهتمام الى ناقلات + pCS2 وإجراء كرد فعل التوليف المختبر كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي توج باستخدام mMachine mMessage SP6 مجموعة (Ambion ، شركة ، AM1340). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية عينة الحمض النووي الريبي التي تعمل من خلال مجموعة صغيرة RNeasy (Qiagen ، شركة ، 74104) أو الفينول : استخراج الكلوروفورم والأيزوبروبانول هطول الأمطار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد دقيق للتركيز على إعداد الجيش الملكي النيبالي وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من الحقن ، وأذاب عينة الحمض النووي الريبي ، وتدور الدوامة طفيفة أسفل لفترة وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل تعمل مع الماء المعقم وتركيز النهائي من 0.025 -- 0.050 ٪ أحمر الفينول (سيغما الدريخ شركة P0290). أحمر الفينول بمثابة علامة مرئية لحقن المحلول في جنين. في هذه المقالة ، سوف نستعد حلا مرنا من 100 عامل EGFP نانوغرام / UL مع أحمر الفينول 0.050 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء عينة تعمل على الجليد وعودة السهم إلى رنا -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الجزء 4 عندما تصبح جاهزة لحقن هذه العينة. </li></ol> الجزء 3 : إعداد morpholino وتستخدم على نطاق واسع Morpholino [أليغنوكليوتيد] العقاقير لتعديل التعبير الجيني عن طريق منع ترجمة البروتين المستهدف أو عن طريق تعديل قبل مرنا الربط 2،3. Morpholinos في الزرد بمثابة أداة الوراثة العكسية القوية التي هدمت وظيفة الجين. في هذه المقالة ، فإننا سوف microinject a morpholino جزئية تستهدف موقع من بدء متعدية pkd2 (5&#39; - AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC - 3 &#39;). على أساس العمل المحددة مسبقا ، ونحن نتوقع من حقن الأجنة لتقليد phenotypically pkd2 4 الأسماك متحولة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نأذن بشكل روتيني من 300 nmol بنسبة ضئيلة morpholino مصممة خصيصا لجينة من الاهتمام من أدوات الجينات ، LLC (Philomath ، OR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الماء المعقم UL 100 لجعل مخزون 3 ملم الحل. قسامة الحل وتخزينها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من الحقن ، والحرارة الحل morpholino عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. المفاجئة باردة على الجليد على الفور وتدور لفترة وجيزة. يبدل طبيعة هذه الخطوة أي الهياكل الثانوية في جزئية ويضمن solubilized تماما الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل العامل تمييع الحل morpholino في الماء المعقم وتركيز النهائي من 0.025 -- 0.050 ٪ أحمر الفينول. في هذه المظاهرة ، سنكون إعداد حل عمل 0.50 ملي pkd2 morpholino مع أحمر الفينول 0.050 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة العمل على حل درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الجزء 4 عندما تصبح جاهزة لحقن هذه العينة.---- </li></ol> الجزء 4 : تعبئة micropipette مع الحل الخاص العاملة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس القاصية من micropipette بالملقط أو razorblade الجراحية لإنشاء الافتتاح ان يكون مرئيا فقط تحت المجهر تشريح (نيكون الآلات ، وشركة ، SM2645) في التكبير 50X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 UL مكان من الحل الخاص بك يعمل انخفاض في الصعود إلى ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق الجزء الخلفي من micropipette إلى حقنة 5 مل مزودة أنابيب على إبرة تحت الجلد ويغرق قليلا الطرف البعيد من micropipette إلى إسقاط الخاص من محلول العمل. الحرص على عدم كسر غيض من micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيفون الحل من خلال العمل في نهاية البعيدة للmicropipette عن طريق سحب المكبس من المحاقن. </li></ol> الجزء 5 : معايرة حجم الحقن micropipette <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة من الزيت المعدني (الاميركي Bioanalytical ، شركة ، AB00921 - 00025) على شريحة ميكرون (فايشير ، 12 SM1 - 561). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على السلطة والعرض الجوي للضغط نابض الدقيقة حاقن جهاز (وورلد شركة آلات دقيقة ، PV830). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق micropipette لصاحب micropipette جهاز حاقن الجزئي. حاقن هو الضغط الجزئي للتنظيم وتنشيط الإفرازات عن طريق الضغط على دواسة القدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح تحت المجهر ، واختبار حجم الحقن باستخدام محقنة الدقيقة لوضع قطرة من حل العمل الخاص بك على النفط ميكرون. قياس قطرها من الانخفاض حيث يعوم كمجال على أعلى من النفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط مدة وضغط الحقن لمعايرة الصوت الخاص بعناية من الحقن. هذه الخطوة يساعد في استنساخ التجربة microinjection. في هذه المظاهرة ، وسيتم ذلك عن microinjections مع قطره قطرة 0.15 ملم (حوالي 1.76 NL في الحجم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم معايرة حجم الحقن الخاص ، واستخدام &quot;عقد&quot; مفتاح على حاقن الدقيقة لمنع الردم وتسريب micropipette. </li></ol> الجزء 6 : إعداد الأجنة المخصبة الزرد لmicroinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والزرد لم عشوائيا في الساعات القليلة الأولى من صباح كل يوم. جمع الأجنة في مرحلة 1 - الخلية ووضعها في 1X المتوسطة E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الماصة نقل 3 مل (بيكتون ديكنسون لابوار ، 357524) ، وترتيب الأجنة على طول أحواض اسفين على شكل لوحات في غرفة microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة بحيث تكون مغمورة ضحلة الأجنة وغمرت لا. هذه الخطوة يساعد في تسوية الأجنة إلى أسفل هبوطا ، وكذلك في الاختراق من قبل المشيماء micropipette. </li></ol> الجزء 7 : Microinjection خلال المشيماء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التلاعب في الأجنة مع micropipette بحيث السيتوبلازم الجنين مرحلة 1 - الخلية مرئية تحت المجهر تشريح. الحرص على عدم كسر غيض من micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختراق المشيماء ثم صفار ومع micropipette من أجل حقن في الجنين. في هذه التظاهرة ، فإننا سوف تكون الأولى في microinjecting صفار مباشرة تحت الخلية ، والسماح لتدفق حشوية ونشرها لتحقيق الحل العاملين في الخلية. هذا التدفق غير مرئية بسبب أحمر الفينول وأضاف أن الحل العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف نظهر أيضا الحقن المباشر في السيتوبلازم الخلية. microinjection مباشرة في الخلية هو أكثر قوة ولكن وقتا طويلا في اتجاه الجنين السليم وتقنية microinjection هو مطلوب. كما غشاء الخلية هو أكثر صرامة من الغشاء المحي ، غالبا ما يكون أسرع لدخول micropipette صفار من خلال التوصل إلى السيتوبلازم الخلية. قد توجيه القطب الحيواني نحو قاع الحوض ، والعمل مع المعونة أيدي ثابتة في هذا الأسلوب من الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد microinjection ، وضع الأجنة في طبق بيتري مع E3 المتوسطة واحتضان لهم في التطور الطبيعي ل28.5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال الساعات القليلة المقبلة والأيام من تطور الجنين ، مراقبة الجنين عن الظواهر اهتمامك. </li></ol> الجزء 8 : نتائج الممثل EGFP مرنا overexpression : التحقق من نجاح microinjection ، وسوف نقوم بمراقبة التعبير عن GFP في الأجنة النامية في مرحلة بداية درع (~ 6 HPF) في الجسم الحي بواسطة المجهر مضان كامل الجنين (لايكا مايكروسيستمز GMBH ، MZFLIII). التعبير عن بناء أكثر قوية خلال الأحداث المبكرة من التطور الجنيني ، وسوف يقلل كثيرا خلال التنمية كما توج حقن الحمض النووي الريبي هو المتدهورة بشكل تدريجي ويعتمد على استقرار البروتين المعبر عنها. pkd2 متعدية حجب morpholino : بناء على النتائج المنشورة سابقا ، فإننا نتوقع أن morphants pkd2 لتقليد محور الجسم الظهري انحناء كما وجدت في pkd2 الزرد متحولة والخراجات الكلى حاضرا في حوالي 2 -- 3 4 DPF. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : نتائج من الممثل microinjection من EGFP مرنا وpkd2 morpholino أغسطس (أ) كانت microinjected TAB الأجنة في مرحلة 1 - زنزانة مع 0.17 نانوغرام من EGFP مرنا وتصور في 1 DPF في التعبير عن GFP الجسم الحي. (ب ، ج) وmicroinjected TAB الأجنة في مرحلة 1 - NL زنزانة مع 1،7 ~ من morpholino متعدية pkd2 حظر عند 0.50 ملم وسجل للانحناء الجسم الظهري في 4 DPF.

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.++A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th, University of Oregon. (2000).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos%3A+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li>
<li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li>
<li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li>
<li>Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li>
<li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li>
<li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li>
<li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li>
<li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li>
</ol>

Microinjection في الأجنة الزرد هي تقنية راسخة وقوية لاستكشاف دور جين خاص في مجال التنمية. وتشمل التطبيقات overexpression ، misexpression ، وضربة قاضية لفحوصات الجينات اهتمامك ، فضلا عن تحليل روكبي بين جينات متعددة. وقد Microinjection في الزرد المستخدمة على نطاق واسع لتوليد حيوانات معدلة وراثيا ، ورسم الخرائط مصير الخلايا في الأجنة المبكرة الأريمة 5،6،7،8،9. بالإضافة إلى ذلك ، تطبيق هذه التقنية هي بمثابة خطوة رئيسية في توليد الجرثومية خط الوهم بالطرق زرع الخلية 10.<...

يتم سرد كافة المواد الأخرى في البروتوكول.

microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

أداة أساسية للتحقيق في دور الجينات خلال التنمية هو القدرة على تنفيذ ضربة قاضية الجينات ، overexpression والدراسات misexpression. في الزرد (<em&gt; دانيو rerio</em&gt;) ، microinjection من الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي والبروتينات والعقاقير [أليغنوكليوتيد] والجزيئات الصغيرة الأخرى في الجنين النامية تقدم الباحثون فحص سريعة وقوية لاستكشاف وظائف الجينات<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;. في هذه المقالة عن طريق الفيديو ، وسوف نقوم شرح كيفية إعداد وmicroinject<em&gt; في المختبر</em&gt; توليفها EGFP مرنا ومتعدية للحظر جزئية ضد morpholino<em&gt; pkd2</em&gt; ، وهو الجين المرتبط راثي جسمي أمراض الكلى المتعدد الكيسات (ADPKD) ، إلى خلايا الأجنة 1 الزرد المرحلة. وسوف نقوم بتحليل ثم نجاح مرنا وmicroinjections morpholino من خلال التحقق من التعبير GFP وتحليل النمط الظاهري. تطبيقات واسعة من هذه التقنية تشمل الحيوانات المعدلة وراثيا وتوليد الوهم الجرثومية الخط ، ورسم خرائط مصير الخلايا وفحص الجينات. هنا نحن تصف بروتوكول للoverexpression من EGFP وضربة قاضية ل<em&gt; pkd2</em&gt; من جانب ومرنا morpholino حقن قليل النوكليوتيد.

Microinjection طريقة راسخة وفعالة لإدخال المؤثرات الأجنبية في الأجنة المخصبة الزرد. هنا ، علينا أن نظهر تقنية microinjection قوية لأداء overexpression مرنا ، والدراسات morpholino ضربة قاضية قليل النوكليوتيد الجينات في الزرد.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

تعد القدرة على إجراء تثبيط الجينات، وفرط التعبير الجيني، والتعبير الجيني الخاطئ أداة أساسية لاستقصاء دور الجين أثناء التطور...

تبدأ هذه العملية بتحضير المورفو (morpho) وmRNA ذو القبعة (cap mRNA) المنسوخ في المختبر. يتم ملء ماصة دقيقة عن طريق سحب المحلول الذي يحتوي على المورفو، ثم يتم معايرة حجم الحقن باستخدام مسرح خلية واحد مزود بميكرومتر. بعد ذلك، يتم جمع أجنة سمك الزيبرا وترتيبها في غرفة حقن مجهري لإجراء عمليات الحقن المجهري في المح. يتم حقن المحلول العامل في المح сроك مباشرة تحت الخلية، وتُستغل الحركات السيتوبلازمية لنقل المحلول من أجل عمليات الحقن المجهري للخلية. احقن المحلول في سيتوبلازم الخلية بعد عمليات الحقن. تُحضن الأجنة عند درجة حرارة 28.5 °C في وسط E3، ثم يتم فحص الأنماط الظاهرية المستهدفة في المراحل اللاحقة.أهلاً بكم، أنا شيلوه يوين من مختبر الدكتور ساشا وقسم علم الوراثة في كلية الطب بجامعة ييل. سنقوم اليوم بشرح تقنية دقيقة للحقن المجهري لإجراء دراسات فرط التعبير عن mRNA وتثبيط الجينات باستخدام قليلات النوكليوتيد المورفولينو في أسماك الزيبرا. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة دور الهدب في أمراض الكلى الكيسية.لنبدأ الآن. يتمثل أحد النهج القوية لدراسات وظائف الجينات في الحقن المجهري للحمض الريبي RNA المنسوخ في المختبر والمزود بقبعة (capped RNA) في أجنة سمكة الزيبرا. في هذا العرض التوضيحي، سنقوم بحقن مجهري لنسخة مرتبطة بـ EGFP، واستخدام تعبير GFP في الجنين الكامل الحي كمؤشر مرئي لنجاح عملية الحقن.أولاً، سنقوم بإجراء تفاعل نسخ RNA مُقبع في المختبر (in vitro) للنسخة المستهدفة. وفي مختبرنا، نقوم روتينياً بإدراج A-C-D-N-A المستهدف في ناقل pCS2+ ونقوم بتفاعل تخليق في المختبر لكميات كبيرة من RNA المُقبع باستخدام مجموعة M message mMachine SP6. بعد ذلك، سنقوم بتنقية عينة RNA عن طريق تمريرها عبر مجموعة RNeasy Mini أو عن طريق الاستخلاص بالفينول والكلوروفورم والترسيب باستخدام الإيزوبروبانول.حدد بدقة تركيز تحضير RNA واحفظه في درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى يحين وقت استخدامه في يوم الحقن. قم بإذابة عينة RNA، ثم رجها بلطف باستخدام جهاز vortex وقم بطردها مركزياً لفترة وجيزة. الآن، قم بتحضير محلول عمل باستخدام ماء معقم وبتركيز نهائي يتراوح بين 0.025 إلى 0.05% من phenol red، حيث يعمل phenol red كمؤشر مرئي لعملية حقن المحلول في الجنين.سنقوم هنا بتحضير محلول عمل من EGFP mRNA بتركيز 100 nanograms per microliter مع 0.05% phenol red. وأخيراً، احتفظ بالعينة العاملة على الثلج وأعد مخزون RNA إلى درجة حرارة minus 80 degrees Celsius. انتقل إلى تحضير الـ morpho عندما تكون مستعداً لحقن هذه العينة.تُستخدم قليلات النيوكليوتيد المضادة للمعنى (antisense oligonucleotides) على نطاق واسع لتعديل التعبير الجيني عن طريق منع ترجمة بروتين مستهدف أو عن طريق تعديل عملية وصل الحمض النووي الريبوزي الأولي (pre-mRNA splicing). وتعمل المورفولينوهات (morpholinos) في سمك الزيبرفيش كأداة قوية في الوراثة العكسية من خلال تثبيط وظيفة الجين. سنقوم هنا بالحقن المجهري لقليل نيوكليوتيد مورفولينو يستهدف موقع بدء الترجمة لجين pkd2. ونستخدم بشكل روتيني 300 M من المورفولينو المصمم خصيصاً لجين معين يتم الحصول عليه من شركة Gene Tools LLC.نضيف بعد ذلك 100 µL من الماء المعقم لتحضير محلول مخزون بتركيز 3 mM، ثم نقسم المحلول إلى حصص صغيرة ونخزنه في درجة حرارة -20 °C حتى يحين موعد استخدامه في يوم الحقن. نقوم بتسخين محلول المورينو عند درجة حرارة 65 °C لمدة خمس دقائق، ثم نبرد المحلول بشكل مفاجئ على الثلج فوراً ونقوم بطرده مركزياً لفترة وجيزة؛ تهدف هذه الخطوة إلى تغيير طبيعة أي بنيات ثانوية في الأوليجو وضمان ذوبان المحلول تماماً.بعد ذلك، سنقوم بتحضير محلول عمل عن طريق تخفيف محلول Morpho في ماء معقم وبتركيز نهائي يتراوح من 0.025 إلى 0.05% phenol red. في هذا العرض التوضيحي، سنقوم بتحضير محلول عمل بتركيز 0.5 millimolar PKD two morino مع 0.05% phenol red. يُحفظ محلول العمل في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم البدء في ملء الماصة الدقيقة عند الاستعداد لحقن هذه العينة.للبدء، سنحتاج إلى تصنيع ماصات دقيقة لاستخدامها في عمليات الحقن. يتم ذلك عن طريق تسخين وسحب أنابيب شعرية من زجاج السيليكات BOS في جهاز قطبية الماصات الدقيقة. وبمجرد سحب الإبر، يتم الاحتفاظ بها في طبق بتري فوق كمية صغيرة من الطين أو الشريط اللاصق.بعد ذلك، سنقوم بتحضير أطباق حجرة الحقن المجهري عن طريق صب agarose بتركيز 1.5% في ثلاثة أطباق وسط XE ذات قوالب على شكل أحواض وتدية. ستكون هذه وسيلة سهلة لتثبيت الأجنة أثناء عملية الحقن. ثم تُترك أطباق حجرة agarose لتتصلب وتُخزن عند درجة حرارة 4 °C حتى يحين وقت استخدامها.لبدء ملء الماصة الدقيقة، قم بقطع الطرف البعيد باستخدام ملقط أو شفرة حلاقة جراحية لإنشاء فتحة تكون مرئية بالكاد تحت مجهر التشريح بتكبير 50x. بعد ذلك، ضع 2 µL من المحلول العامل.ضع قطرة على شريحة غطاء، ثم قم بتوصيل الجزء الخلفي من الماصة الدقيقة بحقنة سعة 5 مل مزودة بأنبوب على إبرة طبية، واغمر الطرف البعيد للماصة الدقيقة بشكل طفيف في قطرة المحلول العامل. احذر من كسر طرف الماصة الدقيقة. اسحب المحلول العامل عبر الطرف البعيد للماصة الدقيقة عن طريق سحب مكبس الحقنة.بعد ذلك، سنقوم بمعايرة حجم حقن الماصة الدقيقة. ضع قطرة من الزيت المعدني على شريحة ميكرومترية، ثم قم بتشغيل الطاقة وإمدادات الهواء لجهاز الحقن الدقيق بالنبضات الضغطية. بعد ذلك، قم بتثبيت الماصة الدقيقة في حامل الماصات الدقيقة الخاص بجهاز الحقن الدقيق.يتم تنظيم ضغط المحقن الدقيق، ويتم تفعيل عمليات التفريغ بالضغط على دواسة القدم الموجودة أسفل مجهر التشريح. اختبر حجم الحقن باستخدام المحقن الدقيق لوضع قطرة من محلول العمل الخاص بك فوق زيت الميكرومتر. قم بقياس قطر القطرة وهي تطفو على شكل كرة فوق الزيت.اضبط مدة وضغط الحقن لمعايرة حجم الحقن بدقة. تساعد هذه الخطوة في ضمان تكرارية تجربة الحقن المجهري. في هذا العرض التوضيحي، سيتم إجراء جميع عمليات الحقن المجهري بقطرة يبلغ قطرها 0.15 millimeters.أخيرًا، بمجرد معايرة حجم الحقن، استخدم مقبض التثبيت الموجود في المحقن الدقيق لمنع الارتجاع وتسرب الماصة الدقيقة. حان الآن وقت تحضير أجنة سمك الزيبرا. يتزاوج سمك الزيبرا بشكل عشوائي، لذا في الساعات الأولى من كل صباح لبدء التحضير، اجمع الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة وضعها في وسط XE 3.باستخدام ماصة نقل سعة 3 مل، قم بترتيب الأجنة على طول الأخاديد ذات الشكل الوتدي في أطباق غرفة الحقن المجهري. قم بإزالة الوسط بحيث تكون الأجنة مغمورة بشكل ضحل وغير مغمورة بالكامل. تساعد هذه الخطوة في استقرار الأجنة في قاع الأخاديد، كما تسهل اختراق الغشاء الكوريوني بواسطة الماصة المجهرية.سنبدأ الآن بعمليات الحقن. أولاً، سنقوم بمعالجة الأجنة باستخدام الماصة الدقيقة بحيث يكون سيتوبلازم الجنين في مرحلة الخلية الواحدة مرئياً تحت مجهر التشريح. احذر من كسر طرف الماصة الدقيقة، ثم اخترق الكوريون ومن ثم المح، باستخدام الماصة الدقيقة من أجل الحقن داخل الجنين.في هذا العرض التوضيحي، سنقوم أولاً بالحقن المجهري في المح، مباشرة تحت الخلية، والسماح للسيتوبلازم والانتشار بنقل المحلول العامل إلى داخل الخلية. هذا التدفق مرئي بفضل إضافة الفينول الأحمر إلى المحلول العامل. وبما أن هذا الجنين يتكون من خلية واحدة، فيمكن حقنه يدوياً أو باستخدام جهاز مناولة.سنقوم أيضاً بتوضيح عملية الحقن المباشر في سيتوبلازم الخلية. يعد الحقن المجهري المباشر في الخلية أكثر دقة، ولكنه يستغرق وقتاً أطول نظراً للحاجة إلى توجيه الجنين بشكل صحيح واتباع تقنية حقن مجهري دقيقة. وبما أن غشاء الخلية أكثر مقاومة من غشاء المح، فغالباً ما يكون إدخال الماصة المجهرية عبر المح للوصول إلى الخلية أسرع.قد يساعد توجيه السيتوبلازم بحيث يكون القطب الحيواني نحو قاع الحوض والعمل بيدين ثابتتين في هذه الطريقة من الحقن. بعد الحقن المجهري، ضع الأجنة في طبق بتري يحتوي على وسط E three واحضنها عند درجة حرارة 28.5 °C لضمان التطور الطبيعي. وخلال الساعات والأيام القادمة من تطور الجنين، راقب الأجنة لرصد الأنماط الظاهرية المستهدفة.للتحقق من نجاح الحقن المجهري، سنقوم بمراقبة تعبير GFP في الأجنة النامية بدءاً من مرحلة الدرع (shield stage) عن طريق مجهر الفلورة للجنين الكامل في الجسم الحي (in vivo). يكون تعبير البناء الجيني في أقوى حالاته خلال الأحداث المبكرة للتطور الجنيني، وغالباً ما يتضاءل أثناء النمو، وذلك مع تحلل RNA ذو القبعة (capped RNA) المحقون تدريجياً وبناءً على استقرار البروتين المُعَبَّر عنه. وبناءً على النتائج المنشورة سابقاً، نتوقع أن يحاكي PKD two morphine انحناء محور الجسم الظهري كما هو موجود في أسماك الزبرا الطافرة من نوع PKD two، مع ظهور تكيسات كلوية في غضون يومين إلى ثلاثة أيام تقريباً بعد الإخصاب.لقد عرضنا لكم للتو تقنية حقن مجهري قوية لإجراء دراسات فرط تعبير mRNA وتثبيط الجينات باستخدام قليلات النوكليوتيد المورفولينية في سمك الزيبرا؛ وعند تنفيذ هذا الإجراء، تذكر أن الأمر الأكثر أهمية هو الحقن بيد ثابتة. هذا كل شيء.شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا الفيديو يبين كيف يمكن حقنها أو morpholino مرنا في الأجنة الزرد في مرحلة واحدة الخلية إلى نقصان أو زيادة مستوى المنتجات جين معين خلال التطور اللاحق.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

وقد تم تطوير طريقة لإيصال morpholinos مباشرة في otocyst الزرد في 24hpf. microinjection به من morpholinos في تجويف الحويصلة الأذنية وelectroporation لإحداث الاختراق ، وكنا قادرين على تجاوز تأثير morpholinos على الدماغ والحصول على آثار محددة على الأذن الداخلية.

التسليم المباشر للMorpholinos MIF في Otocyst اسماك الزرد عن طريق الحقن وElectroporation يؤثر على التنمية الداخلية الأذن

تم وصف طريقة لضربة قاضية مشروط التعبير بروتين هدف في شبكية العين الزرد الكبار ، والذي ينطوي على حقن العقاقير وintravitreally morpholinos electroporating لهم في شبكية العين. طرقت هو البروتين الناتج باستمرار لعدة أيام ، والذي يسمح اختبار دور البروتين في تجديد أو شبكية العين سليمة.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

يصف البروتوكول الضربة القاضية المستهدفة للتعبير الجيني في أسماك الزرد عن طريق حقن مورفولينو في الذيل.

حقن المورفولينو: طريقة لضربة قاضية للتعبير الجيني المستهدف لدراسة الوظيفة في أسماك الزرد

يصف هذا الفيديو تقنية الحقن المجهري للأجنة لتوصيل المركبات إلى كيس صفار الزرد.

الحقن المجهري للأجنة: تقنية لتوصيل مركب إلى صفار الزرد

هنا، فإننا نقدم مقاربة منهجية لتطوير ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وحساسة...

في النمذجة فيفو من المهووسين الجينوم البشري باستخدام دانيو rerio

في هذه المقالة، ونحن يبرهن على وجود طريقة للتلاعب في التعبير الجيني في الخلايا البطين من الدماغ الانتهائي الزرد الكبار باستخدام العقاقير أليغنوكليوتيد] morpholino. نقدم هذه الطريقة كبروتوكول فعالة وسريعة والتي يمكن استخدامها للدراسات وظيفية في الفقاريات الدماغ الكبار.

المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino

طريقة الوراثية العكسية للتكيف الزرد لتقييم وظيفة الجين خلال مراحل لاحقة من التطور والتوازن الفسيولوجية مثل تجديد الأنسجة باستخدام الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة.

عكس النهج الوراثية عن طريق القلب البطيني Morpholino حقن لبالنقل متعددة يصعب الهدف الأنسجة في الزرد اليرقة

في هذا الفيديو ، Nijole Jasinskiene يوضح المنهجية المستخدمة لتوليد البعوض المعدلة وراثيا الزاعجة المصرية ، والتي هي نواقل حمى الضنك. وأظهرت أساليب إعداد صحيح microinjection الإبر ، dessicating الأجنة ، وأداء microinjection.

Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

نحن هنا تصف طريقة لتركيب الأجنة الزرد لفترة طويلة الأجل والتصوير ، واثنين من الفوتون التصوير وتقنيات الأنسجة الضرر ، والوقت الفاصل بين التصوير مبائر.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

تعلم تقنية حقن دقيقة لإدخال مرنا وأوليغونوكليوتيدات مورفولينو في أجنة أسماك الزرد. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة التعبير الجيني ووظائف الجينات في علم الأحياء التنموي.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

استكشف المزيد من الفيديوهات