تلفيق عضلي يبني الأنسجة المهندسة

تبدأ هذه العملية بحصاد أنسجة العضلات الهيكلية من فئران Lewis Wraths حديثة الولادة. ومن هذه الأنسجة نقوم بعزل الخلايا العضلية أرومية (myoblast cells). تُزرع هذه الخلايا العضلية أرومية في أطباق زراعة الأنسجة لمدة يومين، ثم تُحصد وتُخلط في مزيج لبناء نسيجي قائم على الكولاجين.

يتم نقل هذا الخليط بعناية باستخدام الماصة إلى قالب مغمور في وسط استزراع ويُحضن عند 37 درجة مئوية. مرحباً، أنا كريستينا بيساك من مختبر دوغلاس كوان في قسم التخدير بمستشفى الأطفال في بوسطن وكلية الطب بجامعة هارفارد. سنعرض لكم اليوم إجراءً لإنشاء نسيج عضلي مهندس.

نستخدم هذا الإجراء لتصنيع نسيج مهندس لإدخاله في القلب. هدفنا هو إنشاء اتصال كهربائي بين الحجرات العلوية والسفلية للقلب كعلاج بديل لزراعة منظم ضربات القلب لدى الأطفال الذين يعانون من حصار قلبي كامل. لذا، فلنبدأ.

في هذا التركيب، يُستخدم قالب الصب لتوفير شكل للتركيب النسيجي القائم على الكولاجين القابل للزرع جراحياً. يصف هذا الفيديو عملية إنشاء تركيبات نسيجية مهندسة تحتوي على أرومات عضلية هيكلية. كما يتم عرض عملية الزرع القلبي للنسيج الخلوي الذي تم تحضيره وفقاً لهذا البروتوكول.

يمكن صنع قالب الأنسجة بأي شكل أو حجم تقريباً لتلبية المتطلبات الفسيولوجية لأي قلب صُممت الأنسجة من أجله. في هذا العرض التوضيحي، سيقوم القالب بتشكيل قطعة من النسيج يمكن تقطيعها لتناسب الأخدود الأذيني البطيني (AV groove) لقلب جرذ بالغ. ابدأ في بناء القالب باستخدام شفرة حلاقة لقطع أنبوب السيليكون إلى قطع بطول ثلاثة سنتيمتر، ثم اقطع كل قطعة طولياً من المنتصف.

اقطع قطعة صغيرة من شبكة البوليستر. بعد ذلك، ضع قطرة من لاصق السيليكون RTV المخصص للغرسات على السطح الداخلي لنهاية الأنبوب تماماً. حاول تقليل كمية اللاصق المستخدمة إلى أدنى حد ممكن لأنها سامة إلى حد ما للخلايا المستنبتة.

ضع بسرعة قطعة صغيرة من شبكة البوليستر فوق قطرة اللاصق السيليكوني وقم بمحاذاتها مع نهاية الأنبوب. سيوفر ذلك سطحاً مسطحاً ومرتفعاً قليلاً لتثبيت البنية. كرر هذه العملية للطرف الآخر من الأنبوب.

اترك القالب ليجف في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاثة أيام. من المفيد صنع 20 إلى 30 قالبًا في المرة الواحدة لأن هذه القوالب مخصصة للاستخدام مرة واحدة أساسًا. وبمجرد جفاف المادة اللاصقة تمامًا، ومن أجل المساعدة في تعقيم القوالب، قم بتخزينها في حاوية مملوءة بـ 70% ethanol حتى يحين وقت استخدام القوالب المُجهزة.

بعد ذلك، حدد ما إذا كانت جميع المحاليل المطلوبة جاهزة للاستخدام أيضاً للتحضير لعزل الخلايا. قم بتحضير محلول لامينين مخفف يتكون من 1 mg من اللامينين في 250 mL من محلول PBS المعقم بالترشيح عبر مرشح 0.2 micron ويحتوي على مضادات حيوية ومضاد للفطريات.

بعد ذلك، تُطلى أطباق زراعة الأنسجة مقاس 150 millimeter بأربعة milliliters من محلول الـ laminate المخفف وتُحضن عند 37 degrees Celsius لمدة أربع ساعات على الأقل قبل الاستخدام. كما يجب تحضير محلولين آخرين: وسط الميوبلاست ومحلول هضم العضلات الهيكلية.

يُرجى الرجوع إلى الجزء النصي من البروتوكول لمعرفة تركيباتهم. التصفية. يتم تعقيم محلول الهضم المنظم باستخدام قرص ترشيح 0.2 micron مثبت على محقنة سعة 10 milliliter. يمكن تخزين حصص محلول الهضم المنظم عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius.

قدّر أنك ستحتاج إلى 5 mL من محلول الهضم المنظم لكل بطن من جرذان Lewis. قم بتحضين الكمية المطلوبة من محلول هضم الأنسجة المنظم و 10 mL من وسط زراعة الخلايا العضلية (myoblast medium) عند درجة حرارة 37 °C. ثم ابدأ في تشريح صغار الجرذان.

أولاً، يتم الحصول على بطن واحدة على الأقل من صغار جرذان لويس (Lewis rats) المضحى بها باستخدام الملاقط ومقص صغير. يتم إزالة العضلات الموازية للفقرات من صغار جرذان لويس الميتة عن طريق الشق طولياً في الظهر على طول الحبل الشوكي، ثم تقشير طبقات الجلد واللفافة وإزاحة العضلات. توضع العضلات المستأصلة في أنبوبة مخروطية سعة 50 milliliter مملوءة بـ 40 milliliters من محلول one X-H-B-S-S على الثلج.

اترك شرائح العضلات لتستقر في قاع الأنبوب، ثم قم بإزالة معظم السائل وبقايا الدم بعناية عن طريق الشفط باستخدام ماصة باستور معقمة في مزرعة. بعد ذلك، صب قطع العضلات التي تم حصادها في طبق زراعة بقطر 150 مليمتر، واشفط أكبر قدر ممكن من السائل المتبقي. وباستخدام شفرتي حلاقة أحادية الحافة، قم بفرم النسيج حتى يتحول إلى معجون سميك.

سيتم هضم عجينة العضلات في محلول هضم مُدفأ مسبقاً. صُب جزءاً من محلول الهضم فوق عجينة العضلات، ثم انقل المزيج المكون من المحلول وعجينة العضلات إلى أنبوب سعة 50 milliliter جديد. باستخدام ماصة سعة 10 milliliter ولضمان الهضم الفعال لعضلات جرذان لويس (Lewis Rats) التي تزن ثلاثة لترات بشكل عام، نستخدم من 10 إلى 15 milliliters من المحلول.

ضع الأنبوب على منصة هزازة وقم بعملية الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبًا. خلال الهضم الإنزيمي، يتم تريتيد النسيج من حين لآخر دون تكوين فقاعات. باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر مثبتة على ماصة لاسلكية.

بمجرد تمييع العضلة، مرر المحلول عبر مصفاة خلايا بقطر 70 micron. ثم قم بطرد الخلايا المفلترة مركزياً في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق بسرعة 600 G، وباستخدام ماصة باستور وجهاز شفط، اسحب أكبر قدر ممكن من السائل وأعد تعليق الراسب في 10 milliliters من وسط زراعة الخلايا العضلية (myoblast Medium) الدافئ. اترك الخلايا على طبق زراعة أنسجة غير مطلي بقطر 150 millimeter لمدة 15 دقيقة للمساعدة في إزالة أي أرومات ليفية (fibroblasts)، حيث إنها تلتصق بشكل أسرع من الخلايا العضلية (myoblasts).

ضع الطبق في حاضنة رطبة مضبوطة على 37 درجة مئوية مع 5% carbon dioxide. أخرج الطبق من الحاضنة وانقل الخلايا التي لم تلتصق بعد بالمزرعة المطلية بـ Lamin. وزعها وخففها في وسط myoblast بحيث يكون هناك طبق واحد لكل جروين إلى جرو واحد من الجرذان.

إذا تم توزيع الخلايا بكثافة عالية جداً، فستتمايز إلى أنابيب عضلية. وأخيراً، تُترك الخلايا لتنمو في حاضنة رطبة عند 37 °C مع 5% carbon dioxide. وبعد فترة حضانة تتراوح من يوم إلى يومين، ستصبح الخلايا جاهزة للصب في قوالب بناء الأنسجة.

بعد فترة تحضين تتراوح بين يوم إلى يومين، أخرج أربعة من أطباق زراعة أنسجة الخلايا العضلية (myoblast) مقاس 150 مليمتر من الحاضنة. يجب ألا تتجاوز مدة الانتظار 48 ساعة، وإلا ستطغى الخلايا الليفية (fibroblasts) على تعداد الخلايا العضلية. قم بشفط الوسط الغذائي من الخلايا.

بعد ذلك، اشطف الخلايا مرتين باستخدام XPBS مدفأ إلى 37 درجة مئوية لفصل الخلايا العضلية الأولية (myoblast) عن الطبق، ثم أضف أربعة ملليلتر من محلول 0.05% tryin EDTA المدفأ إلى كل طبق وأعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة خمس دقائق. قم بحصاد الخلايا العضلية الأولية داخل غطاء التدفق الصفحي (culture hood) واجمع السائل في أنبوب سعة 50 ملليلتر. استخدم 10 ملليلتر من وسط استزراع الخلايا العضلية الأولية لشطف جميع الأطباق واجمع هذا السائل مع الخلايا في أنبوب الطرد المركزي.

قم بترسيب الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 600 G وقم بسحب أكبر قدر ممكن من السائل الزائد. الآن، أعد تعليق الخلايا العضلية (myoblasts) في 1.4 milliliters من وسط استنبات الخلايا العضلية وضعها على الثلج. باستخدام الملقط وبحذر، أخرج قالب البناء من حمام الإيثانول واشطفه مرتين عن طريق غمره في XPBS، ثم اسحب جميع آثار PBS باستخدام ماصة باستور قبل وضع القالب في بئر فارغة من طبق زراعة أنسجة سداسي الآبار.

في هذه المرحلة، يجب تحضير المحلول. يتم تجميع الكواشف التالية على الثلج: 10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin.

إعادة تعليق خلايا كولاجين النوع الأول في وسط الخلايا العضلية الأولية بيكربونات الصوديوم والجل. امزج الكواشف وفقاً للبروتوكول المكتوب. قم برج المزيج بجهاز الفورتكس لمدة 20 ثانية حتى يتحول لونه إلى الوردي.

يُرجى ملاحظة أن أنواع كولاجين النوع الأول المتاحة تجارياً لها تأثيرات متفاوتة على عملية الخلط والتصلب والقوام في المنتج النهائي. أعد الأنبوب إلى دلو الثلج لبضع دقائق للتخلص من الفقاعات الموجودة في المحلول.

يجب ألا يتم تعريض الكولاجين من النوع الأول للإشعاع وإلا فلن يتحول إلى جيلاتين. نستخدم هنا منتجاً مشتقاً من جلد البيض. وقبل أن يتصلب الخليط، يتم صبه بعناية في القالب الموجود في طبق الزرع.

سيتسع كل قالب لنحو 1 mL من السائل اللزج. حاول تجنب إدخال فقاعات الهواء أثناء هذه العملية. انقل الطبق الذي يحتوي على قوالب البناء بعناية إلى الحاضنة عند 37 °C.

مع تصلب الخليط، سيتغير لونه من الوردي الداكن إلى الوردي الفاتح؛ وبينما يتصلب القالب، قم بتدفئة بعض وسط زراعة الخلايا العضلية (myoblast medium) إلى 37 درجة Celsius. بعد حوالي نصف ساعة من الحضن، اغمر كل بنية نسيجية بعناية في وسط زراعة الخلايا العضلية الدافئ، ثم أعِد الطبق إلى الحاضنة. عند تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح، تصبح البنية النسيجية التي تحتوي على الخلايا العضلية جاهزة للزرع في الجسم الحي (in vivo) أو لإجراء مزيد من التحليلات.

بعد يومين من الحضن، لقد عرضنا لكم للتو كيفية تصنيع بنية هندسية لأنسجة عضلية. عند إجراء هذه العملية، من المهم تذكر الاحتفاظ بجميع الكواشف اللازمة لمحلول البنية على الثلج لمنع التصلب المبكر. وبهذا نكون قد انتهينا.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.