الهرمونات النباتية خلال رصد استجابات التوتر

تبدأ هذه الإجراءات بتجنيس المادة النباتية باستخدام خرزات سيراميك، يليه استخلاص باستخدام ثنائي كلورو ميثان للحصول على الطور العضوي. وبعد عملية الطرد المركزي، يتم تجفيف العينات في الهواء وتحضيرها للاستخلاص في الطور البخاري. وبعد عملية الشطف من مرشحات الاستخلاص في الطور البخاري، يمكن الانتقال إلى تحليل الهرمونات النباتية باستخدام مطيافية الكتلة والكروماتوغرافيا الغازية.

مرحباً، أنا ماري إنجلبيرج من مختبر جيه يو إنجلبيرج بقسم الأحياء في جامعة تكساس هنا في سان أنطونيو، وأنا جيه يو إنجلبيرج. سنعرض لكم اليوم إجراءً بسيطاً للتقدير الكمي المتزامن لهرمونات نباتية مهمة. نحن نستخدم هذه الطريقة بشكل روتيني لمراقبة التغيرات في هذه الهرمونات في النباتات عند تعرضها لآفات حشرية.

يمكننا أيضاً مراقبة التغيرات في تركيب الأحماض الدهنية. لذا لنبدأ العمل. بالنسبة لعملية الاستخلاص، ستحتاج أولاً إلى تحضير قارورتين بسدادة لولبية سعة 2 mL.

للقيام بذلك، أضف 400 µL من محلول الاستخلاص و 10 µL من المعيار الداخلي المقابل بتركيز 10 ng/µL إلى أنبوب. بعد ذلك، قم بتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل. وبعد التجميد، أضف الخرزات الخزفية إلى الأنابيب.

بينما لا تزال القارورات موضوعة في النيتروجين السائل، أضف مادة نباتية تتراوح كتلتها بين 50 و 200 milligrams. ضع في اعتبارك أنه يجب تقدير وزن المادة النباتية المضافة قبل المتابعة في المعالجة للسماح بالتقدير الكمي الدقيق لاحقاً، والذي يعتمد على الوزن الطازج. تأكد من تبخر كل النيتروجين السائل قبل إغلاق القارورة بإحكام باستخدام الغطاء.

تأكد من وجود سدادة مطاطية للغطاء لمنع تسرب المذيبات والمركبات المستخلصة أثناء عملية التجانس. قم بتجنيس النسيج باستخدام مطحنة خرز من نوع fast prep أو PSUs. استخدم جهاز التجنيس بسرعة 6,000 لـ PSUs لمدة 30 ثانية.

بمجرد إتمام عملية التجانس، أخرج الأنابيب من جهاز التجانس بشكل فردي وافتح الغطاء بعناية لإضافة 1 mL من di chloral methane إلى كل عينة، ثم أغلق الأنابيب بإحكام مرة أخرى وقم بالتجانس لمدة تتراوح من 10 إلى 15 ثانية عند 6,000. بعد التجانس، انقل الأنابيب إلى جهاز طرد مركزي مكتبي وافصل الطور العضوي عن الطور المائي عند 10,000 ×g لمدة 60 ثانية. بعد فصل الأطوار، انقل الطبقة الخضراء السفلية من الأنابيب الفردية إلى أنبوب زجاجي نظيف سعة 4 mL.

هذه هي الطور العضوي الذي يحتوي على الهرمونات والمعايير الداخلية. تجنب نقل الماء أو الطور العلوي، ثم قم بتبخير المذيب باستخدام الهواء عبر مجمع أنابيب (manifold) لمدة تتراوح من 10 إلى 25 دقيقة تقريباً. وتعتمد المدة الزمنية على العينة.

تحقق باستخدام طرف تدفق هوائي واحد للتأكد بدقة مما إذا كانت العينات جافة. احرص على عدم تجفيف العينات بشكل مفرط لأن ذلك قد يؤدي إلى فقدان المركبات. وبمجرد جفاف العينات، يمكننا البدء في عملية مَثيلة المركبات التي تحتوي على حمض كربوكسيلي في عيناتنا.

أولاً، أضف 100 µL من خليط D ethyl ether methanol بنسبة حجمية قدرها تسعة إلى واحد في كل أنبوبة. بعد ذلك، أضف 4 µL من محلول trimethyl Cyl Diaz methane بتركيز 2 molar في hexane. أغلق الأنابيب فوراً باستخدام سدادة لولبية مفتوحة القمة ومزودة بحاجز silicone مبطن بـ Teflon، ثم رج الأنابيب برفق واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 25 إلى 30 دقيقة.

قم بتشغيل كتلة التسخين واضبطها على درجة حرارة التجميع المطلوبة. ستختلف تطايرية المركبات المُمثيلة بناءً على حجمها وعدد المجموعات القطبية فيها. يمكن أن تتراوح درجات الحرارة بين 80 و 200 درجة؛ وبعد حضانة لمدة 30 دقيقة، أوقف تفاعل الممثيلة بإضافة 4 µL من محلول حمض الأسيتيك بتركيز 2 M في الهكسان إلى كل أنبوبة.

يتم القيام بذلك لتجنب التفاعلات الثانوية غير المرغوب فيها. إن المرشحات المستخدمة في استخلاص الطور البخاري مصنوعة يدويًا، حيث يتم تصنيعها من أنابيب Teflon.

من أحد الجوانب، يتم إدخال أنبوب زجاجي محكم الغلق بطول حوالي أربعة سنتيمترات. يمكنك رؤية قرصين من شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ، واللذين يحملان حوالي 20 إلى 30 milligrams من المادة الماصة. اغسل المرشحات التي ستُستخدم لجمع الهرمونات النباتية الميثيلية والمتطايرة باستخدام 200 µL من الميثانول.

بعد ذلك، اغسل المرشحات مرتين باستخدام 200 µL من ثنائي كلوروميثان. جفف المذيب المتبقي من المرشحات في الهواء. يمكن الآن استخدام المرشحات لاحتجاز الهرمونات المتطايرة من خلال استخلاص الطور البخاري.

بعد تحضين العينات لمدة 30 دقيقة، يتم قطع السدادات المطاطية لأغطية القوارير سعة أربعة ملليلتر باستخدام مشرط. الآن تصبح المادة المستخلصة جاهزة للجمع من أجل استخلاص الهرمونات النباتية عن طريق استخلاص الطور البخاري. يتم توصيل المرشحات النظيفة بخطوط تفريغ فردية بمعدل تدفق يبلغ حوالي 800 ملليلتر في الدقيقة.

يتم بعد ذلك إدخال المرشحات في القارورة عبر السدادات المقطوعة. كما يتم إدخال طرف ماصة صغير ليعمل كمدخل للهواء. خلال هذا الجزء الأولي من الإجراء، يجب إبقاء القارورات التي تحتوي على المرشحات في وضع عمودي لتجنب ملامسة أي من السائل الموجود داخل القارورة لطرف المرشح، مما قد يؤدي إلى تلوث المرشح.

وبعد ذلك، يتم إمساك القوارير يدويًا في جهاز GCMS حتى يتبخر كل السائل عبر المرشح. ثم توضع القوارير مع المرشحات المتصلة بها على كتلة التسخين، ويتم تجميع المركبات المتبخرة حراريًا لمدة ثلاث دقائق. وبعد خطوة استخلاص الطور البخاري النهائية هذه، توضع القوارير مع بقاء المرشحات متصلة بها على حامل وتترك لتبرد.

قم بتجهيز قوارير GC سعة 1.5 milliliter مزودة ببطانات إدخال (inserts) عندما تصل المرشحات إلى درجة حرارة الغرفة. ثم، قم بنقل حلقة تحتوي على 150 microliters من di chloral methane إلى القوارير. وبعد نفخ المذيب المتبقي من المرشح، يتم إغلاق القوارير بالأغطية، وبذلك تصبح جاهزة للتحليل باستخدام تقنية مطيافية الكتلة المرتبطة بالكروماتوغرافيا الغازية.

للتحليل، استخدم جهاز كروماتوغرافيا غازية مجهزاً بحاقن بنظام التقسيم (split injector) متصلاً بمطياف كتلة يعمل بنمط التأين الكيميائي، حيث يتم فصل المركبات المحقونة على عمود HP-1MS يتم الحفاظ عليه عند درجة حرارة 40 °C لمدة دقيقة واحدة. يتم برمجة درجة الحرارة لترتفع بمعدل 15 °C في الدقيقة وصولاً إلى 250 °C لمدة 10 دقائق، مع استخدام الهيليوم كغاز حامل بتدفق ثابت قدره 0.7 mL/min. وبالنسبة للتحليل المعتمد على مطياف الكتلة، يمكن استخدام كل من مطياف الكتلة رباعي القطب (quadrupole) ومطياف الكتلة القائم على مصيدة الأيونات (ion trap) كغاز CI.

يمكن استخدام الإيزوبوتان أو الميثانول. ومع ذلك، وفي كلتا الحالتين، يجب التحقق من شظايا تفاعل التأين قبل إنشاء برامج عد الأيونات المختارة. نحن نستخدم نظام كروماتوغرافيا غازية من طراز variant GC 3, 900 متصلاً بمطياف كتلة Saturn MS 2200، مع استخدام الميثانول ككاشف لـ CI.

يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب للحصول على وصف لبرنامجنا. تأكد من تحديد جميع المركبات من خلال المقارنة مع معايير أصلية متاحة تجارياً. يتم تقدير كمية JA SA و A BA عن طريق ربط مساحة القمة للأيونات المستخلصة بمساحة القمة للأيونات المستخلصة للمعيار الداخلي المقابل، كما يعتمد ذلك أيضاً على الوزن الطازج للمادة النباتية المستخدمة.

بعد استخراج البيانات من ملفات GCM S وإجراء بعض الحسابات، وجدنا أن ethin أدى إلى تراكمات ملحوظة من حمض الساليسيليك، وحمض المونيك، وكذلك حمض الأبيسيك مقارنة بالمجموعات الضابطة غير المعالجة. وقد تم الحصول على البيانات الخاصة بكل هرمون على حدة من تشغيلة واحدة، مما يوضح قدرة هذه الطريقة على إجراء تحليل متعدد الهرمونات. لقد استعرضنا لكم للتو إجراءً سهلاً وفعالاً في آن واحد لاستخلاص وتقدير كمية الهرمونات النباتية الهامة ومركبات الإشارة الأخرى.

من السهل تنفيذ هذا الإجراء، ويمكن صنع معظم الأدوات التي رأيتموها بسهولة من مواد مختبرية قياسية. هذا كل شيء. شكراً لمتابعتكم، وبالتوفيق في تجاربكم.