Channelrhodopsin2 تحفيز ساطة من الإمكانيات في متشابك ذبابة الفاكهة العضلية المفارق

يبدأ هذا الإجراء بزراعة ذبابة الفاكهة. ثالثا ، يرقات الطور مع النمط الجيني المناسب على الطعام الذي يحتوي على كل الريتينول المتحول. يتم تثبيت كل يرقات من الرأس والذيل.

ثم FLA شقة. ثم يتم قطع الدماغ والأعصاب الخلفية لإيقاف النشاط الحركي الإيقاعي. بعد ذلك ، يتم ضبط مصدر ضوء LED الأزرق مع صندوق التحكم والتركيز على التحضير.

أخيرا ، استخدم قطبا كهربائيا حادا لتثبيت العضلات الستة. ثم قم بتوصيل نبضات ضوئية بمصدر جهد. مرحبا ، أنا نيكولاس مارستين من مختبر الدكتور ليزلي جريفيث ، قسم الأحياء في جامعة برانديز.

مرحبا ، أنا ستيفان بولفر ، أيضا من مختبر جريفيث. سنعرض لك اليوم إجراء لاستحضار الإمكانات المشبكية مع غياب جذر القناة اثنين عند التقاطع العصبي العضلي ليرقة ذبابة الفاكهة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة فسيولوجيا التشابك ذبابة الفاكهة.

نستخدمه أيضا لتعليم الطلاب علم وظائف الأعضاء المشبكي ومختبرات التدريس. لذلك دعونا نبدأ. لبدء استخدام هذا البروتوكول ، حافظ على قناة UAS redsin اثنين وحسنا ، 3 7 ، 1 جالون أربعة خطوط ذبابة في زجاجات منفصلة تحتوي على وسائط ذبابة قياسية.

اجمع العذارى من ، حسنا ، 3 7 ، 1 جالون ، أربعة خطوط ذبابة وذكور من قناة UAS redsin. سطرين. بعد ذلك ، اصنع وسائط ذبابة ممزوجة بمللي مولار واحد ، أو كل الريتينول المتحب أو TR.To تفعل ذلك تذوب وسائط الذبابة العادية في الميكروويف لمدة دقيقة واحدة تقريبا.

بمجرد الذوبان ، اترك الوسائط تبرد لمدة 30 إلى 60 ثانية ، ثم أضف 100 ميكرولتر من 100 ملليمولار في 100٪ إيثانول لكل 10 ملليلتر من وسائط الذبابة. عندما تكون القوارير التي تحتوي على وسائط TR جاهزة ، ضع الذكور والإناث المجمعين في كل قارورة. ضع القوارير في منطقة مظلمة عند 22 إلى 25 درجة مئوية للسماح للذباب بالتزاوج ووضع البيض انتظر من أربعة إلى خمسة أيام حتى تظهر يرقة النجمة الثالثة.

في هذه المرحلة ، يمكنك التخلص من الذباب البالغ. نحن الآن على استعداد للمضي قدما في إعداد جهاز الفيزيولوجيا الكهربية. قم بتوصيل أي عدسة ذات نطاق تشريح بمصدر ضوء LED أزرق مع بالوعة حرارية.

استخدم عمودا ومشبكا لتوصيل قاعدة مغناطيسية بالعدسة ومصدر ضوء LED. ضع القاعدة المغناطيسية على طاولة الهواء لجهاز الفيزيولوجيا الكهربية. بعد ذلك ، قم بتوصيل مصدر الضوء بدائرة تحكم ، ثم قم بتوصيل دائرة التحكم بمصدر جهد خارجي.

نستخدم خرج الجهد من نظام الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية لمختبر الطاقة الذي تم إنشاؤه بواسطة أدوات الإعلان. بمجرد توصيله بمصدر الجهد ، أعط نبضات من واحد إلى خمسة فولت لدائرة التحكم من أجل تنشيط الضوء الأزرق ، واضبط القاعدة المغناطيسية ومصدر الضوء حتى يركز شعاع الضوء الأزرق على المنطقة التي سيشغلها تشريح اليرقات. بعد إجراء التعديلات المناسبة ، نحن على استعداد للانتقال إلى تشريح اليرقات.

لبدء التشريح ، ضع ستة دبابيس 0.1 ملم في أرضية طبق مبطن بالسوغار. قم بإزالة ثلث يرقات النجمة من وسط الطعام وضعها في أي طبق بتري بلاستيكي. اشطف اليرقات بالمحلول الملحي لإزالة أي طعام متصل باليرقات.

ثم وضعت اليرقات في طبق التشريح بالقرب من المسامير المسحوبة وملأت الطبق في منتصف الطريق بالمحلول الملحي. الآن قم بتوجيه اليرقات بحيث يمكنك رؤية أنبوبين فضيين يعملان على طول السطح الظهري للحيوان. هذه الأنابيب الفضية هي القصبة الهوائية.

أدخل دبوسا كبيرا مباشرة في الذيل بين أنابيب القصبة الهوائية. أمسك اليرقات لأسفل وضع دبوسا كبيرا ثانيا في رأسها. تأكد من مد الجسم بالطول عند إدخال الدبوس.

استخدم المقص لعمل شق صغير بالقرب من الذيل. استمر في الشق بطول الجسم. تأكد من رفع أطراف المقص لتجنب قطع الأعصاب البطنية و / أو عضلات جدار الجسم.

ضع أربعة دبابيس على الزوايا الأربع للحيوانات. الآن افتح قسم الوسط. ضع المسامير في طبق التشريح لتقطيع.

قم أيضا بتثبيت المستحضر بحيث يتم تدريسه باستخدام الملقط والمقص. قم بإزالة أجسام والجهاز الهضمي والقصبة الهوائية والدهنية. اشطف التحضير بالمحلول الملحي.

بعد الشطف ، حدد موقع الفصوص الأمامية والعقدة البطنية للتحضير باستخدام مقص صغير. قطع العقدة البطنية بعناية خلف الفصوص الأمامية مباشرة. بمجرد اكتمال التشريح ، تابع تحفيز الضوء الأزرق وتسجيل العضلات.

لإجراء تسجيل العضلات ، اسحب قطب كهربائي مقاوم من 10 إلى 20 ميجا أوم. باستخدام مجتذب قطب كهربائي إلكتروني ، املأ القطب المسحوب بثلاثة مولار KCL. ضع القطب المملوء في حامل القطب.

الآن ضع إعداد اليرقات تحت مجهر تشريح على الحفارة. اضبط الضوء الأزرق بحيث يتم توسيط الإعداد المفصل في شعاع الضوء. حدد العضلات ستة أو M ستة في أي جزء من جدار الجسم من اليرقة باستخدام مناور دقيق ، وأدخل قطبا كهربائيا بعناية في M ستة وراقب فرط الاستقطاب السريع للعضلة.

يجب أن تكون إمكانات الغشاء المريح في أي مكان من سالب 30 مللي فولت إلى سالب 70 مللي فولت. بمجرد إدخال القطب الكهربائي بشكل صحيح ، أعط نبضات جهد من 20 إلى 100 مللي ثانية لدائرة التحكم. زيادة الجهد المزود لدائرة التحكم بشكل تدريجي.

راقب إمكانات تقاطع الإكسي في الخلية العضلية. فيما يلي نتيجة تمثيلية توضح إمكانات تقاطع الخارج التي تثيرها نبضات ضوئية قصيرة. السعة المحتملة لتقاطع الخارج الموضحة هنا هي السعة المجمعة من خليتين عصبيتين حركيتين معروفتين أنهما يأكلان.

م ستة. يمكن أن تكشف الشدة المنخفضة أو الفترات الأقصر للضوء عن إمكانات التوصيل الاستثاري ذات السعة الأصغر من خلية عصبية حركية واحدة. لقد أوضحنا لك للتو كيفية أداء طريق القناة في غياب اثنين من التحفيز بوساطة للإمكانات المشبكية عند تقاطع العصبية العضلية OPH.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم إتلاف جدار الجسم في التحضير أثناء التشريح. من المهم أيضا أن تتذكر أنه على الرغم من أن الإعداد قد يكون مفرطا في الإثارة بعد التشريح ، إلا أنه سيهدأ بمرور الوقت ويسمح بتسجيلات جيدة. عند تخويق العضلات ، احرص على عدم النزول إلى ما دون الطبقة الأولى من العضلات في جدار الجسم.

عندما يكون القطب الكهربائي عالقا في جدار الجسم. يمكنك في بعض الأحيان الحصول على إمكانات مفرطة الاستقطاب ولكن ليس في الواقع في خلية عضلية. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.