Name: Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: تعلم تقنية حقن المورفولينو أو الرنا المرسال في أجنة أسماك الزرد في مرحلة الخلية الواحدة لدراسة وظائف الجينات أثناء التطور. هذه الطريقة تتيح للباحثين التحكم في التعبير الجيني وملاحظة التأثيرات الظاهرية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نعترف أعضاء المختبر Mably وStorer Narie للحصول على المساعدة التقنية ، وجمعية القلب الأمريكية (NCRP ساينتست التنمية 0635363N غرانت) والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد (المنحة SCCOR RFA HL02 - 027) للحصول على التمويل

الجزء 1 : إنتاج البيض ، وجمع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليلة قبل الحقن ، التي أنشئت في تربية الأسماك مع فواصل الدبابات في المكان. لزيادة إجمالي إنتاج البيض ، ويمكن تعيين ما يصل السمك في نسبة اثنين إلى واحد من الذكور الإناث إذا رغبت في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي ، وبعد تشغيل أضواء الغرفة ، سحب فواصل من عدة دبابات والسماح لحوالي 20 دقيقة من وقت التزاوج دون عائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مصفاة ، وجمع البيض من أقفاص التربية وشطف لهم المياه البيض. صب البيض في صحن بيتري البيض مع الماء وإزالة الأنقاض وبويضة غير مخصبة مع ماصة نقل. ويمكن تجميع الأسماك في خزانات أكبر لانتاج قذائف إضافية من البيض للحقن. ضبط توقيت جمع البيض للسماح للأرقام الحد الأقصى من البيض إلى أن يتم إنتاجها من دون السماح لهم بالمرور المرحلة خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان شريحة المجهر في غطاء المقلوب طبق بيتري 100mm. استخدام ماصة نقل إلى خط يصل البيض ضد الجانب من الشريحة التي تشكل عمود واحد. إزالة المياه الزائدة من البيض الشريحة بالضغط على Kimwipe ضد الجانب الآخر البيض. (الشكل 1A) </li></ol> الجزء 2 : سحب إبرة ، التحميل ، وإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مجتذب micropipette ، سحب الزجاج OD 1.0mm الشعرية إلى قسمين الإبر وتخزينها في طبق بتري 150mm عن طريق وضع المعجون على سلالم سخيفة. يمكن سحب الإبر مقدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Backload الإبرة مع 3 ميكرولتر من مواد الحقن باستخدام ماصة microloader. يهز بلعة نحو غيض الإبرة حتى هناك فقاعات قليلة أو معدومة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مصدر الهواء وmicroinjector. ادخال الإبرة في microinjector وضمان ختم ضيقة داخل السكن. تأكد من أن micromanipulator في موقف مناسب للسماح لمجموعة واسعة من الحركة والتكيف. جلب رأس الإبرة في الطائرة من عرض من المجهر ، وارتفاع قبالة المرحلة ، والتركيز على أنحف منطقة الحافة. استخدام زوج من الملقط حادة لقرصة قبالة الإبرة في النقطة التي يترك إبرة ضيقة بما يكفي لاختراق المشيماء وصفار البيض ولكن لا تزال قادرة على إيصال حجم حبة متسقة. ويمكن استخدام قطرة من الزيت المعدني على ميكرومتر لحساب حجم كل حقنة. عندما يحقن في النفط ، مع حبة قطره 0.1 ملم تحتوي على 500 من المواد PL الحقن (1B الشكل) ، وتستخدم عادة حقن كميات من 500 أو PL 1nL. كساد على دواسة القدم ورصد حجم حبة في حين خفضت الإبرة وضبط ضغط الحقن حسب الحاجة. وحقن كميات مثالية ملء ما يقرب من 10 ٪ من حجم البيضة. نوعية رأس إبرة أمر حاسم لتخفيف كل من الحقن والجودة والاتساق في النتائج. </li></ol> الجزء 3 : حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان أجنة لم تتطور في المرحلة الماضية أربعة الخلية. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تكون الأجنة في مرحلة واحدة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض الإبرة في اتجاه العمود من البيض ، وعقد الطبق في مكان مع يدك المعاكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخترق سطح المشيماء وأدخل صفار بضربة واحدة على نحو سلس في حين يراقب عن أي تكسير أو تمزق في كيس المح. حقن مواد الحقن في صفار (الشكل 1C). تجنب فقاعات الهواء عن طريق الحقن أو تمتد صفار إما أن تكون قاتلة للجنين. تعمل باستمرار على الخط ، وضبط الضغط حسب الحاجة للحفاظ على حجم حبة ومتسقة ، وذلك باستخدام ماصة الحافة ، إزالة البيض التي تبدو غير مخصبة أو دمرت خلال عملية الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من عمود من البيض ، واستخدام تيار من الماء البيض لطيف لنقل البيض حقنها طبق بيتري نظيفة. كرر حسب الضرورة. تبقي عدة أجنة uninjected كمجموعة تحكم. في نهاية يوم واحد ، وإزالة أجنة ميتة وسجل عدد من الأجنة المحقونة. استبدال الماء في طبق البيض دوريا لتقليل فرصة الإصابة. </li></ol> الجزء 4 : نتائج الممثل اعتمادا على ما يجري حقن ، قد الأجنة البقاء بسعر أقل من إخوانهم uninjected. لحسن الحظ ، فإنه من السهل على ضخ كميات هائلة منه ، لذلك هذا نادرا ما يمثل مشكلة. فمن الطبيعي أن تظهر لmorphants التنمية تأخر قليلا. لتوضيح نتائج microinjection ، استخدمنا هذا البروتوكول لمعالجة مستويات البروتين القلب من الزجاج (حج). حج هو بروتين عبر الغشاء اللازمة للتنمية القلب العادي. في غيابها ، مع قلوب الأجنة تطوير مساحات تدفق العملاقة والغرف 1. حقن نحن اثنان morpholinos لم يسبق وصفه ضد حج ، وheg_e3i3_egfr1 heg_e4i4_egfr2 ، عند تركيز 500 ميكرومتر. في آخر أيام 2 الإخصاب ، والضوابط الأخوة uninjected تبدو طبيعية ، كما هو متوقع (2A الرقم وباء). أجنة حقنوا heg_e3i3_egfr1 وذمة الدماغ (الشكل 2C). على الرغم من أن قلوب معظم هذه morphants غيرت التشكل ، والغرف الخاصة بهم الحجم عادة (الشكل 2D). حقن الأجنةبعيوب المعرض heg_e4i4_egfr2 القلب متغير. بعض تبدو طبيعية ، في حين أن البعض الآخر تدفق مساحات كبيرة ومتوسطة الأذينين الموسع (2E الرقم وF). ومتحولة حج ، كما ذكرت سابقا 1 ، لديها الجهاز بشكل كبير وتوسيع تدفق الأذين (الشكل 2G و H). نحن أيضا حقن الأجنة wildtype مرنا مع 400 نانوغرام / ميكرولتر مستنسخة من كامل طول حج [كدنا]. بينما تسيطر uninjected تتطور بشكل طبيعي (الشكل 3A وباء) والأجنة حقنوا حج مرنا المعرض تشكيلة واسعة من الظواهر تتراوح ما بين ظهور wildtype لتصقلب شديد ، وتقصير من محور الجسم الرئيسي ، تنخر في الرأس والجسم ، وعيوب خط الوسط (الشكل 3C ودال). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> تصطف الشكل 1. الأجنة ليتم حقنه ضد شريحة المجهر في طبق بيتري (A). ويتحدد حجم الحقن عن طريق حقن في الزيوت المعدنية وضعت على ميكرون. وحدة تخزين حقن 500 رر ، التي يشيع استخدامها ، التي يبلغ قطرها 0.1 ملم (B). فورا بعد الحقن ، وmorpholino مرنا أو مرئيا كبقعة تلم في صفار (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> الشكل 2. وفي آخر أيام 2 الإخصاب والأجنة uninjected ليس لديهم عيوب جسيمة (A) أو النمط الظاهري القلب (B). أجنة حقنوا heg_e3i3_egfr1 morpholino وذمة الدماغ (C ، السهم) ولكن عادة حجرات القلب الحجم (D). بعض الأجنة حقنوا heg_e4i4_egfr2 morpholino ومساحات تدفق الموسع والأذينين (E ، F). حج والمسوخ مساحات تدفق الموسع بشدة والأذينين (G ، H). (أ) و (C) ، (E) ، و (G) هي صور مدينة دبي للإنترنت 4X ، (B) ، (D) ، (F) و (ه) هي الصور 20X مدينة دبي للإنترنت. ردهة = ، فإنه = تدفق المسالك. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> الشكل 3. وفي 24 التسميد آخر ساعة ، uninjected اجنة لديها طويل ، مستقيم الجسم مع عدم وجود عيوب أو نخر خط الوسط (أ) و عينان محددة بوضوح مع الأنبوب العصبي بينهما (B). بعض الأجنة حقنوا مرنا حج ، في المقابل ، يحمل محور الجسم تقصير ، نخر ، somites شوه (C) ، وتصقلب (D). (أ) و (ج) هي صور مدينة دبي للإنترنت 4X ، (B) و (D) والصور 20X مدينة دبي للإنترنت.

<ol><li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li>
</ol>

واحدة من نقاط القوة في النظام النموذجي الزرد هو السهولة التي يمكن أن تضاف إلى المنتجات جين معين أو التخلص من الجنين قبل microinjection. لoverexpress بتواجد مطلق بروتين خاص ، ترميز مرنا يحقن في صفار في المرحلة 1 - الخلية. خلال نمو الجنين في وقت لاحق ، يتم توزيع الحمض النووي الريبي في جميع أنحاء الحي وترجمتها. على العكس ، من أجل القضاء على بروتين خاص ، تستخدم morpholinos. Morpholinos هي [أليغنوكليوتيد] الاصطناعية المصممة التكامل مع العقاقير لالرناوات محددة. مثل mRNAs ، يتم حقن morpholinos في صفار في المرحلة 1 - الخلية. داخل الجنين أنها تربط الرناوات هدفهم ، ومنع الترجمة. التعديل الرئيسي الذي يحتاج الى بذل كل morpholino مرنا أو هو تركيز المادة المحقونة. قد عالية للغاية من تركيز إما morpholino مرنا أو غير محددة تسبب التسمم ، في حين يجب أن يتم اختبار كل morpholino تجريبيا لتحديد تركيز على النحو الأمثل ، وعادة تركيزات morpholino بين 200 ميكرومتر و500 ميكرومتر نهدم نشاط الجينات على نحو فعال دون أن تسبب تشوهات غير محددة. الحجم الدقيق لفتح إبرة ليست حاسمة. ويمكن ضمن مجموعة من الأحجام الإبرة ، وضغط الحقن والحقن يمكن ضبط الوقت لانتاج بلعة من حجم الصحيح. Morpholinos لها تطبيقات عديدة ، بما في ذلك تشريح وظيفي من المجالات داخل البروتين. عندما صمم لهدف محدد ، اكسون إنترون التقاطعات ، وسوف morpholinos منع الربط من حدوث هناك. درسنا آثار اثنين من morpholinos التي تربط بين اكسون - إنترون تقاطعات مرنا في حج من قبل. وheg_e3i3_egfr1 morpholino يربط بين مفترق اكسون 3 و 3 إنترون ، ومنع من الربط آلات دمج اكسون 3 في النصوص الناضجة. وبالمثل heg_e4i4_egfr2 morpholino يزيل اكسون 4. كلا exons متماثلة 3 و 4 التي تحتوي على ترميز EGF المجالات مثل تكرار. بعض الأجنة حقنوا نسخة مظهرية معتدلة heg_e4i4_egfr2 ومتحولة ، وسوف تكون هناك حاجة إلى مزيد من التجارب على فهم دور حج اكسون 4 في التنمية القلب. من المدهش ، مع حقن الأجنة heg_e3i3_egfr1 وذمة الدماغ ، وهي ميزة لا ينظر في حج المسوخ. هذا قد يكون راجعا إلى قدرة morpholinos ربط النصوص الأم التي لن تتأثر في لاقحي المسوخ.

<table><tbody><tr><td>المحقن الدقيق (Microinjector)</td><td>أداة</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI 100</td><td></td></tr><tr><td>المتحكم الدقيق (Micromanipulator)</td><td>أداة</td><td>Narishige International</td><td>MN 153</td><td></td></tr><tr><td>جهاز سحب الإبر (Needle Puller)</td><td>أداة</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P 97</td><td></td></tr><tr><td>شعيرات زجاجية (Glass Capillaries)</td><td>أداة</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100 F6</td><td></td></tr><tr><td>ماصات التعبئة الدقيقة (Microloader Pipettes)</td><td>أداة</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>حامل الإبر (Needle Holder)</td><td>أداة</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH310</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

واحدة من مزايا دراسة الزرد هو سهولة وسرعة معالجة مستويات البروتين في الجنين. يمكن إضافة Morpholinos ، والتي هي [أليغنوكليوتيد] الاصطناعية مع التكامل العقاقير لالرناوات المستهدفة ، إلى جنين للحد من التعبير عن الجينات منتج معين. على العكس ، يمكن إضافة إلى معالجة مرنا الجنين لزيادة مستويات منتج الجين. السيارة إما لإضافة أو مرنا morpholino إلى الجنين microinjection. Microinjection غير فعالة وسريعة ، مما يسمح للحقن مئات من الأجنة في الساعة. هذا الفيديو يبين كل الخطوات التي تنطوي عليها microinjection. باختصار ، يتم جمع البيض على الفور بعد أن وضعت واصطف ضد شريحة المجهر في طبق بتري. المقبل ، ويرتبط إبرة رفيعة ذات الرؤوس محملة مواد الحقن لmicroinjector ومصدر الهواء ، ويتم ضبط الضوابط microinjector لإنتاج وحدة حقن مرغوب فيه. وأخيرا ، انخفضت الإبرة في صفار الجنين ويطرد morpholino أو مرنا.

هذا الفيديو يبين كيف يمكن حقنها أو morpholino مرنا في الأجنة الزرد في مرحلة واحدة الخلية إلى نقصان أو زيادة مستوى المنتجات جين معين خلال التطور اللاحق.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

تتمثل إحدى مزايا دراسة سمكة الزيبروفيش في سهولة وسرعة التحكم في مستويات البروتين في الجنين. وتعتبر المورفولينوهات، وهي مواد تخليقية...

يتم تزاوج أسماك الزيبرا الذكور والإناث في قفص تربية تسقط فيه البيوض الملقحة إلى القاع حيث يمكن جمعها بسهولة. ثم تُصف البيوض مقابل شريحة مجهرية في طبق بتري. بعد ذلك، يتم قص إبرة الحقن المشحونة وضبط إعدادات الحقن، بحيث تكون كتلة الحقن بالحجم المطلوب عند قياسها باستخدام الميكرومتر.أخيراً، يتم حقن البيوض واحدة تلو الأخرى على طول الخط. مرحبًا، أنا جوناثان روزن من مختبر جون ما في قسم أمراض القلب في مستشفى بوسطن للأطفال. وأنا مايكل سويني، وأعمل أيضاً في مختبر VY.سنقوم اليوم بتوضيح كيفية حقن الـ mRNA أو الـ morpholino في أجنة أسماك الزيبرا. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تأثيرات تثبيط أو فرط تعبير نواتج جينية محددة. لذا، فلنبدأ.للبدء، سنحتاج إلى تجهيز أحواض الأسماك وأحواض التكاثر مع وضع الحواجز في مكانها في الليلة السابقة للحقن لزيادة إجمالي إنتاج البيض. يمكن تجهيز الأسماك بنسبة أنثيين إلى ذكر واحد إذا رغبنا في ذلك. وفي صباح اليوم التالي بعد تشغيل أضواء الغرفة، يتم سحب الحواجز من عدة أحواض والسماح بفترة تزاوج دون إزعاج لمدة 20 دقيقة تقريبًا. وباستخدام مصفاة، يتم جمع البيض من أقفاص التكاثر وشطفه بماء البيض قبل صبه في طبق بتري.باستخدام مياه البيض، يمكن إعادة تجميع الأسماك في أحواض أكبر لإنتاج جولات إضافية من البيض المخصص للحقن. اضبط توقيت جمع البيض للسماح بإنتاج أكبر عدد ممكن من البيض دون تركه يتجاوز مرحلة الخلية الواحدة. وأخيراً، ضع شريحة مجهرية في الغطاء المقلوب لطبق بتري بقطر 100 مليمتر.استخدم ماصة نقل لمحاذاة البيوض مقابل جانب الشريحة لتشكيل عمود واحد، ثم أزل المياه الزائدة من فوق الشريحة بالضغط بمناديل Kim wipe على الجانب المقابل للبيوض. بعد ذلك، سنقوم بتحضير إبر الحقن المجهري باستخدام جهاز سحب الشعيرات الزجاجية (micro pipette puller). سنقوم بسحب شعيرة زجاجية ذات قطر خارجي يبلغ 1 مليمتر لتحويلها إلى إبرتين، ثم تخزين هذه الإبر في طبق بتري بقطر 150 مليمتر. يمكن سحب الإبر مسبقاً عن طريق وضعها فوق منحدرات من معجون السيليكون (silly putty).نستخدم الإعدادات التالية: الحرارة 6، القطب 45، القطب 60، والسرعة 80. يتم تحميل الطرف العريض من الإبرة بثلاثة 3 µL من مادة الحقن باستخدام ماصة تحميل دقيقة.رُجَّ الكتلة من السائل باتجاه طرف الإبرة حتى يتبقى عدد قليل من الفقاعات أو لا يتبقى شيء. بعد ذلك، سنقوم بتشغيل مصدر الهواء والمحقن الدقيق. أدخل الإبرة في المحقن الدقيق وتأكد من إحكام الغلق داخل المبيت.تحقق من أن الميكرومانيبوليتور (micro manipulator) في وضعية مناسبة تسمح بنطاق واسع من الحركة والضبط. حرك طرف الإبرة ليكون ضمن نطاق رؤية المجهر. ارفع الإبرة بعيداً عن المنصة ثم قم بضبط التركيز على أنحف منطقة في الطرف.استخدم زوجاً من الملاقط الحادة لقطع الإبرة عند نقطة تترك الإبرة ضيقة بما يكفي لاختراق الغشاء الكوريوني والمح жел зоك، مع بقائها قادرة على تقديم حجم خرزات متسق. ولحساب حجم كل حقنة، سنستخدم قطرة من الزيت المعدني على ميكرومتر، ثم ندرج الإبرة في الزيت ونضغط على دواسة القدم لحقن خرزة من المحلول في الزيت. راقب حجم الخرزة أثناء تقليم الإبرة وضبط ضغط الحقن عند الحاجة أثناء الحقن في الزيت.تحتوي الخرزة التي يبلغ قطرها 0.1 millimeter على 500 picoliters من مادة الحقن. وعادةً ما تُستخدم أحجام حقن تبلغ 500 picoliters أو 1 nanoliter. وستملأ أحجام الحقن المثالية ما يقرب من 10% من حجم البيضة.تعد جودة طرف الإبرة أمراً بالغ الأهمية لكل من سهولة الحقن وجودة النتائج واتساقها. حان الوقت الآن للبدء في إجراء عملية الحقن. تأكد من أن الأجنة لم تتطور إلى ما بعد مرحلة الخلايا الأربع.من الناحية المثالية، يجب أن يكون الجنين في مرحلة الخلية الواحدة. بعد ذلك، قم بخفض الإبرة باتجاه عمود البويضات، واثقب سطح الغشاء السيريون (corion) ثم ادخل إلى المح الصفاقي (yolk) بحركة واحدة سلسة أثناء المراقبة. في حال حدوث أي سحق أو تمزق في كيس المح، قم بحقن مادة الحقن داخل المح.تجنب حقن فقاعات الهواء، وانتبه للأجنة التي تظهر عليها علامات التضرر الواضح نتيجة الحقن أثناء العمل على طول الصف. اضبط الضغط إذا لزم الأمر للحفاظ على حجم ثابت للقطيرة، واستخدم طرف ماصة لإزالة البيض الذي يبدو غير مخصب أو الذي تدمّر أثناء عملية الحقن. بعد الانتهاء من عمود من البيض، استخدم تدفقاً لطيفاً من ماء البيض لنقل البيض المحقون إلى أطباق بتري نظيفة، وكرر العملية حسب الحاجة.احتفظ بعدة أجنة غير محقونة كمجموعة ضابطة. لاحقاً خلال اليوم الأول، قم بإزالة الأجنة الميتة وتسجيل عدد الأجنة المحقونة. استبدل ماء البيض في الطبق بشكل دوري لتقليل احتمالية حدوث عدوى.لاحظ أنه بناءً على المادة التي يتم حقنها، قد تنجو الأجنة بمعدل أقل من أشقائها غير المحقونة. ولحسن الحظ، فمن السهل حقن أعداد هائلة منها، لذا لا يشكل هذا الأمر مشكلة في الغالب. سنعرض الآن بعض النتائج التمثيلية لكل من حقن الـ morpholino والـ mRNA.تبدو العينة الضابطة غير المحقونة بعد 48 ساعة من الإخصاب طبيعية كما هو متوقع. ومع ذلك، تظهر الأجنّة المحقونة بـ morpho HG E three i three eeg FFR one، والذي يثبط أشكال HG التي تحتوي على التكرار الأول من تكرارين من EEG flike، وذمة دماغية، وحقن heart glass. Mr.NA أنتج أيضاً نمطاً ظاهرياً واضحاً بعد 24 ساعة من الإخصاب.بدت رؤوس الضوابط غير المحقونة طبيعية. وعلى العكس من ذلك، أظهرت بعض الأجنة المحقونة بـ M NNA حالة من انعدام العينين (opia). لقد أوضحنا لكم للتو كيف يمكن لحق المورفولينوس أو mRNA خلال مرحلة الخلية الواحدة أن يزيد أو يقلل من تعبير جينات معينة خلال مراحل النمو اللاحقة. عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر ذلك أيضاً.يمكن أن يؤدي التركيز العالي من mRNA أو المورفولينو (morpho) إلى حدوث وفاة غير نوعية في الأجنة التي عولجت بالمورفولينو. يجب اختبار كل منها تجريبياً، ولكن عادةً ما تؤدي التركيزات التي تتراوح بين 200 و 500 ميكرومولار إلى تثبيط نشاط الجين بشكل نوعي دون التسبب في وفاة عامة. وهذا كل شيء.شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

microinjection-of-zebrafish-embryos-to-analyze-gene-function

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

Microinjection طريقة راسخة وفعالة لإدخال المؤثرات الأجنبية في الأجنة المخصبة الزرد. هنا ، علينا أن نظهر تقنية microinjection قوية لأداء overexpression مرنا ، والدراسات morpholino ضربة قاضية قليل النوكليوتيد الجينات في الزرد.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة يمكن من خلالها تحليل الدماغ النامي في أجنة الفقاريات الزرد يعيش في قرار خلية واحدة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ويشمل هذا الأسلوب الذي كنا حقن الجنين الزرد وحيدة الخلية وجبل لاحقا وصورة الدماغ النامي.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

خلايا الموت تنبثق من الأنسجة الطلائية التي تقلص متضافرة من الخلايا المجاورة دون تعطيل وظيفة الحاجز. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف أساليب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات في القرار الخلوية.

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

يصف هذا الفيديو تقنية الحقن المجهري للأجنة لتوصيل المركبات إلى كيس صفار الزرد.

الحقن المجهري للأجنة: تقنية لتوصيل مركب إلى صفار الزرد

في هذه المقالة، ونحن يبرهن على وجود طريقة للتلاعب في التعبير الجيني في الخلايا البطين من الدماغ الانتهائي الزرد الكبار باستخدام العقاقير أليغنوكليوتيد] morpholino. نقدم هذه الطريقة كبروتوكول فعالة وسريعة والتي يمكن استخدامها للدراسات وظيفية في الفقاريات الدماغ الكبار.

المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino

أصبح الزرد، والأسماك الاستوائية الصغيرة، نموذجا محببا لدراسة وظيفة الجين خلال التنمية الفقاريات والمرض. التعبير الزماني والمكاني من الجينات المستهدفة يمكن تحديده من...

ارتفاع القرار جبل بأكمله<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين داخل الأجنة الزرد لدراسة التعبير الجيني وظيفة

يعتبر سمك الزرد نظاما نموذجيا ممتازا للدراسات الجينية والتنموية. زرع الخرزة هو تقنية قيمة لمعالجة الأنسجة يمكن استخدامها لاستجواب آليات النمو عن طريق إدخال تغييرات في البيئات الخلوية المحلية. يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء زرع الميكروبيدات في جنين الزرد.

Microbead زرع الأجنة الزرد

يمكن أن يكون التلاعب البصري الوراثي لمسارات الإشارات استراتيجية قوية للتحقيق في كيفية فك تشفير الإشارات في التطور والتجديد والتوازن والمرض. يوفر هذا البروتوكول إرشادات عملية لاستخدام منشطات إشارات البروتين العقدي ومورفوجينيك (BMP) القائم على مجال استشعار الجهد الخفيف والأكسجين في جنين الزرد المبكر.

تنشيط الإشارات البصرية الوراثية في أجنة الزرد

اعتلالات RASopathies هي متلازمات وراثية متعددة الأجهزة ناتجة عن فرط تنشيط مسار RAS-MAPK. تظهر المتغيرات المسببة للأمراض التي يحتمل أن تنتظر التحقق من الصحة باستمرار بينما تحد البينات قبل السريرية الضعيفة من العلاج. هنا ، نصف بروتوكولنا في الجسم الحي لاختبار مستويات تنشيط ERK المرتبطة ب RASopathy والتحقق من صحتها وتعديلها الدوائي أثناء التطور الجنيني عن طريق التصوير الحي FRET في أسماك الزرد الصحفية في سن المراهقة.

بروتوكول فعال لتقييم تعديل نشاط ERK في نماذج متلازمة نونان المبكرة لأسماك الزرد عبر الفحص المجهري الحي FRET والتألق المناعي

في هذا الفيديو ، Nijole Jasinskiene يوضح المنهجية المستخدمة لتوليد البعوض المعدلة وراثيا الزاعجة المصرية ، والتي هي نواقل حمى الضنك. وأظهرت أساليب إعداد صحيح microinjection الإبر ، dessicating الأجنة ، وأداء microinjection.

Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

تعلم تقنية حقن المورفولينو أو الرنا المرسال في أجنة أسماك الزرد في مرحلة الخلية الواحدة لدراسة وظائف الجينات أثناء التطور. هذه الطريقة تتيح للباحثين التحكم في التعبير الجيني وملاحظة التأثيرات الظاهرية.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

استكشف المزيد من الفيديوهات