المستضد CD4 + تصور معين باستخدام خلايا T MHC الدرجة الثانية Tetramers

ما يميز اختبار تير هو أنه يسمح لك برؤية الخلايا التائية الخاصة بالمستضدات مباشرة. التي، التيير، هو الجانب الفريد الرئيسي في اختبارنا. وهذا يقترن بخطوة تضخيم نقوم بها.

نحن نعزل الخلايا التائية ثم نزرعها في بيئة تثري العينة للخلايا التائية التي نهتم بها. ثم يمكننا وضع علامات محددة على تلك الخلايا وتصورها على جهاز قياس تدفق السلوك. ومع الاختبارات السابقة، مثل اختبارات CSFE أو اختبارات التكاثر التي استمرت لعقود، ما تحصل عليه هو مجرد قياسات عامة لما يحدث مع جميع سكان الخلايا التائية.

لكن لديك ملايين الخلايا التائية في الجسم وترى مجموعة متنوعة من الأنماط. إذا كنت محظوظا، ربما واحدة من كل اثنين إلى 300,000 من خلايا العينة ستكون هي التي تنظر إليها. ولهذا السبب يقوم هذا الاختبار بخطوات الإثراء.

ثم مع رقم اختبار، وبما أنك تصبغ مباشرة، يمكنك فعليا تصور مجموعة سكانية أقل من 1٪ من إجمالي عدد الخلايا. لذا يمكنك رؤية فروقات صغيرة جدا جدا ويمكنك الحصول على عدد دقيق إلى حد ما لعدد خلايا T الموجودة في عينة الدم، والتي تتعرف على نمط اهتمامك. لكن الأمر لا يتوقف عند هذا الحد، لأن التيتر يسمح لك أيضا ليس فقط بوضع علامات على تلك الخلايا التائية، بل عزلها لمزيد من التحليل.

والتيتر التي تستخدمها مصنوعة هنا في الحزام والطريق، أليس كذلك؟ نعم. نحن واحد من عدد قليل جدا من المختبرات في البلاد التي نجحت في تحقيق اختبارات من الدرجة الثانية. هدفنا هو توزيع هذه المواد الكيميائية بتكلفة على أي مختبرات مهتمة باستيراد هذه التقنية.

ما هي أصعب أو أصعب الجوانب في هذا الاختبار عندما يتعلق الأمر بتكراره في مختبرات أخرى؟ حسنا، عندما أفكر في الأمر، هناك فعلا اثنتان، نمو الخلايا التائية. إنه شيء يشبه الفن حقا.

لديك قرارات شبه يومية فيما إذا كانت الخلايا تحتاج إلى مغذيات إضافية أو مساحة إضافية للنمو. والجزء الثاني الذي أعتقد أنه الأصعب على مشغل غير متمرس هو في الواقع تحليل البيانات. نوعا ما معرفة أي جزء من الإشارة هو استجابة إيجابية حقا وأي جزء متأصل في الفيزياء والجذب.

وحقيقة أن كل شيء فيه درجة من التصاق هي أمر يتطلب الكثير من الخبرة، خاصة في السياق حيث يكون الاستجابة العامة ضعيفا بعض الشيء. كيف يمكن للمعلومات التي ستولدها هذا الاختبار أن تفيد المرضى في الوقت الحالي؟ واحدة من أولى العلامات التي تظهر لدى أي مريض مناعي ذاتي هي نوع من مجموعة الأجسام المضادة الخاصة بذلك المرض.

نعلم من الأساسيات الأساسية لعلم المناعة أنه أينما كان هناك استجابة للأجسام المضادة، يكون هناك دائما استجابة خلايا T أولا. لذا إذا استطعنا النظر في الأفراد المعرضين للخطر ورؤية القفزة في نشاط الخلايا التائية التي تسبق تكوين الأجسام المضادة، فسيساعدنا ذلك في تحديد مستوى جديد من المخاطر أو أن الأفراد يتجهون نحو امتلاك أجسام مضادة ذاتية، مما يأمل أن يفتح نافذة للعلاجات الوقائية. يقوم هذا الإجراء بتنقية وتوسيع خلايا T الإيجابية الخاصة ب CD 4 الخاصة بالمستضد وبصرها باستخدام كواشف التيتر وأجهزة التدفق الطبقي من الفئة الثانية للسلامة البيولوجية.

سيكون هذا هو مساحة العمل الأساسية للإجراء. أنبوب مخروطي 50 مليليتر لعزل PBMC واحد XPBS. يجب أن تكون هذه عبوة فول خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم مع ورق الألمنيوم للحماية من عبوات بايبت CoStar 10 ميل ذات الأسطوانات الخفيفة مع إدخالات 50 ميل لمنع تلوث الدم في الطرد المركزي.

ماصات GS ستة من طرد المركزي R، وماصات باستور تحتوي على 8.3 جرام لكل لتر. كلوريد الأمونيوم 1.0 جرام لكل لتر. بيكربونات الصوديوم 0.04 جرام لكل لتر DI الصوديوم EDTA تريان بلو 0.2٪ محلول في PBS هيمو CYTOMETER أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على PBS مع مكمل بملليمولر EDTA بالإضافة إلى خمسة جرامات لكل لتر.

مجموعة العزل BSA max CD 4 رقم اثنين تم شراؤها من Milin Biotech EP Magnet Block تم شراؤها من تقنيات الخلايا الجذعية. يمكن استخدام منصات أخرى لإثراء الخلايا المغناطيسية بنفس الفعالية. أنبوب بولي بروبيلين بسعة خمسة مليليترات RPMI 1640 مدعوم بمصل بشري بوزن 25 ملليمولر يستخدم لصنع خلية T وسط مصل بشري مجمع يستخدم كمكمل لشريط القلم المتوسط لخلايا T المتوسطة 500 ملليلتر لتربيع زجاجة معقمة بحجم 0.22 ميكرون و48 بئر تستخدم لزراعة التمدد في المختبر، حاضنة ثاني أكسيد الكربون بدرجة 37 درجة، محلول 20 ملليغرام لكل ملليلتر من الببتيد الصناعي يحتوي على الحوابيت محل الاهتمام.

تستخدم أجسام مضادة من أنابيب البوليسترين محمولة بببتيد من الفئة الثانية بسعة خمسة مليليتر لرؤية خلايا T الخاصة بالمستضد، وأجسام مضادة لقرص CD 3، ومضادة للCD 4، ومضادة ل CD 25 تستخدم لتغطية خلايا T الخاصة بالمستضد. استخدم جهاز قياس تدفق أو ما يعادله بالفاكس قبل بدء الإجراء. قم بتجميع جميع المواد والمعدات في مكان عملك.

العرض التالي سيغطي الخطوات التالية. عزل PBMC، CD 4 إيجابي لفصل خلايا T في الزراعة التوسعية المختبرية يتصور خلايا T عن طريق التييم أو التلوين. الخطوة الأولى في عزل PBMC.

احصل على عينة دم. يجب جمع الدم في حقن أو أنابيب دم ومضاد تخثر بالهيبارين بنسبة 1 إلى 50 لمنع التجلط، مع توقع إنتاج حوالي 1 مليون PBMC لكل ملليلتر من الدم. حوالي 40٪ منها ستكون خلايا T إيجابية في CD4.

أليكوت الدم في أنابيب مخروطية بحجم 50 ملليلتر. 25 ملليلتر من الدم في كل أنبوب. اخلط الدم بلطف قبل تجلط ALI لتوزيع البلازما.

أضف PBS ليصل الحجم الكلي إلى 40 ملليلتر وقم بتجفيف 11 ملليلتر من الماصة اليدوية التي تدخل في أنبوب الدم وإزالة الماصة المساعدة بعناية من الماصة. الفيال سيصرف الماء ببطء إلى أسفل الأنبوب. بمجرد أن يتساوي المستوى، قم بإزالة الماصة تدريجيا من أنبوب الدم وتخلص من غطاء أنابيب الدم وتحرك إلى رذاذ العبوات.

أغلق العبوات وجهاز الطرد المركزي بقوة عند 900 ضعف G لمدة 20 دقيقة بدون انقطاع. من الضروري ألا يتم تطبيق أي كسر في نهاية هذا الدوران لأن قوة الكسر ستزعج طبقة الخلايا بعد الدوران. يجب أن يشكل ال PBMC طبقة بيضاء مميزة بين البلازما الصفراء أعلاه والخيط الشفاف أدناه.

قم بإزالة طبقة خلايا الدم البيضاء بلطف باستخدام ماصة نقل وانقله إلى أنبوب جديد. قد يتم رسم بعض البلازما والفيال مع PBMC، لكن تجنب رسم أي جزء من طبقة خلايا الدم الحمراء. عادة يمكن دمج أنبوبين دم في أنبوب خلوي واحد في هذه الخطوة.

لزيادة حجم الحبيبات، أضف PBS ليصل الحجم الكلي إلى 15 ملليتر، والطرد المركزي عند 500 مرة في الجاذبية لمدة 15 دقيقة على الانفصال المنخفض، وباستخدام أنبوب معجون باستخدام ماصنة معجون، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. عالج بمحلول انحلال الدم بإضافة خمسة إلى ستة ملليتر لكل أنبوب وخلطه بلطف لإزالة التكتلات. حضانه لمدة لا تزيد عن خمس دقائق.

أضف PBS ليصل الحجم الكلي إلى 50 مليلتر والطرد المركزي عند 230 ضعف G لمدة 10 دقائق. في الانكسار المنخفض، لم تعد هناك حاجة إلى عبوات رذاذ لهذه الدورانات البطيئة. اغسل سائل السحب مرتين باستخدام أنبوب مائي مملوء بأنابيب PBS وجهاز طرد مركزي عند 230 ضعف G لمدة 10 دقائق قبل خطوة الغسيل النهائية، ثم أزل كمية من الخلايا المعلقة، ثم خففها باستخدام الأزرق الثلاثي والعد باستخدام جهاز قياس الهيمو.

هذا العدد من الخلايا سيحدد حجم المواد المستخدمة في فصل الخلايا التائية. الخطوة الثانية، الفصل الإيجابي لخلايا T في القرص الرابع، استنشاق السائل وإضافة المخزن الجاري لرفع الحجم الكلي إلى 40 ميكرولتر لكل 10 ملايين خلية. عادة ما يتطلب ذلك 30 ميكرولتر من المخزن بالإضافة إلى حجم الحبيبات المتبقي.

انقل هذا الحجم إلى أنبوب مخروطي بسعة 15 مليليتر. أضف كوكتيل الأجسام المضادة من مجموعة العزل الأربعة في قرص CD، 10 ميكرولتر لكل أنبوب غطاء لعشرة ملايين خلية، وضعه على الثلج لمدة 10 دقائق. أزل الأنبوب من الثلج، أزل الغطاء وأضف 30 ميكرولتر من المخزن الجاري لكل 10 ملايين خلية.

أضف خرز مغناطيسي من مجموعة العزل CD 4. 20 ميكرولتر لكل 10 ملايين خلية تغلق أنبوب الغطاء وتوضع على الثلج لمدة 15 دقيقة. أضف 10 أحجام من المخزن الكهربائي للغسل والطرد المركزي عند 230 ضعف الجاذبية لمدة 10 دقائق.

أثناء الدوران، قم بتركيب المغناطيس وأنبوب بولي بروبيلين سعة خمسة مليليتر في مكان عملك. استنشاق السائل من حبيبات الخلايا. أضف ميليلترين من المخزن الجاري وأزل الكتل باستخدام ماصنة النقل.

باستخدام نفس الماصة الناقلة، يتم نقل خلايا النقل في أنبوب الخمسة مليليتر وتحتضن في المغناطيس لمدة 15 دقيقة. قم بفرغ جزء خلايا T الموجبة بأربعة أقراص CD بعناية في أنبوب محدد بحجم 15 ميل عن طريق عكس المغناطيس وتفريغ كل القطرة ما عدا الأخيرة. أضف ملليترين آخرين من المخزن الجاري إلى أنبوب الخمسة ملليتر وأزيله من المغناطيس.

اغسل بلطف خلايا CD السالبة الأربع من جوانب الأنبوب وانقل إلى أنبوب محدد بحجم 15 مل. أضف ميلي لتر من وسط خلية T إلى كل أنبوب. قم بإزالة الأليكوات لعد الخلايا وطرد مركزي عند 230 مضروب في G لمدة 10 دقائق.

قم بتخفيف النقاط الخلوية باستخدام اللون الأزرق الثلاثي والعد باستخدام جهاز قياس الخلايا الهيمو. ستحدد هذه القيم عدد الآبار المستخدمة في زراعة التوسع. الخطوة الثالثة.

في الصناعة، تستنشق السائل من قرص CD أربع حبيبات خلوية موجبة وCD 4 سلبية بناء على عدد الخلايا. أضف الوسائط إلى القرص المضغوط أربع خلايا موجبة لضبط الحجم إلى 3 ملايين خلية لكل ميل. أضف الوسائط إلى القرص المدمج أربع خلايا سالبة لضبط الحجم إلى 10 ملايين خلية لكل ميل.

تتطلب زراعة التمدد 3 ملايين خلايا CD وأربع خلايا سالبة لكل بئر، واثنين إلى ثلاثة ملايين خلايا CD أربع خلايا إيجابية لكل بئر. عادة، تكون الخلايا الموجبة في CD 4 هي المجموعة المحصنة. أليكووت CD أربع خلايا سالبة في عدد مناسب من الآبار على لوحة بئر 48.

بإضافة 300 ميكرولتر لكل منها، ضع اللوحة في حاضنة بزاوية 37 درجة لمدة ساعة واحدة. أزل اللوحة، الحاضنة، اغسل الآبار بإضافة 500 ميكرولتر من الوسائط الطازجة ووضع الأنابيب بلطف للأعلى والأسفل من 12 إلى 20 مرة باستخدام ماصة نقل وإزالة كل السائل. هذا الغسيل سيترك طبقة من الخلايا الملتصقة بالمستضدات المقدمة.

عند الانتهاء من الغسيل، أضف كمية كافية فقط من الوسائط لترطيب قاع كل منهما، حوالي 100 ميكرولتر. وإلا ستجف خلايا الالتصاق A. أضف من اثنين إلى ثلاثة ملايين خلايا موجبة CD وأربع خلايا إيجابية لكل بئر إذا لزم الأمر.

أضف وسائط إضافية لرفع الحجم الكلي في كل بئر إلى ميلي لتر واحد. أضف الببتيد المطلوب لكل منها. حسنا. التركيز المعتاد للتحفيز هو 10 ميكروغرام لكل ملليلتر.

اللوحة النهائية في حاضنة بدرجة 37 درجة لمدة سبعة أيام. بعد سبعة أيام. أضف 50 ميكرولتر من هيمو إيل، اثنين لكل بئر في كل يوم لاحق.

راقب نمو الخلايا باستخدام المجهر لتغذية الآبار التي لم تتلاغم بعد، وذلك بإزالة نصف الوسط، وإضافة وسط جديد و50 ميكرولتر من IL، وهما بئران متقاطعتان منفصلتان عن طريق تعليق الخلايا بنقل نصف الخلايا إلى بئر فارغ. إضافة وسائط جديدة و50 ميكرولتر من IL يعيدون خلايا IL إلى الحاضنة. ستكون الخلايا المتوسعة جاهزة للتلوين بعد 13 إلى 15 يوما من الزراعة.

الخطوة الرابعة، تصور خلايا T عن طريق التلوين السطحي، شراء أو تجميع التيترات لتتناسب مع الببتيد. تركيبات MHC المستخدمة لتحفيز الخلايا التائية الإيجابية في CD الأربع المعتادة. أزل الطبق من الحاضنة.

استبعد بعناية نصف وسائل الإعلام من كل منها. حسنا، نقل مجموعة من الخلايا من كل بئر، عادة 75 ميكرولتر أو حوالي 50,000 خلية إلى أنبوب فاكس بوليسترين سعة خمسة مليليتر، عادة ميكرولتر واحد لكل 50 ميكرولتر من الحجم الإجمالي وضعه في حاضنة بزاوية 37 درجة لمدة ساعة واحدة. كما ينصح بصبغ أليكوت ثان لكل بئر بتيير غير متطابق كخلايا تحكم سالبة مع أجسام مضادة للCD 3، ومضادة CD 4، ومضادة CD 25.

يمكن استخدام علامات أجسام مضادة إضافية أو بديلة. ومع ذلك، لا تستخدم الأجسام المضادة الموسومة ب PE لأن هذه القناة يجب أن تكون مخصصة للضخام في الوقت الحالي. أيضا، ضع علامات على أي لون أو عناصر تحكم متشابهة باستخدام خلايا إضافية.

حضن الخلايا الموسومة بالأجسام المضادة لمدة 15 إلى 30 دقيقة عند أربع درجات. اغسل كل أنبوب بمحلول تشغيل من 0.5 إلى ملليلتر واحد من المخزن الكهربائي والطرد المركزي عند 230 ضعف الجرام لمدة 10 دقائق. قم بإخراج السائل بعناية من أنابيب الفاكس، معايرة مقياس تدفق الخلايا باستخدام خرز مرجعي، أنابيب تحكم بلون واحد، أدوات تحكم بالنظير، وما إلى ذلك.

حلل كل أنبوب باستخدام مقياس تدفق السيل. يجب أن تكون الخلايا الموجبة التيترا مجموعة مميزة بين الخلايا التائية الموجبة الممتدة للCD 4. عادة ما تكون خلايا التترا الموجبة موجبة CD 25 وغالبا ما تكون CD 4 مرتفعة.