تصور لايف ذبابة الفاكهة الدبقية العصبية والعضلية ، تقاطع مع الأصباغ نيون

تبدأ هذه العملية بتحضير يرقة ذبابة الدروسوفيلا (drosophila) بحيث يتم قلبها للخارج لكشف سطح خلايا عضلات جدار الجسم والعصبونات الحركية المرتبطة بها وخلايا ggl، وذلك من خلال الجمع بين التلوين الفلوري للنهايات العصبية قبل التشابكية، والتعبير الداخلي لبروتيني GFP و DS red الموجهين إلى أغشية الخلايا الدبقية وخلايا العضلات بعد التشابكية، وتصور الحيز حول التشابكي. وباستخدام الأصباغ الفلورية، يمكن ملاحظة صورة واضحة للتغيرات الهيكلية التي تحدث في الوصلة العصبية العضلية الدبقية في تحضير حي. مرحباً، أنا دي برينك من مختبر فانيسيا لمرض التصلب الجانبي الضموري (ALS) في قسم علم الحيوان بجامعة كولومبيا البريطانية. سأعرض لكم اليوم طريقة تحضير الأنسجة وتقنيتين لوسم الخلايا لتصوير أنسجة يرقات ALS الحية باستخدام المجهر البؤري.

نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة الخلايا الدبقية عند التشابك العصبي العضلي. والآن، ننتقل إلى موضوع مختلف تماماً، حيث يبدأ تحضير الأنسجة من الداخل إلى الخارج بتحديد مرحلة اليرقات. سيتم توضيح هذا الإجراء على يرقات المرحلة الثالثة المتجولة لأنها كبيرة ويسهل تشريحها، لذا استخدم فقط يرقات W3 التي تزحف بنشاط.

بعد ذلك، قم بتنظيف سطح اليرقات باستخدام فرشاة رسم ناعمة جداً في طبق بتري يحتوي على ماء مقطر مرتين. يعد تنظيف اليرقات أمراً مهماً لأنه يؤدي إلى تحسين جودة البصريات كما يقلل من وجود البكتيريا. بعد تنظيف اليرقات، انقلها إلى طبق بتري صغير يحتوي على 3 mL من وسط HL six المبرد بالثلج مع 5 mM من الغلوتامات.

ضع الطبق على الثلج حتى يتوقف الحيوان عن الحركة ويسترخي، وهو ما يستغرق عادةً نحو دقيقتين. وبمجرد توقف اليرقة عن الحركة، يمكنك البدء في تشريح الأنسجة باستخدام مجهر التشريح، مع إمساك مقص الزنبرك في يدك المهيمنة وملقط ذو طرف دقيق للغاية. وباليد الأخرى، اصنع ثقباً صغيراً في جدار الجسم باستخدام المقص لموازنة الضغط عبر جدار الجسم، مع تثبيت الحيوان برفق في قاع الطبق.

باستخدام الملقط، يتم قطع القطاعين الخلفيين، ثم تُزال الأحشاء عن طريق التشريح. ومن المرجح أن تخرج بعض الأنسجة الدهنية من تجويف الجسم عبر الشق؛ لذا يجب قطع هذا النسيج وإزالته أيضًا.

استمر في تثبيت اليرقات برفق مقابل قاع الطبق باستخدام الملقط الدقيق. وباليد الأخرى، أمسك دبوس حشرات رقم صفر ذو طرف غير مدبب واضغطه مقابل أجزاء الفم في اليرقات. ادفع أجزاء الفم عبر تجويف الجسم كما لو كنت تقلب جوربًا على قبضة يدك.

يجب أن تبدو الأنسجة المقلوبة بهذا الشكل. باستخدام مقص التشريح الزنبركي فائق الدقة، قم بتشريح وإزالة الجسم الدهني والقصبات الهوائية من جدار الجسم. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الجسم الدهني.

احرص بشدة على عدم سحب القصبات الهوائية أو فصل الجهاز العصبي؛ لأن تمزق القصبات سيؤدي إلى إحداث ثقوب في عضلة جدار الجسم. عند الانتهاء من عملية التشريح، يجب أن تكون العضلة شفافة ومسترخية، وليست معتمة أو منقبضة.

إذا وضعت العضلة في محلول HL 6 الخالي من الجلوتامات في درجة حرارة الغرفة، فمن المرجح أن تنقبض بشكل إيقاعي. وبسبب نشاط مولدات الأنماط الحركية في الجهاز العصبي المركزي، يميل جدار الجسم السليم المقلوب (inside out) إلى الانطواء من المنتصف على طول الخطين المتوسطين الظهري والبطني. وبذلك، توفر العينة نصف حيوان أيسر أو أيمن للتصور البصري.

أخيرًا، قم بتثبيت النسيج على شريحة مجهرية باستخدام ترتيب غطاء الشريحة الجسري. سيتم عرض إجراءات تثبيت النسيج لاحقًا. لبدء وسم العصيات العصبية، اسحب بواسطة الماصة 30 µL من محلول الجسم المضاد الأولي المضاد لـ HRP والموسوم فلوريًا في HL six وضع قطرة منه في طبق بتري.

بعد ذلك، اغمر تحضير جدار الجسم المقلوب للداخل في حمام الصبغة. قد تلاحظ ظهور وسم النهايات العصبية بعد حوالي خمس دقائق، ولكن يجب التحضين لمدة تتراوح بين 10 إلى 20 دقيقة للحصول على وسم كامل وزاهٍ.

لشطف فائض وسم HRP، ضع النسيج في 0.5 mL من HL six لمدة تتراوح بين 10 إلى 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. يتم شطف الصبغة غير المرتبطة بسرعة، لذا لا يشترط أن تكون دورة الشطف طويلة أو قوية. أصبح النسيج المَوْسَم الآن جاهزاً للتثبيت والفحص بالمجهر.

يتمثل أحد التنوعات في بروتوكول وسم الأجسام المضادة الحية الذي تم عرضه للتو في استخدام ديكسترين مقترن بصبغة فلورية لإبراز المساحات خارج الخلوية المملوءة بالسوائل. لبدء هذا الإجراء، قم بتخفيف صبغة الديكسترين المقترنة بفلورية في HL six بتركيز 0.001 mg/mL. قد تحتاج إلى تغيير تركيز الديكسترين إذا لم تكن مهتماً بالتوقيت الدقيق لدخول الديكسترين إلى المساحة خارج الخلوية.

ضع قطرة بحجم 20 µL من الصبغة باستخدام الماصة على غطاء شريحة جسري، ثم انقل تحضير النسيج إلى حمام الصبغة. إذا كان النسيج المقلوب (inside out) لا يتطلب تروية أو إذا كان من الضروري الحفاظ على حجم HL six صغيراً، فيمكن تثبيته على شريحة مزدوجة الجسور. ابدأ بلصق غطائين مربعين للشريحة بحجم 18 مليمتر باستخدام الغراء السريع على شريحة مجهرية نظيفة جداً.

اترك فجوة بمقدار 2 mm بين حواف شرائح التغطية واجعل الفجوة في المركز، تقريباً في منتصف الشريحة. اترك الغراء ليجف تماماً، وإلا فسيشكل غشاءً فوق الوسائط المائية المحيطة بتحضير الأنسجة.

بعد ذلك، ضع قطرة بحجم 30 µL من محلول HL six في الفجوة الموجودة بين شرائح التغطية. ضع النسيج المقلوب داخل قطرة HL six. قد تحتاج إلى وضع النسيج بشكل قطري إذا كانت اليرقة كبيرة وكان نظام الحصول على الصور لديك يمتلك مصفوفة بكسل محدودة.

ضع كمية صغيرة من الفازلين على حواف شريحة غطاء ثالثة بقطر 18 مليمتر، ثم ضعها بحيث يكون الجانب المدهون للأسفل فوق شريحتي الغطاء الملتصقتين فوق النسيج، واضغط برفق. فيما يلي النتائج التي تم الحصول عليها من طريقتنا في الوسم الفلوري الحاد لتحضير اليرقة المقلوبة (inside out) باستخدام مجهر بؤري دوار القرص (spinning disc confocal microscope). الصورة الأولى عبارة عن صورة مكدسة بصرياً لمشبك عصبي دبقي عضلي مع نهايات Buton موسومة بـ anti HRP حية.

عند سطح الخلية العضلية، يمكننا رؤية نهايات عصبية من نوع "button" موسومة بوضوح، وملونة اصطناعياً باللون الأزرق. وفي منتصف مجموعة الصور المكدسة، نجد امتدادات دبقية موسومة بـ GFP تظهر باللون الأخضر، بالإضافة إلى "batons" موسومة بـ HRP باللون الأزرق. وبمحيط الـ "batons"، يمكننا رؤية مقاطع عرضية من الـ SSR الشبيهة بالجيوب، وهي الشبكات التشابكية تحت السطحية (synaptic reticula)، والتي تظهر باللون الأحمر أيضاً في منتصف المكدس، وفي الأجزاء العميقة من المكدس توجد الـ SSR الموسومة بـ DS red.

تُعدّ الـ SSR المناطق التشابكية المتخصصة في الخلية العضلية. وتستقر الـ bns داخل الجيوب الموجودة في الخلايا العضلية، وكذلك تفعل بعض أجزاء الامتدادات الدبقية الخضراء. تتداخل الامتدادات الخلوية الدبقية حول الـ BNS والـ SSR، ولكنها لا تغطي سطح التشابك كغطاء في أعمق طبقات المجموعة.

نلاحظ وجود استطالات دبقية خضراء وSSR باللون الأحمر، ولكن ليس بنفس عدد النهايات الزرية. يمكننا أيضاً العثور على مقاطع عرضية للعصب الحركي الذي يغذي العضلة. تلتف الخلايا الدبقية حول العصب الحركي، وبالتالي يظهر باللون الأخضر أيضاً.

تتمثل النتيجة الثانية للوسم الفلوري الحاد لتحضير اليرقة بنظام "الداخل إلى الخارج" في وسم المشبك العصبي بالدكسترين الفلوري. هنا، يتم وسم السائل الموجود في الحيز حول المشبكي أو الشق المشبكي باللون الأحمر. وفي الطبقات السطحية من صورة المكدس البصري، توجد طبقة سائلة من صبغة الدكسترين الحمراء، ويمكنكم رؤية أماكن تراكمها في المنخفضات المتموجة على الغشاء البلازمي للعضلة.

في الطبقات العميقة من المكدس، تسرب صبغ الديكسترين الفلوري إلى الشقوق التشابكية، حيث تتشكل حلقات صغيرة تشبه الدونات من صبغ الحوض بين النهايات العصبية وجيوب SSR المحددة باللون الأزرق. هذا هو الشق التشابكي الموضح بالصبغ. ولا تمنع الصفيحة الدبقية الخضراء تغلغل الصبغ في الشق في الطبقات العميقة من مكدس الصور.

تتمثل أبرز الميزات في المنطقة التشابكية أو الـ SSR للعضلة والمحددة باللون الأزرق، والامتدادات الدبقية المسطحة التي تظهر باللون الأخضر. وبالمثل، تظهر الغمد الدبقي حول المحاور العصبية غير الموصلة في الطبقات العميقة باللون الأخضر. ويبدو أن الغمد الدبقي يستبعد صبغة الديكسترين.

لقد عرضتُ لكم للتو طريقة مبتكرة لتصوير التشابك العصبي العضلي الدبقي في تحضير نسيجي مقلوب ليرقات drosophila. عند تحضير النسيج، من المهم تذكر السعي للتعامل مع النسيج برفق شديد، والتأكد من أن العضلة في حالة استرخاء وأن الأعصاب الطرفية غير تالفة. أود أن أختتم باقتباس من ماركس.

يمر الوقت بسرعة كالسهم. والذعر يطير كالموزة.