يعيش تصوير الكثيفة الأساسية الحويصلات في الخلايا العصبية الأولية الحصين مثقف

يعتبر تصوير الخلايا الحية مفيداً بشكل خاص عند دراسة ديناميكيات النقل العضوي. سيسلط هذا الفيديو الضوء على إجراء يُستخدم لتصوير الحبيبات ذات النواة الكثيفة في عصبونات الحصين المستنبتة. يتم أولاً الحصول على معقدات عفن transfection عن طريق خلط وسط D-N-A-M-E-M وكاشف lipectomy transfection.

بما أن عصبونات الحصين يتم زرعها على شرائح تغطية مقلوبة تواجه طبقة أحادية من الخلايا الدبقية، فيجب قلب هذه الشرائح لتعريضها لكاشف عفن ترانسفكشن. وبعد إعطاء وقت كافٍ للتعبير عن بروتينات الحبيبات كثيفة اللب ذات علامة GFP، يتم إنشاء غرفة تصوير. ويمكن إجراء تصوير للحبيبات كثيفة اللب ICALs في العصبونات المزرعة باستخدام مجهر الفلورسنت ذو المجال الواسع.

يتميز هذا البروتوكول بالمرونة ويمكن تطويعه لتصوير عضيات أخرى مثل الميتوكوندريا، والجسيمات الداخلية، والبيروكسيسومات. مرحباً، أنا مايكل سيلفرمان وأرحب بكم في مختبري لعلوم الأعصاب الخلوية في جامعة سايمون فريزر. نحن مهتمون بكيفية حركة العضيات في الخلايا العصبية.

لمعالجة هذا السؤال، سنقوم بوضع علامة على العضيات الغشائية، وتحديداً الحويصلات ذات النواة الكثيفة في عصبونات حصينية مستزرعة. ولإظهار كيفية القيام بذلك، سأترك المجال لديفيد. مرحباً، أنا ديفيد من مختبر سيلفرمان.

سأعرض لكم اليوم إجراءً للتصوير الحي للخلايا للـ dense core vesicles والعصبونات المستزرعة باستخدام مجهر western واسع المجال. لنبدأ الآن. في معظم التجارب، نستخدم أطباقاً من عصبونات الحصين للجرذان التي تم استزراعها بكثافة خلوية تبلغ 250,000 خلية لكل طبق بقطر 6 سنتيمتر؛ لكل عملية عفن (transfection)، قم بتسمية أنبوبين سعة 1.5 ملليلتر، أحدهما لـ plasmid DNA والآخر لكاشف العفن.

في كبينة التدفق الصفائحي، ولدمج 1 µg من الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) مع 100 µL من وسط MEM في أنبوب واحد في درجة حرارة الغرفة، تأكد من استخدام MEM لا يحتوي على أي مكملات. ادمج 6 µL من الليبوزوم مع 100 µL من MEM في الأنبوب الآخر. يمكن استخدام نفس الكمية في حالة عفن مزدوج (double transfect)، على الرغم من أن نسبة الليبوزوم إلى DNA ستنخفض إلى النصف في هذه الحالات.

للحفاظ على فترة صلاحية كاشف الدهون، يجب إبقاؤه مبرداً أو في مبرد مكتبي في جميع الأوقات، ثم تُحضن الأنابيب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل خليط DNA في MEM إلى أنبوب الدهون وامزجه بلطف باستخدام APE، ثم حضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد مرور 25 دقيقة، أضف 60 µL من حمض K neuronic بتركيز 50 mM لتقليل الضرر السمي للخلايا في العصبونات المستنبتة.

بما أننا نقوم بزراعة العصبونات على الجانب السفلي من شرائح التغطية المعلقة فوق طبقة أحادية من خلايا GL، فمن الضروري قلب شرائح التغطية وتعريض العصبونات إلى محلول عفن التحول (transfection). اقلب الشرائح بعناية بحيث يكون الجانب السفلي للأعلى باستخدام ملقط معقم، ثم رتبها بحيث لا تتداخل فيما بينها.

احذر من كشط السطح المغطى بالنيورون في شريحة التغطية أو السطح المغطى بـ ggl في الطبق. في نهاية فترة الحضن التي تستغرق 30 دقيقة، خذ حوالي 0.5 milliliters من الوسط من الطبق الذي قطره ستة سنتيمترات واخلطه بلطف مع الـ DNA في الأنبوب. انقل محلول الـ DNA مرة أخرى إلى الطبق عن طريق تقطيره بالتساوي على سطح الوسط.

حرك الطبق برفق ذهاباً وإياباً في اتجاه واحد، مع الحرص على عدم إحداث انتفاخ في الوسط. بعد الخلط في اتجاه واحد، توقف وكرر العملية في الاتجاه العمودي لتوزيع معقدات DNA lipectomy بشكل متساوٍ في جميع أنحاء الطبق. يتم التحضين لمدة 90 دقيقة في حضانة زراعة الأنسجة عند 37 درجة C و 5% carbon dioxide.

بعد التحضين، اقلب شرائح الغطاء بحيث تكون الجهة التي تحتوي على الركائز للأسفل، ورتبها بحيث لا تتداخل. وأخيراً، اترك عملية التعبير عن DNA تستمر للمدة المطلوبة، والتي تتراوح عادةً من ليلة واحدة إلى 48 ساعة في الحاضنة. يتطلب التصوير الحي للحبيبات ذات النواة الكثيفة المحددة بـ GFP في الخلايا العصبية الحصينية المستزرعة مجهراً فلورياً مجهزاً بكاميرا CCD.

ستحتاج إلى غرفة تصوير مزودة بمتحكم في درجة الحرارة وسخان للعدسة الشيئية. يجب ألا تحتوي الغرفة على أي منافذ مفتوحة، وهو تعديل يمكن إدراجه عند طلب الغرفة. بعد ذلك، قم بتشغيل كاميرا المجهر والمصباح الفلوري وبرنامج الحصول على الصور.

قم بتشغيل الطاقة لمنصة الغرفة وسخانات الشيئية. هذا هو الوقت المناسب أيضاً لوضع قطرة من الزيت على العدسات الشيئية. الآن، قم بتجهيز المنصة المسخنة وغرفة التصوير.

لتسهيل عملية المناولة، قم بتحديد أحد جانبي غطاء الغرفة باستخدام قلم تحديد دائم. ضع غطاء الغرفة بحيث يكون وجهه للأعلى على غطاء أنبوب سعة 50 milliliter، والذي يعد حاملًا مثاليًا للغرفة.

ضع حلقة من الشحم في الأخدود المحيط بالثقب الموجود في جانب الغرفة المشار إليها بـ top. تجنب استخدام الشحم بكميات زائدة لأنه سيتسرب إلى داخل الغرفة ويقلل من المساحة القابلة للملاحظة. باستخدام ملقط.

ثبت غطاء سحّي نظيف وغير مستخدم بطول 18 سنتيمتر على الجانب العلوي من الحجرة. اضغط برفق على حواف الغطاء السحّي لضمان إحكام الغلق داخل الأخدود الغائر في الحجرة. اقلب الحجرة وضع حلقة مماثلة من الشحم في الأخدود الموجود في الجانب المقابل أو السفلي من الحجرة.

انقل 750 µL من وسط التصوير إلى الحجرة. تُمثل هذه الكمية مقداراً زائداً، ولكن من المفترض أن يمنع الشحم تسرب الوسط إلى الخارج، كما أن الكمية الزائدة ستمنع انحباس الفقاعات عند وضع غطاء الشريحة الذي يحتوي على الخلايا. احتفظ بالحجرة المُجهزة في حاضنة زراعة الأنسجة حتى وقت الحاجة إليها.

يجب تجنب فترات الحضن الطويلة، مثل ساعة أو أكثر، لأن وسط التصوير سيتبخر وتتغير تركيبته. ولتجميع الغرفة النهائية من أجل التصوير الحي، انقل الغرفة المُجهزة وطبقاً من شرائح التغطية التي تم نقل الجينات إليها (transfected cover slips) من الحاضنة إلى غطاء تدفق الهواء الخاص بزراعة الأنسجة. وباستخدام ملاقط معقمة، قم بإزالة شريحة تغطية واحدة بعناية من طبق الشرائح المنقولة جينياً.

بعد ذلك، المس حافة غطاء الشريحة بمنديل من نوع kim wipe لسحب وسط النمو. ثم، ضع غطاء الشريحة بحيث يكون جانب العصبونات للأسفل فوق الحجرة المجهزة. المس أحد جانبي غطاء الشريحة بالشحم أولاً، ثم اضغط حول الحواف لجعل غطاء الشريحة مسطحاً دون حبس فقاعات هوائية.

من المتوقع أن يفيض وسط التصوير الزائد، لذا قم بمسح الكمية الزائدة، ولكن احذر من تحريك غطاء الشريحة من موضعه. انقل الحجرة إلى سخان المنصة المسخن مسبقاً وثبت الحجرة في مكانها. بعد ذلك، انقل الحجرة إلى المنصة لتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية.

قم بضبط المصباح إلى الحد الأدنى من الشدة اللازمة للعثور على الخلايا المنقولة. والآن ابحث عن الخلية المستهدفة. عند استخدام عدسة شيئية زيتية منخفضة التكبير مثل 40 x، من المفيد الالتزام بنمط بحث مخطط له لضمان أقصى تغطية لغطاء الشريحة وتجنب تكرار التقاط الصور.

بمجرد تحديد الحقل المطلوب، قم بتبديل القناة إلى البروتين المستهدف والموسوم فلورياً. انتقل إلى استخدام عدسة شيئية زيتية ذات تكبير عالٍ، مثل 60 إلى 100x، وأعد شدة المصباح إلى إعداد عالٍ. استخدم خاصية الاستحواذ التدفيقي (stream acquisition) أو وظيفة مماثلة في برنامج التصوير الخاص بك لتسجيل ديناميكيات البروتين الموسوم فلورياً للعضيات سريعة الحركة. يجب تقليل وقت التعرض والفترة الفاصلة بين التعريضات لإنتاج تسجيلات بمعدل إطارات مرتفع.

يمكن تصحيح الانزياح البؤري الملاحظ في المعاينة على الشاشة في الوقت الفعلي من خلال الضبط اليدوي للبؤرة. تأكد من التقاط صورة طورية وأي صور أخرى مصاحبة ضرورية للتحليل والعرض لاحقاً. احفظ جميع الصور قبل استكشاف غطاء الشريحة بشكل أكبر وإجراء التسجيل التالي.

عادةً ما يُعتبر الحصول على ثلاثة إلى خمسة تسجيلات من شريحة غطاء واحدة نجاحاً، ويتم تصوير شرائح الغطاء لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة لكل منها؛ ويجب مراعاة السمية الضوئية والحالة الصحية العامة للخلية، حيث تنخفض الناقلات في الخلايا المتضررة. تتكون ملاحظات تصوير الخلايا الحية عادةً من تسجيلات، تُعرف أيضاً باسم مجموعات الصور (stacks)، والتي تظهر حركة العضيات الملحقة بعلامات فلورية ضمن مجال الرؤية. إليكم مقطع فيديو تمثيلي لنقل الـ iCal ذات النواة الكثيفة.

تم عكس الألوان لتسهيل الملاحظة. لاحظ الجسيمات المتحركة. الرسوم البيانية من نوع CH هي صور توضح حركة الجسيمات من خلال تجاور المسوحات الخطية حيث تمثل كل نقطة زمنية عموداً في الرسم البياني.

يوضح هذا الشكل كيفية تمثيل جسيمين يتحركان في اتجاهين متعاكسين في رسم بياني لـ CH. ويمكن أن يوفر المزيد من التحليل للكرونوغراف معلومات حول سرعة تدفق الجسيمات، وعكس طول المسار، والجسيمات الساكنة. مرحباً، لقد عرضنا لكم للتو كيفية الحصول على تسجيلات عالية السرعة لنقل حويصلات dsco في عصبونات رأسية مستزرعة من فرس النهر.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تسخين جميع مكونات غرفة التصوير والمنصة مسبقاً لتقليل الإجهاد في الخلايا أثناء انتقالها من الحاضنة إلى المنصة. يجب عليك العمل بسرعة ولكن بدقة. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.