Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.
مايو 7, 2009
Microinjection طريقة راسخة وفعالة لإدخال المؤثرات الأجنبية في الأجنة المخصبة الزرد. هنا ، علينا أن نظهر تقنية microinjection قوية لأداء overexpression مرنا ، والدراسات morpholino ضربة قاضية قليل النوكليوتيد الجينات في الزرد.
يبدأ هذا الإجراء بإعداد مورفو وغطاء mRNA المنسوخ في المختبر. يتم ملء الماصة الدقيقة عن طريق سحب المحلول المحتوي على مورفو ثم تتم معايرة حجم الحقن باستخدام ميكرومتر من مرحلة خلية واحدة. ثم يتم جمع أجنة الزرد وترتيبها في غرفة الحقن المجهري لحقن صفار البيض الدقيق.
يتم حقن محلول العمل في صفار البيض أسفل الخلية مباشرة وتستخدم الحركات السيتوبلازمية لحمل محلول الحقن الدقيق للخلايا. حقن المحلول في سيتوبلازم الخلية بعد الحقن. احتضان الأجنة عند 28.5 درجة مئوية في E ثلاثة متوسطات وسجل الأنماط الظاهرية ذات الأهمية في المراحل اللاحقة.
مرحبا ، أنا شيلوه يوين من المختبر ، ابن الدكتور ساشا وقسم علم الوراثة في كلية الطب بجامعة ييل. سنعرض اليوم تقنية حقن مجهرية قوية لإجراء الإفراط في التعبير عن الرنا المرسال ودراسات الضربة القاضية لجين مورفو أوليجو نيوكليوتيدات في أسماك الزرد. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة دور الهدب القاسي في أمراض الكلى الكيسية.
لذلك دعونا نبدأ. تتمثل إحدى الأساليب القوية لدراسات وظائف الجينات في الحقن الدقيق في المختبر من الحمض النووي الريبي المغطى في أجنة أسماك الحمار الوحشي. في هذا العرض التوضيحي ، سنقوم بحقن نسخة ذات علامة EGFP ونستخدم تعبير GFP الحي للجنين الكامل كقراءة مرئية للحقن الناجح.
أولا ، سنقوم بإجراء تفاعل نسخ الحمض النووي الريبي بغطاء مختبري على النص الذي تهمك. في مختبرنا ، نقوم بشكل روتيني بإدخال A-C-D-N-A ذات الأهمية في متجه أجهزة الكمبيوتر الشخصية اثنين زائد وإجراء تفاعل تخليق في المختبر لكميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المغطى باستخدام مجموعة M message M Machine SP six. بعد ذلك ، سنقوم بتنقية عينة الحمض النووي الريبي عن طريق تشغيلها من خلال مجموعة RN المصغرة السهلة أو عن طريق استخراج كلوروفورم الفينول وترسيب الأيزوبروبانول.
حدد بعناية تركيز مستحضر الحمض النووي الريبي وقم بتخزينه تحت الصفر 80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام في يوم الحقن. قم بإذابة دوامة عينة الحمض النووي الريبي برفق وقم بتدويرها لفترة وجيزة. الآن قم بإعداد محلول عملي بالماء المعقم وتركيز نهائي من 0.025 إلى 0.05٪ فينول أحمر ، يعمل الفينول الأحمر كعلامة مرئية لحقن المحلول في الجنين.
سنقوم هنا بإعداد حل عملي من 100 نانوجرام لكل ميكرولتر EGFP mRNA مع 0.05٪ فينول أحمر. أخيرا ، احتفظ بعينة العمل على الجليد وأعد مخزون الحمض النووي الريبي إلى 80 درجة مئوية تحت الصفر. انتقل إلى إعداد مورفو عندما تكون جاهزا لحقن هذه العينة.
تستخدم قليل النوكليوتيدات المضادة لحساسية مورينو على نطاق واسع لتعديل التعبير الجيني عن طريق منع ترجمة البروتين المستهدف أو عن طريق تعديل prem NA. يعمل التضفير في أسماك الحمار الوحشي كأداة قوية لعلم الوراثة العكسية عن طريق تدمير وظيفة الجينات. هنا سنقوم بحقن قلة الشكل الجزئي التي تستهدف موقع البدء الانتقالي ل pkd two. نحن نستخدم بشكل روتيني 300 متر من قليلة الشكل ، المصممة خصيصا لجين ذي أهمية تم الحصول عليه من أدوات الجينات LLC.
ثم نضيف 100 ميكرولتر من الماء المعقم لصنع محلول مخزون بمقدار ثلاثة ملليمولار ثم نضع المحلول ونخزنه على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يصبح جاهزا للاستخدام في يوم الحقن. نقوم بتسخين محلول مورينو عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم نقوم بتبريد المحلول على الجليد على الفور وندور لفترة وجيزة ، وهذه الخطوة تغير طبيعة أي هياكل ثانوية في oligo وتضمن ذوبان المحلول تماما.
بعد ذلك ، سنقوم بإعداد محلول عملي عن طريق تخفيف محلول مورفو في ماء معقم وتركيز نهائي من 0.025 إلى 0.05٪ أحمر صنوبري. في هذا العرض التوضيحي ، سنقوم بإعداد محلول عملي من 0.5 مللي مولار PKD اثنين من مورينو مع 0.05٪ فينول أحمر. احتفظ بمحلول العمل في درجة حرارة الغرفة وانتقل إلى ملء الماصة الدقيقة عندما تكون جاهزا لحقن هذه العينة.
للبدء، سنحتاج إلى تصنيع ماصات دقيقة لاستخدامها في الحقن. يتم ذلك عن طريق تسخين وسحب الأنابيب الشعرية الزجاجية المصنوعة من سيليكات BOS في جهاز قطبي ماصة دقيقة. بمجرد سحب الإبر ، يتم حفظها في طبق بتري فوق كمية صغيرة من الطين أو شريط لاصق.
بعد ذلك ، سنقوم بإعداد ألواح غرفة الحقن المجهري عن طريق صب 1.5٪ aros في XE ثلاث ألواح متوسطة مصبوبة بأحواض على شكل إسفين. سيكون ذلك بمثابة طريقة سهلة لحمل الأجنة أثناء الحقن. ثم يسمح لألواح الغرفة الزراعية بالتصلب وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
لبدء ملء الماصة الدقيقة. قم بقص الطرف البعيد بالملقط أو شفرة حلاقة جراحية لإنشاء فتحة يمكن رؤيتها فقط تحت مجهر تشريح بتكبير 50 ضعفا. بعد ذلك ، ضع ميكرولترين من محلول العمل الخاص بك.
كقطرة على زلة الغطاء، قم بتوصيل الجزء الخلفي من الماصة الدقيقة بحقنة سعة خمسة ملليلتر مزودة بأنابيب على إبرة تحت الجلد وغمر قليلا الطرف البعيد للماصة الدقيقة في قطرة محلول العمل. احرص على عدم كسر طرف الماصة الدقيقة. قم بسحب محلول العمل من خلال الطرف البعيد للماصة الدقيقة عن طريق سحب مكبس المحقنة.
بعد ذلك، سنقوم بمعايرة حجم حقن الماصة الدقيقة. ضع قطرة من الزيت المعدني على شريحة ميكرومتر وقم بتشغيل مصدر الطاقة والهواء لجهاز حاقن الضغط. بعد ذلك، قم بتوصيل الماصة الدقيقة بحامل الماصة الدقيقة لجهاز الحاقن الصغير.
يتم تنظيم الحاقن الصغير بالضغط ويتم تنشيط التفريغ عن طريق الضغط على دواسة القدم تحت مجهر التشريح. اختبر حجم الحقن باستخدام الحاقن الصغير لوضع قطرة من محلول العمل على زيت الميكرومتر. قم بقياس قطر القطرة وهي تطفو ككرة فوق الزيت.
اضبط مدة الحقن وضغطه لمعايرة حجم الحقن بعناية. تساعد هذه الخطوة في استنساخ تجربة الحقن المجهري. في هذا العرض التوضيحي ، سيتم إجراء جميع الحقن الدقيقة بقطر قطرة 0.15 ملم.
أخيرا ، بمجرد معايرة حجم الحقن ، استخدم مقبض التثبيت الموجود على الحاقن الصغير لمنع الملء الخلفي وتسرب الماصة الدقيقة. حان الوقت الآن لتحضير أجنة الزرد. سوف تتزاوج أسماك الزرد بشكل عشوائي ، في الساعات القليلة الأولى من كل صباح لبدء التحضير ، وتجمع الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة وتضعها في وسط واحد XE ثلاثة.
باستخدام ماصة نقل سعة ثلاثة ملليلتر، رتب الأجنة على طول أحواض الإسفين في ألواح غرفة الحقن المجهر. قم بإزالة الوسط بحيث تكون الأجنة ضحلة ومغمورة وغير مغمورة. تساعد هذه الخطوة في ترسيب الأجنة في قاع الأحواض وكذلك في تغلغل الماصة الدقيقة للقرنب.
الآن سنبدأ الحقن. أولا، سنتعامل مع الأجنة باستخدام الماصة الدقيقة بحيث يكون السيتوبلازم لجنين المرحلة الواحدة مرئيا تحت المجهر التشريح. احرص على عدم كسر طرف الماصة الدقيقة ، واختراق الكوريون ثم صفار البيض باستخدام الماصة الدقيقة من أجل حقنها في الجنين.
في هذا العرض التوضيحي ، سنكون أول حقن دقيق في صفار البيض أسفل الخلية مباشرة والسماح للسيتوبلازمي والانتشار بإحضار محلول العمل إلى الخلية. هذا التدفق مرئي بسبب الفينول الأحمر المضاف إلى محلول العمل. نظرا لأن هذا جنين خلية واحدة ، فيمكن حقنه يدويا أو باستخدام مناور.
سنعرض أيضا الحقن المباشر في سيتوبلازم الخلية. يعد الحقن المجهري المباشر في الخلية أكثر قوة ، ولكنه يستغرق وقتا طويلا حيث يلزم توجيه الجنين المناسب وتقنية الحقن المجهري. نظرا لأن غشاء الخلية أكثر صرامة من غشاء الصفار ، فغالبا ما يكون من الأسرع إدخال الماصة الدقيقة من خلال صفار البيض للوصول إلى الخلية.
قديساعد السيتوبلازم الذي يوجه عمود نحو قاع الحوض الصغير ويعمل بأيدي ثابتة في طريقة الحقن هذه. بعد الحقن المجهري ، ضع الأجنة في طبق بتري مع E ثلاثة وسط واحتضانها عند 28.5 درجة مئوية للنمو الطبيعي. خلال الساعات والأيام العديدة القادمة من نمو الجنين ، راقب الأجنة بحثا عن الأنماط الظاهرية التي تهمك.
للتحقق من نجاح الحقن المجهري ، سنراقب التعبير عن GFP في الأجنة النامية بدءا من مرحلة الدرع عن طريق الفحص المجهري الفلوري للجنين الكامل في الجسم الحي يكون التعبير عن البناء أقوى خلال الأحداث المبكرة للتطور الجنيني وغالبا ما يتضاءل أثناء التطور. نظرا لأن الحمض النووي الريبي المغطى المحقون يتحلل تدريجيا ويعتمد على استقرار البروتين المعبر عنه. بناء على النتائج المنشورة سابقا ، نتوقع أن يحاكي المورفين PKD انحناء محور الجسم الظهري كما هو موجود في PKD اثنين من أسماك الزرد الطافرة وتظهر تكيسات الكلى بعد يومين إلى ثلاثة أيام تقريبا من الإخصاب.
لقد أظهرنا لك للتو تقنية حقن مجهرية قوية لإجراء الإفراط في التعبير عن الرنا المرسال ودراسات الضربة القاضية لجين قليل النوكليوتيد مورفو في أسماك الزرد عند القيام بهذا الإجراء ، تذكر أن هذا مهم. حقن بيد ثابتة. هذا كل شيء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة تقنية حقن دقيقة لإدخال مواد غريبة إلى أجنة أسماك الزرد المخصبة. تُمكّن الطرق الموصوفة فرط التعبير عن الحمض النووي الريبي الرسول ودراسات إسكات الجينات بالمورفولينو الأوليغونوكليوتيد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا النمو
- علم الوراثة
الخلفية
- الحقن الدقيق هو طريقة راسخة لمعالجة الأجنة.
- أسماك الزرد هي كائن نموذجي رئيسي في بيولوجيا النمو.
- إسكات الجينات وفرط التعبير الجيني هما تقنيتان حاسمتان لدراسة وظيفة الجينات.
- التسليم الفعال للمواد إلى الأجنة ضروري للنجاح التجريبي.
غرض الدراسة
- لإظهار تقنية حقن دقيقة لأجنة أسماك الزرد.
- لتيسير دراسات فرط التعبير عن الحمض النووي الريبي الرسول.
- لتمكين إسكات الجينات بالمورفولينو الأوليغونوكليوتيد.
الطرق المستخدمة
- تحضير المورفولينو والحمض النووي الريبي المكتشف في المختبر.
- معايرة حجم الحقن باستخدام ميكرومتر.
- حقن أجنحة أسماك الزرد في غرفة مضبوطة.
- حضانة الأجنة عند 28.5 درجة مئوية في وسط E three.
النتائج الرئيسية
- حقن ناجح للمحاليل في الصفار والسيتوبلازم من الأجنة.
- تم تقييم الأنماط الظاهرية ذات الاهتمام في مراحل التطور اللاحقة.
- أثبتت التقنية فعاليتها لكل من فرط التعبير الجيني وإسكات الجينات.
- أظهرت النتائج قوة طريقة الحقن الدقيقة.
الاستنتاجات
- تقنية الحقن الدقيقة موثوقة للدراسات الوراثية في أسماك الزرد.
- يمكن لهذه الطريقة تعزيز فهم وظيفة الجينات في التطور.
- يمكن للدراسات المستقبلية البناء على هذه التقنية لتطبيقات متنوعة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos enables rapid, in vivo interrogation of gene function, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. This approach provides a robust platform for functional genomics, facilitating predictive confidence in gene-phenotype relationships and informing portfolio triage decisions. Its versatility accelerates the transition from discovery biology to actionable preclinical insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of gene function through targeted knockdown or overexpression in a living vertebrate system.
- Supports mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to observable phenotypes.
- Facilitates rapid hypothesis testing for candidate targets implicated in disease pathways.
- Provides functional evidence to prioritize or deprioritize targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Establishes validated zebrafish models for downstream compound screening and phenotypic assays.
- Delivers reproducible, quantitative readouts such as GFP expression and morphological phenotypes.
- Enables standardization of injection volumes and conditions for assay scalability.
- Prepares robust biological systems for high-confidence screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene function studies with disease-relevant phenotypes, such as modeling cystic kidney disease.
- Supports continuity from genetic discovery to preclinical model validation.
- Provides early translational biomarkers through observable developmental outcomes.
- Reduces risk of late-stage attrition by confirming target relevance in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
This microinjection technique integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, bridging target validation with functional screening in a vertebrate system.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of gene function and pathway involvement in disease models.
- Screening: Provides standardized, reproducible phenotypic assays for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs such as fluorescence intensity and morphological scoring for comparative analysis.
- Translational Research: Connects genetic perturbation to disease-relevant phenotypes, supporting biomarker identification.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse gene function and pathway studies across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for gene function interrogation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microinjection, and phenotypic analysis.
- Demands access to microinjection apparatus, fluorescence microscopy, and molecular biology infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of injection protocols and phenotype scoring.
- Adaptation may be needed for different gene targets or model systems.
- Practical limitations include injection throughput and variability in embryo viability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:54
Introduction
1:29
Preparation of RNA
3:26
Preparation of Morpholino
5:07
Preparing the Micropipette and Plates for Microinjections
7:51
Preparing and Injecting Fertilized Zebrafish Embryos
10:09
Representative Results: EGFP Expression and Mutant Phenotypes
11:07
Conclusion
![المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F50415.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A16.489Z&w=384&q=75)
