تشريح والتسجيل من مفرق العضلية جيم ايليجانس

توضع شريحة غطاء مغطاة بمادة سوغار (sogar)، تم تحضيرها عن طريق مسح قطرة من السوغار على الزجاج وتركها لتجف طوال الليل، في التجويف الدائري لغرفة التسجيل مسبقة الصنع وتُغطى بمحلول التسجيل. يتم وضع دودة في المركز ولصقها بسطح واقي العتبة بدءاً من الرأس أو الذيل، مع تطبيق الغراء على الجانب الظهري للدودة باستخدام ماصة غراء. وبمجرد اكتمال عملية اللصق، يتم إجراء شق بجوار الفرج عند الواجهة بين cuticle والغراء باستخدام إبرة زجاجية، ويتم تمديد الشق باتجاه الرأس بعد استخراج الأحشاء والبيوض من تجويف الجسم.

يتم لحام الحافة المقطوعة للشق بنقاط من الغراء إلى السوجار (sogar)، مما يكشف عن العصب البطني وعضلات جدار الجسم. يتم عمل تثبيت موضعي (patch clamp) للعضلة البطنية الإنسية الموجودة أمام الفرج، ويوضع قطب التحفيز في الجزء العلوي من الحبل العصبي. مرحباً، أنا جانيت ريتشموند، أستاذ مشارك في قسم العلوم البيولوجية بجامعة إلينوي شيكاغو.

سأعرض لكم اليوم تقنية تشريح تتيح لنا كشف الوصلات العصبية العضلية في ديدان البحر لغرض التسجيل الفيزيولوجي الكهربائي. نحن نستخدم هذا التحضير لدراسة النقل التشابكي.

حسناً، لنبدأ. قبل العمل مع النيماتودا، يجب تجهيز بعض الأدوات قبل يوم واحد على الأقل من الإجراء. تشمل هذه الأدوات غرفة تسجيل التشريح، وشريحة غطاء زجاجية مطلية بـ S guard، وماصات قديمة، وأداة وضع الغراء، وماصة استخراج.

ابدأ بتجهيز الغرفة. قم بقص لوح من البليكسي غلاس بسُمك 1/16 بوصة ليتناسب مع منصة المجهر. تُجرى التسجيلات في مركز لوح البليكسي غلاس.

احفر ثقباً دائرياً كبيراً بما يكفي لاستيعاب غراء زجاج غطاء دائري بقطر 22 مليمتر. ثبت زجاج غطاء بمقاس 48 في 60 مليمتر في الجانب السفلي من الغرفة أسفل الثقب باستخدام حبيبة من شمع تطمين الأنسجة البارافييني منخفض الانصهار في كل ركن من زجاج الغطاء. يُصهر الشمع بسرعة على لوح تسخين، مما يترك طبقة رقيقة من الشمع بين البلكسي جلاس وشريحة زجاج الغطاء بعد التبريد، ثم قم بقص أي شمع زائد باستخدام شفرة.

غطاء الشريحة الذي يناسب الغرفة هو زجاج غطاء مطلي بـ S guard وبقطر 22 مليمتر. ولكي يعمل sard، يجب تحضيره حديثاً وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وبمجرد تحضيره، توضع قطرة صغيرة من sard على كل زجاج غطاء وتُمسح باستخدام شفرة لإنشاء سطح مستوٍ.

توضع شرائح الغطاء المطلية بعد ذلك في حاويات مغطاة وتوضع في فرن درجة حرارته 65 degree Celsius طوال الليل حتى تتصلب. وستكون جاهزة غداً لعملية التشريح طوال البروتوكول. يتطلب الأمر ماصات من الزجاج السيليكاتي بقطر خارجي يبلغ 1 mm يتم سحبها لتكوين طرف تبلغ مقاومته حوالي 4 mega ohm، لذا يفضل الاحتفاظ بوعاء جاهز لها.

راجع منشور JoVE حول صنع الرقع والمصات والأقطاب الحادة باستخدام قطب قابل للبرمجة من إعداد ميريام جودمان. ومن أجل التفاصيل التقنية لإجراء الفيزيولوجيا الكهربائية، يجب تثبيت الدودة الخيطية في مكانها باستخدام الغراء. ولهذا الغرض، يلزم وجود أداة تطبيق الغراء.

تتمثل أداة وضع الغراء ببساطة في أنبوب بلاستيكي بطول 2 mm وبقطر داخلي قدره 1 mm. يتم تثبيت أحد طرفي الأنبوب في الفم، ويمكن تجهيزه بقطعة فموية، بينما يحمل الطرف الآخر من الأنبوب ماصة بحجم 1 mm ممتلئة بالغراء.

تُستخدم أيضاً ماصة استخلاص متخصصة أثناء عملية التشريح. وتتكون هذه الماصة من أنبوب وماصة تماماً مثل أداة وضع الغراء، باستثناء أن طرف الماصة مكسور قليلاً إلى الخلف لاستيعاب البيوض والأحشاء. ابدأ برسم خط شمعي على طول محيط الغرفة.

الآن، اضغط وضع شريحة غطاء مغلفة بـ Sylgard بحيث يكون وجه Sylgard للأعلى. يعمل خط الشمع على تثبيت شريحة الغطاء ويمنع تسرب محلول التسجيل تحتها وإزاحتها أثناء عملية التشريح والتسجيل. بعد ذلك، يتم ملء الحجرة بمحلول التسجيل خارج الخلوي. راجع النص المصاحب لمعرفة التركيبة مع تجهيز الحجرة.

استخدم ملقط الديدورات الخيطية لنقل عدة ديدورات خيطية إلى المحلول. ومع الممارسة، يمكن تثبيت الديدورات السابحة باستخدام الغراء دون الحاجة إلى أي إجراءات إضافية لمنع الحركة. املأ حاوية غراء مُصنعة من غطاء أنبوب PCR مثبت في شمع أو صلصال تشكيل بمحلول جاهز من غراء Sano الأكريليكي للبدء في عملية التثبيت.

أكمل بناء أداة وضع الغراء عن طريق تثبيت ماصة التسجيل في نهاية أداة وضع الغراء. ثم، وباستخدام مجهر التشريح، املأ أداة وضع الغراء عن طريق الشفط بالفم. إن لصق الغراء على الديدان الخيطية (nematode) أمر صعب ويتطلب التدريب لأن الغراء يتبلمر بمجرد ملامسته لمحلول التسجيل خارج الخلوي.

ولمعالجة هذه المشكلة، حافظ على تدفق مستمر للخارج من الغراء، وإلا فإنه سيتصلب ويؤدي إلى انسداد الماصة. وفي حال انسداد الماصة، يمكن أحياناً تسليكها عن طريق النقر برفق بطرف الماصة على غطاء الشريحة. تدرب على العمل باستخدام الغراء.

وعندما تتمكن من كتابة اسمك بالغراء على واقي السيليكون، فمن المرجح أنك أصبحت مستعداً لتثبيت بشرة النيماتودا باستخدام الغراء. أولاً، اختر واحدة بالقرب من مركز الحجرة حيث تتوفر مساحة للعمل. ثانياً، ضع كمية صغيرة من الغراء على رأس النيماتودا أو ذيلها، ثم اسحب النيماتودا بسرعة نحو سطح واقي السيليكون.

ثم ضع تياراً من الغراء على طول الحافة الظهرية لجليدة النيماتودا. يؤدي ذلك إلى إجبار النيماتودا على اتخاذ وضعية C بحيث تكون الفرج مواجهة للداخل. يجب ملء أي فراغات في خط الغراء هذا لضمان أقصى درجة من الالتصاق بين النيماتودا والـ syl guard.

تعد هذه العملية دقيقة، وقد يكون من المفيد التدرب عليها باستخدام طفرات ذات حركية منخفضة. كما يظهر في 31، يوجد بصلة هناك مباشرة جهة اليمين. سأقوم الآن بتحريك هذه العينة بشكل دائري، ثم سأقوم بإدخال الإبرة الزجاجية والبدء في إجراء الشق. ولإجراء شق في الطبقة الخارجية (cuticle)، انتقل إلى استخدام ماصة تشريح يدوية.

يجب أن تكون هذه الماصة أكثر حدة من الماصات المستخدمة في تسجيل الغراء، وأن تمتلك ساقاً قصيرة ومتينة لاستخدامها مع أعلى تكبير. تحت مجهر التشريح، قم بمحاذاة الماصة بشكل موازٍ للمحور الطولي للديدان الخيطية، ثم أدخل الطرف بالقرب من الفرج عند الواجهة البينية لغراء القشيرة. يؤدي هذا الشق إلى تحرير الضغط الهيدروستاتيكي للديدان الخيطية، مما يدفع البيوض والأمعاء للخروج عبر نقطة الشق.

استمر في قطع القشيرة باتجاه رأس الخيطيات بحركة تقطيع تشبه فتح الرسالة حتى تصل إلى البلعوم. انتقل الآن إلى ماصة الاستخراج لشفط الأعضاء الداخلية للخيطيات. بعد تنظيف الشق، ستتحفظ القشيرة المفتوحة على شكلها الأسطواني.

بعد ذلك، أحضر ماصة لصق جديدة. استخدمها لتثبيت cuticle عند حافة الشق على سطح syl guard بنقاط لحام دقيقة. من المهم استخدام الحد الأدنى من نقاط اللصق في هذه المرحلة لتجنب إتلاف أو حجب njs.

أصبح الحبل العصبي البطني وعضلات جدار الجسم مكشوفين الآن، ولكن لا تزال هناك حاجة لإزالة الغشاء القاعدي الذي يغطي الوصل العضلي العصبي (NMJ). وللقيام بذلك، يتم سحب محلول التسجيل خارج الخلوي من الحجرة وإضافة محلول تسجيل خارج خلوي يحتوي على collagenase بتركيز 0.4 mg/mL. وبعد مرور 10 إلى 20 ثانية، يُزال الـ collagenase وتُغسل العينة عدة مرات بمحلول تسجيل جديد.

أصبحت الديدان الخيطية الآن جاهزة للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية. عند موضع الوصلة العصبية العضلية (NMJ)، استخدم عدسة شيئية بقوة 10 مرات في غرفة التسجيل الموجودة على منصة مجهر رأسي لتوسيط الدودة الخيطية، ثم انتقل إلى عدسة شيئية غمر مائي بقوة 40 مرة مع بصريات تباين التداخل التفاضلي (DIC) وتحقق من سلامة عضلات جدار الجسم والحبل العصبي. ضع الدودة الخيطية في وضع أفقي بحيث يمكن إدخال الأقطاب الكهربائية من كلا الجانبين الأيمن والأيسر.

عادةً ما نقوم بتثبيت الرقعة على الجزء البطني الإنسي من الجسم بينما تكون العضلات داخل الفرج، ولكن يمكن تثبيت الرقعة بسهولة على العضلات الموجودة في كل من الجانبين الظهري والبطني للدودة، مع وجود عدد قليل من العصبونات التي تبدو كأنها نصف دائرة ملاصقة للعضلة. الآن، قم بتثبيت الرقعة على العضلة باستخدام تقنيات تثبيت الرقعة القياسية (patch clamping) للحصول على ختم جيجا (gig seal). وبناءً على خبرتنا، فإن أقطاب التسجيل التي تبلغ مقاومتها حوالي 4 megas تعمل بشكل جيد في وضع تسجيل تثبيت الجهد للخلية الكاملة (whole cell voltage clamp).

قم بزيادة قوة الشفط وصعق الغشاء حتى يتم تمزيق ختم الغيغو (gigo seal). لقد تحدثنا عن ضرورة وجود مقاومة تبلغ 4 ميجا. لذا، إذا نظرت إلى ذلك هناك، نعم، تظهر القيمة 4.9 ميجا.

إنها أكبر، وهذا طبيعي. إنها ضمن النطاق الذي نستخدمه. حسناً. أجل. الآن سنحاول التوسع في، ماذا بعد؟

ماذا؟ نريد أن ينزل ذلك إلى الأسفل تماماً. نعم. فهمت. رائع.

في تسجيل جيد، عادة ما تمتلك عضلات جدار الجسم في الديدان الخيطية البالغة من النوع البري سعة غشائية خلوي تبلغ حوالي 70 picofarad، ويمكن تسجيلها بشكل مستقر لمدة 10 دقائق على الأقل عند جهد تثبيت يبلغ negative 60 millivolts مع حد أدنى من تيارات التثبيت، حوالي 50 pico amps. وبمجرد تثبيت خلية عضلية (patched)، فإن التحفيز من قطب كهربائي ثانٍ، أو القنوات التي يتم تنشيطها بالضوء، أو Rhodopsin، أو إضافة محلول عالي التوتر، كل ذلك سيولد استجابات قابلة للقياس. لاستحثاث استجابة مستحثة كهربائياً، نقوم عادةً بوضع قطب تحفيز يحتوي على محلول خارج خلوي على الحبل العصبي البطني داخل العضلة المثبتة.

يتطلب تكوين الرقعة الفضفاضة هذه نبضات تتراوح مدتها من واحد إلى اثنين من الملي ثانية بتيار يتراوح بين 10 و 40 فولت. ولسوء الحظ، بعد بضع استجابات مستحثة، يتضرر الحبل العصبي بشكل غير قابل للإصلاح، ولسبب غير معروف، لا يمكن استحثاث سوى الاستجابات المستحثة الكولينية باستخدام هذا التكوين. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام الديدان الخيطية التي تعبر عن قناة منشطة بالضوء حيث يكون transgene dosin في مجموعات عصبونية مختلفة لاستحثاث الإطلاق.

كتمهيد لهذه الطريقة، يجب مراعاة ضرورة تربية النيماتودا المستخدمة في هذا التطبيق على بكتيريا مضاف إليها الريتينول. وفي هذا التحضير، يُستخدم صمام ثنائي باعث للضوء (LED) عالي القدرة بطول موجي 470 نانومتر ومُرشح عبر مرشح استثارة GFP يتراوح بين 450 إلى 490 نانومتر لتنشيط التشانون أوبسين (channel opsin) بشكل متكرر، مما يؤدي إلى إطلاق مستحث لناقلات عصبية مختلفة بناءً على أنواع الخلايا التي تعبر عن هذا التشانون. ويمكن استخدام التقنية الأخيرة التي تمت مراجعتها لقياس حجم المجمع الجاهز للتحرر (readily releasable pool) من الحويصلات التشابكية من عدة عصبونات إلى العضلة المسجلة.

يتم تحقيق ذلك عن طريق تسليط نبضات ضغط من محلول خارج خلوي مفرط التوتر على العضلة المرقعة لمدة تتراوح من ثانية واحدة إلى ثلاث ثوانٍ. ستكون النتيجة عبارة عن وابل من الأحداث بعد المشبكية غير المتزامنة. وتظهر تسجيلات تثبيت الجهد للخلية الكاملة لعضلات جدار الجسم لكل من بروتوكولات التحفيز الثلاثة الموضحة أعلاه: الاستجابات المستثارة كهربائياً، والمستثارة ضوئياً، والمفرطة التوتر.

في جميع الحالات، يتم تثبيت جهد عضلة الجدار الجسمي البطني الإنسي عند 60- مللي فولت. عادةً ما تُظهر خلايا العضلات من النوع البري معدلات عالية من التيارات المشبكية المصغرة الداخلية المنشأ. وفي محاليل التسجيل القياسية لدينا، يؤدي إزالة استقطاب الحبل العصبي البطني الأمامي لمدة ملي ثانية واحدة إلى تحرير متزامن من عدة مشابك عصبية، مما ينتج عنه استجابة مستحثة كبيرة تبلغ حوالي 2 إلى 2.5 نانو أمبير.

في الديدان من النوع البري، تُظهر الآثار التمثيلية الموجودة على يمين آثار النوع البري في A وB تحرراً مشبكياً في طفرة تعاني من عدم تنسيق شديد في اللوحة C، بينما تُظهر اللوحة C استجابة مستحثة بالضوء من الوصلة العصبية العضلية لدودة من النوع البري تعبر عن channel red dosin. في العصبونات الكولينية، عادة ما ينتج نبض ضوئي مدته 2 millisecond استجابة تتراوح من 1.5 إلى 1.8 nano amps. يؤدي القذف بالضغط لـ 850 Milli osmo من المحلول الملحي مفرط التوتر على العضلة لمدة ثانية واحدة إلى وابل غير متزامن من التيارات المشبكية المصغرة التي تمثل مجمع الحويصلات الجاهزة للتحرر.

لقد عرضتُ لكم للتو تقنية التشريح التي نستخدمها للكشف عن الوصلات العصبية العضلية في حيوان sea elegance وإجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية. من المهم تذكر أن هذه التقنية صعبة، ومن المرجح أن يستغرق إتقانها عدة أشهر. ومع ذلك، بمجرد اكتسابها، ستصبح مهارة تلقائية وسهلة التنفيذ.

ستبقى هذه التقنيات معك، وكلما مارستها أكثر، أصبح التحضير أسرع وأكثر موثوقية. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.