Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

يتم تزاوج أسماك الزيبرا الذكور والإناث في قفص تربية تسقط فيه البيوض الملقحة إلى القاع حيث يمكن جمعها بسهولة. ثم تُصف البيوض مقابل شريحة مجهرية في طبق بتري. بعد ذلك، يتم قص إبرة الحقن المشحونة وضبط إعدادات الحقن، بحيث تكون كتلة الحقن بالحجم المطلوب عند قياسها باستخدام الميكرومتر.

أخيراً، يتم حقن البيوض واحدة تلو الأخرى على طول الخط. مرحبًا، أنا جوناثان روزن من مختبر جون ما في قسم أمراض القلب في مستشفى بوسطن للأطفال. وأنا مايكل سويني، وأعمل أيضاً في مختبر VY.

سنقوم اليوم بتوضيح كيفية حقن الـ mRNA أو الـ morpholino في أجنة أسماك الزيبرا. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تأثيرات تثبيط أو فرط تعبير نواتج جينية محددة. لذا، فلنبدأ.

للبدء، سنحتاج إلى تجهيز أحواض الأسماك وأحواض التكاثر مع وضع الحواجز في مكانها في الليلة السابقة للحقن لزيادة إجمالي إنتاج البيض. يمكن تجهيز الأسماك بنسبة أنثيين إلى ذكر واحد إذا رغبنا في ذلك. وفي صباح اليوم التالي بعد تشغيل أضواء الغرفة، يتم سحب الحواجز من عدة أحواض والسماح بفترة تزاوج دون إزعاج لمدة 20 دقيقة تقريبًا. وباستخدام مصفاة، يتم جمع البيض من أقفاص التكاثر وشطفه بماء البيض قبل صبه في طبق بتري.

باستخدام مياه البيض، يمكن إعادة تجميع الأسماك في أحواض أكبر لإنتاج جولات إضافية من البيض المخصص للحقن. اضبط توقيت جمع البيض للسماح بإنتاج أكبر عدد ممكن من البيض دون تركه يتجاوز مرحلة الخلية الواحدة. وأخيراً، ضع شريحة مجهرية في الغطاء المقلوب لطبق بتري بقطر 100 مليمتر.

استخدم ماصة نقل لمحاذاة البيوض مقابل جانب الشريحة لتشكيل عمود واحد، ثم أزل المياه الزائدة من فوق الشريحة بالضغط بمناديل Kim wipe على الجانب المقابل للبيوض. بعد ذلك، سنقوم بتحضير إبر الحقن المجهري باستخدام جهاز سحب الشعيرات الزجاجية (micro pipette puller). سنقوم بسحب شعيرة زجاجية ذات قطر خارجي يبلغ 1 مليمتر لتحويلها إلى إبرتين، ثم تخزين هذه الإبر في طبق بتري بقطر 150 مليمتر. يمكن سحب الإبر مسبقاً عن طريق وضعها فوق منحدرات من معجون السيليكون (silly putty).

نستخدم الإعدادات التالية: الحرارة 6، القطب 45، القطب 60، والسرعة 80. يتم تحميل الطرف العريض من الإبرة بثلاثة 3 µL من مادة الحقن باستخدام ماصة تحميل دقيقة.

رُجَّ الكتلة من السائل باتجاه طرف الإبرة حتى يتبقى عدد قليل من الفقاعات أو لا يتبقى شيء. بعد ذلك، سنقوم بتشغيل مصدر الهواء والمحقن الدقيق. أدخل الإبرة في المحقن الدقيق وتأكد من إحكام الغلق داخل المبيت.

تحقق من أن الميكرومانيبوليتور (micro manipulator) في وضعية مناسبة تسمح بنطاق واسع من الحركة والضبط. حرك طرف الإبرة ليكون ضمن نطاق رؤية المجهر. ارفع الإبرة بعيداً عن المنصة ثم قم بضبط التركيز على أنحف منطقة في الطرف.

استخدم زوجاً من الملاقط الحادة لقطع الإبرة عند نقطة تترك الإبرة ضيقة بما يكفي لاختراق الغشاء الكوريوني والمح жел зоك، مع بقائها قادرة على تقديم حجم خرزات متسق. ولحساب حجم كل حقنة، سنستخدم قطرة من الزيت المعدني على ميكرومتر، ثم ندرج الإبرة في الزيت ونضغط على دواسة القدم لحقن خرزة من المحلول في الزيت. راقب حجم الخرزة أثناء تقليم الإبرة وضبط ضغط الحقن عند الحاجة أثناء الحقن في الزيت.

تحتوي الخرزة التي يبلغ قطرها 0.1 millimeter على 500 picoliters من مادة الحقن. وعادةً ما تُستخدم أحجام حقن تبلغ 500 picoliters أو 1 nanoliter. وستملأ أحجام الحقن المثالية ما يقرب من 10% من حجم البيضة.

تعد جودة طرف الإبرة أمراً بالغ الأهمية لكل من سهولة الحقن وجودة النتائج واتساقها. حان الوقت الآن للبدء في إجراء عملية الحقن. تأكد من أن الأجنة لم تتطور إلى ما بعد مرحلة الخلايا الأربع.

من الناحية المثالية، يجب أن يكون الجنين في مرحلة الخلية الواحدة. بعد ذلك، قم بخفض الإبرة باتجاه عمود البويضات، واثقب سطح الغشاء السيريون (corion) ثم ادخل إلى المح الصفاقي (yolk) بحركة واحدة سلسة أثناء المراقبة. في حال حدوث أي سحق أو تمزق في كيس المح، قم بحقن مادة الحقن داخل المح.

تجنب حقن فقاعات الهواء، وانتبه للأجنة التي تظهر عليها علامات التضرر الواضح نتيجة الحقن أثناء العمل على طول الصف. اضبط الضغط إذا لزم الأمر للحفاظ على حجم ثابت للقطيرة، واستخدم طرف ماصة لإزالة البيض الذي يبدو غير مخصب أو الذي تدمّر أثناء عملية الحقن. بعد الانتهاء من عمود من البيض، استخدم تدفقاً لطيفاً من ماء البيض لنقل البيض المحقون إلى أطباق بتري نظيفة، وكرر العملية حسب الحاجة.

احتفظ بعدة أجنة غير محقونة كمجموعة ضابطة. لاحقاً خلال اليوم الأول، قم بإزالة الأجنة الميتة وتسجيل عدد الأجنة المحقونة. استبدل ماء البيض في الطبق بشكل دوري لتقليل احتمالية حدوث عدوى.

لاحظ أنه بناءً على المادة التي يتم حقنها، قد تنجو الأجنة بمعدل أقل من أشقائها غير المحقونة. ولحسن الحظ، فمن السهل حقن أعداد هائلة منها، لذا لا يشكل هذا الأمر مشكلة في الغالب. سنعرض الآن بعض النتائج التمثيلية لكل من حقن الـ morpholino والـ mRNA.

تبدو العينة الضابطة غير المحقونة بعد 48 ساعة من الإخصاب طبيعية كما هو متوقع. ومع ذلك، تظهر الأجنّة المحقونة بـ morpho HG E three i three eeg FFR one، والذي يثبط أشكال HG التي تحتوي على التكرار الأول من تكرارين من EEG flike، وذمة دماغية، وحقن heart glass. Mr.NA أنتج أيضاً نمطاً ظاهرياً واضحاً بعد 24 ساعة من الإخصاب.

بدت رؤوس الضوابط غير المحقونة طبيعية. وعلى العكس من ذلك، أظهرت بعض الأجنة المحقونة بـ M NNA حالة من انعدام العينين (opia). لقد أوضحنا لكم للتو كيف يمكن لحق المورفولينوس أو mRNA خلال مرحلة الخلية الواحدة أن يزيد أو يقلل من تعبير جينات معينة خلال مراحل النمو اللاحقة. عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر ذلك أيضاً.

يمكن أن يؤدي التركيز العالي من mRNA أو المورفولينو (morpho) إلى حدوث وفاة غير نوعية في الأجنة التي عولجت بالمورفولينو. يجب اختبار كل منها تجريبياً، ولكن عادةً ما تؤدي التركيزات التي تتراوح بين 200 و 500 ميكرومولار إلى تثبيط نشاط الجين بشكل نوعي دون التسبب في وفاة عامة. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.