Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

تتزاوج أسماك الحمار الوحشي من الذكور والإناث في قفص تكاثر يسقط فيه البيض المخبض في القاع حيث يمكن جمعه بسهولة. ثم يصطف البيض مقابل شريحة مجهرية في طبق بتري. بعد ذلك ، يتم قص إبرة الحقن المحملة ومعالجة إعدادات الحقن ، بحيث تكون بلعة الحقن بالحجم المطلوب عند قياسها باستخدام ميكرومتر.

أخيرا ، يتم حقن البيض واحدا تلو الآخر في المستقبل. مرحبا ، أنا جوناثان روزين من مختبر جون ماساتشوستس في قسم أمراض القلب في مستشفى الأطفال في بوسطن. وأنا مايكل سويني ، أيضا في مختبر VY.

سنوضح اليوم كيف يمكن حقن mRNA أو morph Fello في أجنة الزرد. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة آثار الضربة القاضية أو الإفراط في التعبير عن منتجات جينية معينة. لذلك دعونا نبدأ.

للبدء ، سنحتاج إلى إعداد أحواض الأسماك والتربية مع فواصل في مكانها في الليلة السابقة للحقن لزيادة إجمالي إنتاج البيض. يمكن إعداد الأسماك بنسبة أنثى إلى ذكر واحد إذا رغبت في ذلك. في صباح اليوم التالي بعد تشغيل أضواء الغرفة ، اسحب الفواصل من عدة خزانات واترك ما يقرب من 20 دقيقة من وقت التزاوج دون إزعاج باستخدام مصفاة ، اجمع البيض من أقفاص التكاثر واشطفه بماء البيض قبل سكبه في طبق بتري.

باستخدام ماء البيض ، يمكن إعادة تجميع الأسماك في أحواض أكبر لإنتاج جولات إضافية من البيض للحقن. اضبط توقيت جمع البويضات للسماح بإنتاج أكبر عدد ممكن من البيض دون السماح له بالمرور بمرحلة الخلية الواحدة. أخيرا ، ضع شريحة مجهر في الغطاء المقلوب لطبق بتري مقاس 100 ملم.

استخدم ماصة نقل لمحاذاة البيض على جانب الشريحة لتشكيل عمود واحد ، ثم قم بإزالة ماء البيض الزائد من الشريحة عن طريق الضغط على منديل Kim على الجانب المقابل للبيض. بعد ذلك ، سنقوم بإعداد إبر الحقن الدقيقة باستخدام ماصة صغيرة قطبية. سنقوم بسحب الشعيرات الدموية الزجاجية ذات القطر الخارجي المليمتر الواحد إلى إبرتين وتخزين هذه الإبر في طبق بتري مقاس 150 ملم عن طريق وضعها على منحدرات معجون سخيفة ، يمكن سحب الإبر مسبقا.

نستخدم الإعدادات التالية. الحرارة 6 45 القطب 60 السرعة 80. قم بتحميل الطرف العريض للإبرة بثلاثة ميكرولترات من مادة الحقن باستخدام ماصة اللودر الصغير.

هز البلعة باتجاه طرف الإبرة حتى يتبقى عدد قليل من الفقاعات أو لا تبقية. بعد ذلك ، سنقوم بتشغيل مصدر الهواء والحاقن الدقيق. أدخل الإبرة في الحاقن الصغير وتأكد من إحكام الإغلاق داخل الهيكل.

تأكد من أن المعالج الصغير في الوضع المناسب للسماح بمجموعة واسعة من الحركة والضبط. أحضر طرف الإبرة إلى مستوى رؤية المجهر. عاليا من المسرح وركز على أنحف منطقة من الحافة.

استخدم زوجا من الملقط الحاد لقرص الإبرة عند نقطة تترك الإبرة ضيقة بما يكفي لاختراق الكوري وصفار البيض ، ولكنها لا تزال قادرة على تقديم حجم حبة ثابت. لحساب حجم كل حقنة ، سنستخدم قطرة من الزيت المعدني على ميكرومتر ، وأدخل الإبرة في الزيت ونضغط على دواسة القدم لحقن حبة من المحلول في الزيت. راقب حجم الخرزة أثناء تقليم الإبرة وضبط ضغط الحقن عند حقنها في الزيت.

تحتوي حبة قطرها 0.1 ملم على 500 بيكوليتر من مادة الحقن. عادة ما يتم استخدام أحجام الحقن التي تبلغ 500 بيكوليتر أو نانولتر واحد. ستملأ أحجام الحقن المثالية ما يقرب من 10٪ من حجم البيضة.

تعد جودة طرف الإبرة أمرا بالغ الأهمية لسهولة الحقن وجودة واتساق النتائج. حان الوقت الآن للحقن لبدء إجراء الحقن. تأكد من أن الأجنة لم تتطور بعد مرحلة الخلايا الأربع.

من الناحية المثالية ، يجب أن يكون الجنين في مرحلة الخلية الواحدة. بعد ذلك ، قم بخفض الإبرة باتجاه عمود البيض ، واثقب سطح الكوريون وأدخل صفار البيض بضربة واحدة ناعمة أثناء المشاهدة. لأي سحق أو تمزيق لكيس صفار البيض ، قم بحقن مادة الحقن في صفار البيض.

تجنب حقن فقاعات الهواء واحترس من الأجنة التي تضررت بشكل واضح من الحقن الذي يعمل على الخط. يلزم ضبط الضغط للحفاظ على حجم حبة ثابت وباستخدام طرف ماصة ، قم بإزالة البيض الذي يبدو غير مخصب أو يتم تدميره أثناء عملية الحقن. بعد الانتهاء من عمود البيض ، استخدم تيارا لطيفا من ماء البيض لنقل البيض المحقون إلى طبق بتري نظيف وكرر ذلك حسب الضرورة.

احتفظ بالعديد من الأجنة المحقونة كعنصر تحكم. في وقت لاحق خلال اليوم الأول ، قم بإزالة الأجنة الميتة وتسجيل عدد الأجنة المحقونة. استبدل ماء البيض في الطبق بشكل دوري لتقليل فرصة الإصابة بالعدوى.

لاحظ أنه اعتمادا على ما يتم حقنه ، قد تعيش الأجنة بمعدل أقل من أشقائها الذين تم حقنهم. لحسن الحظ ، من السهل حقن أعداد كبيرة منها ، لذلك نادرا ما تكون هذه مشكلة. سنعرض الآن بعض النتائج التمثيلية لكل من حقن مورفو والحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA).

وحدة التحكم المحقونة في 48 ساعة بعد الإخصاب طبيعية كما هو متوقع. ومع ذلك ، فإن الأجنة المحقونة ب morpho HG E ثلاثة i ثلاثة EEG FFR واحد ، والذي يسقط الأشكال الإسوية HG التي تحتوي على أول تكرارين لتكرار مخطط كهربية الدماغ ، وذمة الدماغ ، وحقن زجاج القلب. أنتج Mr.NA أيضا نمطا ظاهريا واضحا بعد 24 ساعة من الإخصاب.

بدت رؤوس الضوابط المحقونة في unin طبيعية. على العكس من ذلك ، فإن بعض الأجنة المحقونة ب M NNA تظهر الأبيا ، لقد أوضحنا لك للتو كيف يمكن لحقن المورفو أو الرنا المرسال خلال مرحلة الخلية الواحدة أن يزيد أو يقلل من التعبير عن جينات معينة أثناء التطور اللاحق. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ذلك أيضا.

يمكن أن يتسبب التركيز العالي للرنا المرسال أو المورفو في حدوث فتاكة غير محددة في الأجنة ذات المورفو. يجب اختبار كل واحد تجريبيا ، ولكن عادة ما يتم اختبار تركيزات ما بين 200 و 500 نشاط جيني ضربة قاضية ميكرومولار على وجه التحديد دون التسبب في الفتك العام. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.