Name: الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 1 (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: تعلم إجراء العدوى الزمنية بفيروس Vaccinia في خلايا HeLa واستخراج RNA لتحليل التعبير الجيني. يوفر هذا البروتوكول تقنية موثوقة لدراسة تفاعلات الفيروس والمضيف.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

معهد وايتهيد زملاء صناديق

الجزء 1 : إعداد العدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو خلايا هيلا في قوارير وانتظر حتى الخلايا ما يقرب من 80 ٪ متموجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد يكفي الفيروسية متوسطة النمو للتجربة : DMEM منتظمة مع FBS 2 ٪ وليس المضادات الحيوية المضافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يمكن أن يؤديها للعدوى مع الأسهم إما الخام من فيروس الوقس مع عيار المعروفة ، أو السكروز النقي مع الفيروس المعروف عيار إذا كنت قلقا بشأن التعبير الجيني المضيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كنت تستخدم الفيروسات السكروز النقي ، انتقل مباشرة إلى الجزء 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كنت تستخدم فيروس الوقس الخام المخزون ، قبل العدوى ، an قسامة يصوتن للفيروس في sonicator الكأس مع حمام من الثلج في معظمها ، والقليل من الماء. <ul style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن في حوالي 30W لمدة 20 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة أنبوب وكرر صوتنة 3 مرات ، إضافة المزيد من الجليد عند الحاجة للحفاظ على الكأس مملوءة الجليد ومبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في دوامة بين كل خطوة صوتنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الجزء 2. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك ، إذا كنت لا تملك sonicator الكأس ، مزيج حجم مساو للمخزون الخام وفيروس التربسين 0.25mg/mL. <ul style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة بقوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الفيروس الأسهم / التربسين المزيج في بالحمام المائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدوامة على فترات 5-10 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الجزء 2. </li></ul></li></ol> الجزء 2 : اصابة الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب كمية من الجسيمات الفيروسية اللازمة لتصيب المونولاير على تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية). عادة ، يتم استخدام أعلى مستوى وزارة الداخلية (بين 5 و 10) لtimecourses العدوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المبلغ المطلوب من فيروس السكروز النقي أو فيروس trypsinized الخام إلى 37 درجة مئوية وسائط النمو الفيروسي وتخلط جيدا. يجب استخدام وسائل الإعلام بما يكفي لتغطية الجزء السفلي فقط من القارورة. على سبيل المثال ، 10 مل من وسائل الاعلام عن قارورة T - 175. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام من الخلايا وشطف مع درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة للفيروس / وسائط النمو الفيروسي إلى كل القارورة. <ul style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة بلطف ، لوحات مغطاة واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5 ٪ لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإمالة ودوامة لوحات كل 15 دقيقة لانتشار الفيروس بشكل موحد والحفاظ على الخلايا رطبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنقطة 0hr/Mock الوقت ، إضافة سائط النمو الفيروسي فقط ، مع عدم وجود الفيروس المضافة. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة 1 ساعة ، وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس ، وشطف ثلاث مرات مع درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة أكبر قدر ممكن من النمو الفيروسي المتوسطة إلى كل القارورة. على سبيل المثال ، 30 مل من وسائل الاعلام عن قارورة T - 175. بدء العد ل ك 0 نقطة زمنية ساعة. </li></ol> الجزء 3 : حصاد الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الخلايا تحت المجهر ونلاحظ أي تأثير الاعتلال الخلوي (CPE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام وشطف الخلايا مع 30 مل من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 مل من التربسين إلى الخلايا واحتضان ل5min - 2 في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختيار تحت المجهر لخلايا المفرزة والاستفادة من القارورة بلطف لإزاحة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا مع ماصة معقمة a المصلية في أنبوب مخروطي 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل القارورة مع حجم مساو من وسائل الاعلام نمو الخلايا ، وإضافة وسائل الإعلام إلى الخلايا trypsinized في أنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في الخلايا ز × 300 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة التربسين / وسائل الإعلام من بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية خلية في أي كاشف TRIzol العازلة أو تحلل من العزلة التي تريدها مجموعة الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كنت تستخدم TRIzol ، تقسيم العينة إلى 1 aliquots مل في 1.5mL أنابيب إيبندورف وصفت والتجميد في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكرر للجميع النقاط الزمنية ، والحصاد one القارورة في نقطة زمنية. </li></ol> الجزء 4 : استخراج عينات الحمض النووي الريبي في TRIzol <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند هذه النقطة ، ينبغي معلق في العينات الخاصة بك كاشف TRIzol وعلى استعداد لمعالجتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200μL للفصل BCP المرحلة الكاشف لكل مليلتر 1 من TRIzol في كل أنبوب. قد تحتاج لنقل عينة لأكبر أنبوب إذا كنت تبدأ مع كمية كبيرة من TRIzol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة أو تهزه بقوة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العينة في جهاز الطرد المركزي 12000 XG لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة المائية لأنبوب جديد. المرحلة المائية هي طبقة واضحة بشأن القمة. يجب أن تكون استعادة 600μL تقريبا لكل من 1mL TRIzol كنت بدأت مع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القيام استخراج second الفينول / كلوروفورم ، وهذه المرة باستخدام 500μL من كلوروفورم في TRIzol 1 مل ، بدلا من BCP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة أو تهزه بقوة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العينة في جهاز الطرد المركزي 12000 XG لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة المائية لأنبوب جديد. المرحلة المائية هي طبقة واضحة بشأن القمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20μg من الأكريلاميد خطية إلى كل عينة. والأكريلاميد خطية بمثابة الناقل ويساعد على ترسيب الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 &amp; ميCRO ؛ لتر من الأيزوبروبانول في 1 مل من TRIzol كنت بدأت مع كل عينة وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في microcentrifuge في أقصى سرعة لمدة 10-15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيكون بيليه RNA تكون مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب. بعناية فائقة ، وإزالة طاف من الأنبوب ، إما مع الشافطة فراغ ، أو يدويا بواسطة pipettor. لا تخل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع 1 مل من الايثانول 70 ٪. <ul style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 70 ٪ لبيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في سرعة قصوى 14000 ز لمدة 5-7 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية فائقة ، وإزالة الإيثانول من الأنبوب ، إما مع الشافطة فراغ ، أو يدويا بواسطة pipettor. تأكد من أن بيليه مرئيا في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة يغسل. بعد تجاهل طاف ، حيث بيليه هو علامة على الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الهواء الجاف لمدة لا تزيد مدة 5 دقائق. لا overdry ، أو RNA سيكون من الصعب إعادة! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كنت ترغب في متابعة العلاج الدناز اختياري لإزالة أي الحمض النووي المتبقي من العينة ، وresuspend بيليه في 17μL nuclease خالية من المياه. خلاف ذلك ، وresuspend بيليه في 20μL nuclease خالية من المياه والاستمرار في الخطوة 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري الدناز العلاج) عن طريق مجموعة Qiagen الدناز ريبونوكلياز خالية ، إضافة 2μL RDD العازلة وإعادة 1μL ريبونوكلياز خالية الدناز الأول لهذا الحمض النووي الريبي معلق. المزيج بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري الدناز العلاج) احتضان عند 37 درجة مئوية ل30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري الدناز العلاج) إضافة 2μL من EDTA 2.5 ملم واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإبطال نشاط الدناز. لا تتجاوز درجة الحرارة أو تعطيل الوقت وأوقات أطول / ارتفاع درجات الحرارة يمكن أن يسبب تدهور الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الحمض النووي الريبي التي تركز معمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين عينة الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (QC الاختياري) للتحقق من الجودة باستخدام الحمض النووي الريبي BioAnalyzer اجيلنت ، أو عن طريق تشغيل العينة على تغيير طبيعة جل والتحقق من قراءات OD. (260nm ونسبة 260/280) </li></ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

خطوات حاسمة الجزء 1 &amp; 2 هناك العديد من الخطوات الحاسمة لوضع عدوى الوقس متزامن ، الأول صوتنة حذرا يجري (أو trypzinizing) من الفيروس ، من أجل تفصيل جزيئات الفيروس. الوقس معرضة بشكل كبير للتجميع ، والتعطيل من جسيمات الفيروس أمرا هاما لضمان العدوى حتى من الخلايا. من أجل تحقيق العدوى المتزامنة ، ينبغي استخدام وزارة الداخلية العالية (أكبر من 2) للتأكد ...

<table><tbody><tr><td>كاشف TRIzol</td><td>كاشف</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>ستعمل الكواشف المماثلة، مثل TriPure من Roche، أيضاً.</td></tr><tr><td>كاشف BCP لفصل الأطوار</td><td>كاشف</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة DNase الخالية من RNase</td><td>كاشف</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>تعتبر المعالجة بـ DNase خطوة اختيارية.</td></tr></tbody></table>

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

الأسرة<em&gt; Poxviridae</em&gt; تتكون من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل الكبيرة التي تحتوي على الفيروسات التي تحاكي حصرا في السيتوبلازم من الخلايا المصابة. أعضاء<em&gt; الجدري</em&gt; جنس تتضمن الجدري ، والعامل المسبب للجدري الصغيرة الإنسان ، والقرود ، والوقس (VAC) ، وعضو من عائلة prototypic الفيروس. داخل الجينوم الوقس كبيرة نسبيا (~ 200 كيلوبايت) ، يتم ترميز ثلاثة أنواع من الجينات : في وقت مبكر ، وسيطة ، والمتأخر. بينما كتب جميع الطبقات الثلاث polymerases RNA فيروسي ترميز ، ولكل فئة يؤدي وظيفة مختلفة في دورة حياة الفيروس. Poxviruses استخدام استراتيجيات متعددة لتعديل البيئة المضيفة الخلوي أثناء العدوى. من أجل فهم كل من استضافة وتنظيم التعبير الجيني والفيروسات ، واستخدمت على نطاق ونحن الجينوم النهج لتحليل النص وفرة من كل الفيروسات والخلايا المضيفة. هنا ، علينا أن نظهر للالتهابات دوام خلايا هيلا مع فيروس الوقس وأخذ عينات الحمض النووي الريبي في الوقت عدة نقاط في مرحلة ما بعد الإصابة. يتم عزل كل من الحمض النووي الريبي مجموع المضيفة والفيروسية وتضخيم للتهجين لميكروأرس لتحليل التعبير الجيني.

بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. جزء 1 من 3.

تتكون عائلة Poxviridae من فيروسات كبيرة تحتوي على حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) مزدوج السلاسل، وتتكاثر حصرياً في سيتوبلازم الخلايا المصابة. وتعد أعضاء...

تبدأ تجارب العدوى المعتمدة على المدى الزمني لخلايا hela باستخدام فيروس vaccinia بتجهيز العدوى الفيروسية، ثم إصابة الخلايا، وبعد ذلك استخلاص RNA من الخلايا المصابة في نقاط زمنية متعددة بعد الإصابة. يمكن لاحقاً تضخيم RNA هذا من أجل التهجين مع المصفوفات الدقيقة (microarrays) لتحليل التعبير الجيني. مرحباً، أنا جودي آن من مختبر كيت إيرفينز في معهد وايت هيد للأبحاث الطبية الحيوية.سنعرض لكم اليوم إجراءً لدراسة المسار الزمني للعدوى بفيروس vaccinia في الخلايا الثديية، وما يلي ذلك من استخلاص لـ RNA من الخلايا المصابة في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى. تُعد هذه التقنية خطوة تمهيدية في بروتوكول أوسع يهدف إلى استخلاص وتضخيم RNA لتقييم التعبير الجيني للفيروس أثناء العدوى، وهو ما سيتم استكماله في مقطعين آخرين من فيديوهات JoVE. لنبدأ الآن؛ وللتحضير للعدوى، يتم تنمية خلايا hela في دوارق والانتظار حتى تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تبلغ 80% تقريباً.بعد ذلك، تأكد من تحضير كمية كافية من وسط نمو الفيروس للتجربة. باستخدام DMEM عادي مع 2%FBS وبدون إضافة مضادات حيوية، يمكن إجراء العدوى إما باستخدام مخزون تم استدعاؤه من فيروس vaccinia بعيار معروف أو فيروس منقى بالسكروز بعيار معروف. إذا كنت قلقاً بشأن التعبير الجيني للمضيف، وكنت تستخدم فيروساً منقياً بالسكروز، فانتقل إلى الجلسة التالية.إذا كنت تستخدم فيروس vaccinia الخام، قم بإجراء سونيكة للمخزون وتجزئته قبل العدوى مباشرة، واستخدم كوب سونيكة مع حمام يتكون أساساً من الثلج وقليل من الماء، مع ضبط السونيكة على حوالي 30 W لمدة 20 ثانية. قم برج الأنبوب بواسطة جهاز vortex وكرر عملية السونيكة ثلاث مرات، مع إضافة المزيد من الثلج إذا لزم الأمر لإبقاء الكوب ممتلئاً بالثلج ومبرداً، وتأكد من استخدام جهاز vortex بين كل خطوة سونيكة. إذا لم يتوفر لديك جهاز cup ator، اخلط حجماً مساوياً من مخزون الفيروس الخام في 0.25 mg/mL.قم برجّ مخزون الفيروس بالـ vortex بقوة، ثم حضّن مخزون الفيروس مع التريبسين (Trypsin) وامزجه في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. استخدم الـ vortex على فترات زمنية تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق لإصابة الخلايا. أولاً، احسب كمية الجسيمات الفيروسية المطلوبة لإصابة الطبقة أحادية الخلايا وفقاً لمضاعف الإصابة المطلوب.أو تعددية العدوى (MOI). وعادةً ما يتم استخدام MOI مرتفع يتراوح بين 5 و10 في المسارات الزمنية للعدوى. بعد ذلك، أضف الكمية المطلوبة من الفيروس المُنقى بالسكروز أو الفيروس الخام من خلايا tryp إلى وسط نمو فيروسي عند درجة حرارة 37 °C وامزجه جيداً.يجب استخدام كمية كافية من الوسط الغذائي لتغطية قاع الدورق فقط. وتعتبر 10 milliliters من الوسط الغذائي كافية لدورق T 1 75. قم بإزالة الوسط الغذائي من الخلايا واشطفها باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة.أضف الفيروس أو وسط نمو الفيروس إلى كل دورق لنقطة زمنية وهمية عند الساعة صفر. أضف وسط نمو الفيروس فقط دون إضافة الفيروس، ثم قم بالتحريك اللطيف وإمالة الأطباق، وحضنها عند 37 درجة Celsius في حاضنة تحتوي على 5%CO2 لمدة ساعة واحدة. تأكد من إمالة وتحريك الأطباق كل 15 دقيقة لتوزيع الفيروس بشكل متسق والحفاظ على رطوبة الخلايا.بعد الحضن، قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على الفيروس واشطف ثلاث مرات باستخدام PBS بدرجة حرارة الغرفة. أضف أقصى كمية من وسط نمو الفيروس إلى كل دورق.على سبيل المثال، 30 milliliters من الوسط الغذائي لـ T 1 75 flask. يمكنك البدء في حساب هذا كنقطة زمنية للصفر في الوقت المطلوب بعد العدوى. افحص الخلايا تحت المجهر وسجل أي تأثيرات اعتلال خلوي أو CPE.قم بإزالة الوسط المغذي واغسل الخلايا باستخدام 30 milliliters من محلول PBS بدرجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 15 milliliters من التريبسين إلى الخلايا واحضنها لمدة تتراوح بين دقيقتين إلى خمس دقائق. عند درجة حرارة 37 °C، افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من انفصالها، ثم قم بالنقر على القارورة بلطف لتحرير الخلايا.انقل الخلايا باستخدام ماصة سيرولوجية معقمة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. اغسل الدورق بحجم مساوٍ من وسط نمو الخلايا وأضف الوسط إلى الخلايا المعالجة بالتريبسين في الأنبوب المخروطي. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 500 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة وسط الزرع من ركازة الخلايا، ثم أعد تعليق ركازة الخلايا باستخدام إما كاشف triol أو محلول التحلل (lysis buffer) من طقم عزل RNA المطلوب. في حال استخدام triol، قسّم العينة إلى كميات مقدارها 1 مل في أنابيب eend dwarf سعة 1.5 مل وموسومة، ثم جمدها عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. كرر هذه الخطوات لجميع النقاط الزمنية.يتم حصاد دورق واحد لكل نقطة زمنية. في هذه المرحلة، يجب أن تكون العينة مُعلقة مرة أخرى ومضافاً إليها كاشف التريول وجاهزة للمعالجة. أضف 200 µL من كاشف فصل الطور BCP.لكل مليلتر واحد من التريول في كل أنبوب، يُستخدم BCP أو 1-bromo-3-chloropropane بدلاً من الفينول. ولتقليل تلوث الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي، قد تحتاج إلى نقل العينة إلى أنبوب أكبر. إذا كنت تبدأ بكمية كبيرة من التريول، فقم بالرج باستخدام جهاز Vortex أو الرج بقوة والتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق؛ وبعد التحضين، قم بطرد العينة مركزياً عند 12,000 GS لمدة 15 دقيقة بعد عملية الطرد المركزي.يجب أن تكون الطور المائي مرئياً كطبقة شفافة في الأعلى. انقل الطور المائي إلى أنبوب جديد. من المفترض استعادة 600 µL تقريباً مقابل كل 1 mL من التريازول الذي بدأت به.قم بإجراء عملية استخلاص ثانية باستخدام الفينول والكلوروفورم. استخدم هذه المرة 500 µL من الكلوروفورم لكل 1 mL من التريازول بدلاً من BCP. تُستخدم عملية الاستخلاص الثانية بالكلوروفورم لإزالة أي آثار للمذيبات العضوية من المستخلص، حيث يمكن حتى للكميات الضئيلة منها أن تثبط خطوات التضخيم اللاحقة.قم بالرج باستخدام جهاز الفورتيكس أو الرج بقوة، ثم حضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين دقيقتين وثلاث دقائق. قم بطرد العينة مركزياً عند 12,000 GS لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي، انقل الطور المائي إلى أنبوب جديد.تذكر أن الطور المائي هو الطبقة الشفافة الموجودة في الأعلى. بعد ذلك، أضف 20 micrograms من أكريلاميد الخطي (linear acrylamide) إلى كل عينة. يعمل أكريلاميد الخطي كحامل ويساعد في ترسيب الـ RNA.أضف 500 µL من الإيزوبروبانول لكل 1 mL من التريول المستخدم في البداية إلى كل عينة ثم اخلطها. تُحضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، وبعد التحضين، تُجرى عملية الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دقيق بالسرعة القصوى لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. ستظهر كتل الـ RNA في قاع الأنبوب بعد عملية الطرد المركزي.قم بإزالة السائل الطافي من الأنبوب بعناية فائقة، إما باستخدام شفاط تفريغ أو يدويًا بواسطة الماصة. احرص على عدم تحريك الراسب. اغسل الراسب بمليلتر واحد من 70%ethanol ثم قم بالطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة تتراوح من خمس إلى سبع دقائق.بحذر شديد، قم بإزالة الإيثانول من الأنبوب إما باستخدام جهاز شفط تفريغي أو يدويًا بواسطة الماصة. تخلص من السائل الطافي.تحقق من رؤية الراسب في قاع الأنبوب. كرر خطوة الغسيل هذه بعد التخلص من السائل الطافي. حدد موقع الراسب على الأنبوب.جفف الراسب بالهواء لمدة لا تتجاوز خمس دقائق. تجنب التجفيف المفرط لكي لا يصعب إعادة تكوين RNA. بعد ذلك، إذا كان من المخطط معالجة DNA، قم بتعليق الراسب في 17 µL من الماء الخالي من النيوكليز.إذا لم يكن علاج D'S مخططاً له، فقم بتعليق resus في 20 µl. أما في حالة علاج D'S، فاستخدم مجموعة KaiGen RNA free DNA. أضف 2 µl من المنظم RDD و 1 µl من RNAs free المُعاد تشكيله.تُضاف كمية 1 µL من إنزيم DNase إلى الـ RNA المعاد تعليقه، ويُخلط المزيج بلطف ثم يُحضن عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، يُضاف 2 µL من EDTA بتركيز 2.5 mM ويُحضن عند 65 °C لمدة خمس دقائق لإبطال مفعول الـ DNA؛ مع مراعاة عدم تجاوز وقت أو درجة حرارة إبطال المفعول، حيث يمكن أن تؤدي الفترات الأطول ودرجات الحرارة الأعلى إلى تحلل الـ RNA.لقد انتهيت الآن من معالجة الـ DNA. تحقق من تركيز الـ RNA باستخدام المطياف الضوئي. يمكن الكشف عن آثار الفينول أو BCP على شكل ارتفاع مفاجئ عند 270 nanometers بالإضافة إلى الذروة القياسية عند 260 nanometers.عند قياس امتصاصية RNA الكلي بعد الاستخلاص، وفي حال ظهور مثل هذا التلوث، قم بتنقية RNA باستخدام طريقة استخلاص تعتمد على المرشح أو العمود قبل البدء في عملية التضخيم. يمكنك تخزين عينة RNA في درجة حرارة 80- درجة مئوية. كما يمكنك التحقق من جودة RNA إذا رغبت في ذلك، باستخدام جهاز Agilent bioanalyzer أو عن طريق تشغيل العينة على هلام ممسخ (denaturing gel) والتحقق من قراءات الكثافة الضوئية (OD) على جهاز bioanalyzer.يُستدل على جودة RNA من خلال رقم سلامة RNA أو RIN. يعتمد RIN على نظام ترقيم من 1 إلى 10، حيث يمثل الرقم 1 الملف الأكثر تحللاً، بينما يمثل الرقم 10 الملف الأكثر سلامة. لقد عرضنا لك للتو كيفية إجراء عدوى زمنية باستخدام فيروس vaccinia وكيفية استخلاص RNA من الخلايا المصابة في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة.عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن هناك عدة خطوات حاسمة في إعداد عدوى فيروس الجدري الملقح (vaccinia) المتزامنة. أولاً، إجراء عملية سونيكة (sonication) دقيقة أو معالجة الفيروس بالتريبسين (trypsinization). من المهم تفكيك جزيئات الفيروس لأن فيروس vaccinia عرضة بشدة للتكتل، وهو ما من شأنه أن يمنع حدوث عدوى متساوية للخلايا.ثانياً، ومن أجل تحقيق عدوى غير متزامنة، يجب استخدام MOI مرتفع تزيد قيمته عن اثنين لضمان إصابة كل خلية. حيث إن وجود خليط من الخلايا المصابة وغير المصابة سيؤدي إلى جولات متعددة من العدوى، وخليط غير متجانس من النقاط الزمنية، واستجابات نسخية غير متزامنة للفيروس والمضيف. ثالثاً، يجب إجراء العدوى في كميات قليلة من الوسط الغذائي للسماح بأقصى قدر من امتصاص الفيروس بواسطة الخلايا.بالإضافة إلى ذلك، فإن الرج المنتظم للدورق أو أطباق المزرعة كل 10 دقائق يتيح توزيع الفيروس في جميع أنحاء الدورق ويضمن عدم جفاف الخلايا. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.تأكد من مشاهدة الفيديوهات الأخرى في هذه السلسلة حيث نستعرض إجراء التضخيم الخطي لعينات RNA وتحضير وتنقية RNA المسمى فلوريسنتياً.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 2 من 3.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 2

بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 3 يصف عملية وضع العلامات fluorescently تضخيم الحمض النووي الريبي من كل من المضيف والعينات الفيروسية التي اقتران الآليل الأمينية من الأصباغ. الجزء 3 من 3.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 3

ويمكن تحديد العوامل المضيفة المشاركة في رواية عدوى فيروسية من خلال فقدان الجينوم على نطاق خلية مقرها الفحص رني الدالة.

فحوص للكشف عن العوامل رني المضيفة المعنية في الوقس عدوى فيروس باستخدام ذبابة الفاكهة خلايا

Oncolytic الفيروسات واعدة لمداواة السرطان. القدرة على التأكد من عينات الأنسجة infectability يعيش الحصول عليها من المرضى قبل العلاج هو ميزة فريدة من نوعها لهذا النهج العلاجي. هذا البروتوكول توضح كيفية معالجة الأنسجة...

فيفو السابقين العدوى من الأنسجة الحية مع الفيروسات Oncolytic

وصفنا بروتوكول لتحديد الأدوار الرئيسية للجزيئات إشارة المضيف في النسخ المتماثل للهربس التحللي نموذج، غاما هربس 68 (γHV68). استخدام سلالات الفئران المعدلة وراثيا والخلايا الليفية الجنينية لتكرار التحللي γHV68، وبروتوكول يسمح كل من توصيف المظهري والجزيئي للفيروس الاستجواب في استضافة التفاعلات في النسخ المتماثل التحللي الفيروسية.

تشريح المضيف للفيروسات التفاعل في النسخ المتماثل التحللي من الفيروسة الموديل

ووصف طريقة تتبع الخلايا العصبية مرتبطة synaptically. نستخدم TVA خصوصية خلية المنبع لبحث ما إذا كان السكان الخلية ذات الاهتمام يتلقى مساهمات من أنواع الخلايا متشابك تعريف وراثيا.

تتبع الفيروسية من الدوائر العصبية تعريف وراثيا

ويرد هنا وصف بروتوكول سريع ووحدات لتوليد فيروسات vaccinia المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الموسومة الفلورية في وقت واحد باستخدام طريقة الاختيار المهيمن العابر.

منهجية لتوليد كفاءة من البروتينات فيروس Vaccinia الموسومة الفلورية

وصفنا استخدام مراسل الفلورسنت فيروس اللقاحية التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من العدوى الفيروسية والتعبير الجيني من خلال التعبير مرحلة محددة من fluorophores مراسل متميزة طيفيا. نحن بالتفصيل طريقة القائمة على لوحة لتحديد بدقة المرحلة التي يتأثر تكاثر الفيروس ردا على تثبيط جزيء صغير.

اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني

فيروس جدري (VV) وقد استخدم على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية وتحسين صحة الإنسان. توضح هذه المقالة طريقة بسيطة وفعالة للغاية لتحرير الجينوم VV باستخدام نظام كريسبر-Cas9.

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

نقدم هنا، البروتوكولات لتحديد إيمونومودولاتورس 1) الفيروسات المشفرة التي تروج للنسخ المتماثل المفصليات وعوامل المضيف 2) حقيقية النواة التي تقيد المفصليات النسخ المتماثل. تسمح هذه الأساليب المستندة إلى الأسفار والتلألؤ الباحثين سرعة الحصول على قراءات الكمية من النسخ المتماثل المفصليات في فحوصات التبسيط مع انخفاض نسب الإشارات إلى الضجيج.

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

ICP0 يخضع إزفاء النووية إلى هيولى خلال هامبورغ-1 العدوى. ولا يعرف الآلية الجزيئية لهذا الحدث. هنا يصف لنا استخدام مجهر [كنفوكل] كأداة لقياس حركة ICP0 في هامبورغ-1 العدوى، الذي يرسي الأساس لتحليل كمي إزفاء ICP0 في الدراسات الميكانيكية في المستقبل.

التحليل الزمني إزفاء النووية إلى هيولى بروتين الفيروس 1 الحلأ البسيط بالفحص المجهري [كنفوكل] إيمونوفلوريسسينت

تعلم إجراء العدوى الزمنية بفيروس Vaccinia في خلايا HeLa واستخراج RNA لتحليل التعبير الجيني. يوفر هذا البروتوكول تقنية موثوقة لدراسة تفاعلات الفيروس والمضيف.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 1

استكشف المزيد من الفيديوهات