Name: الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 2 (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: تعلم تحليل التعبير الجيني الفيروسي والمضيف في خلايا HeLa المُصابة بفيروس الجدري. يوضح هذا البروتوكول عزل الحمض النووي الريبوزي وتضخيمه لتحليل المصفوفات الدقيقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

معهد وايتهيد زملاء صناديق

الجزء 1 : [كدنا] تجميع من الحمض النووي الريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدام Ambion الأمينية الآليل MessageAmp الثاني عدة ، إضافة الحجم الموصى بها من الإيثانول بنسبة 100 ٪ للمخازن الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب تفاعل PCR ، إضافة إلى 5μg بين 100ng من الحمض النووي الريبي و1μl من مجموع التمهيدي T7 (DT) بنسبة ضئيلة. جعل حجم ما يصل الى 12μl مع nuclease خالية من المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في thermocycler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينات الحمض النووي الريبي من 70 درجة مئوية ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة. مكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد شارع ستراند 1 التجميعي الرئيسي مزيج والحفاظ على درجة حرارة الغرفة (مع 10 ٪ عن الفائض pipetting الخطأ) (الجدول 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف ماصة ميكس ماجستير أو نفض الغبار إلى المزيج ، ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 8μl من مزيج ماجستير في كل عينة الحمض النووي الريبي. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في احتضان 42 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في thermocycler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي عينات لفترة وجيزة ووضع على الجليد. الشروع فورا في الخطوة التالية من التوليف dsDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ستراند الثانية 2 التجميعي مزيج الرئيسي على الجليد (مع الفائض بنسبة 10 ٪ لpipetting الخطأ) (الجدول 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف ماصة ميكس ماجستير أو نفض الغبار إلى المزيج ، ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 80μl لكل عينة والمزيج بلطف صعودا ونزولا pipetting 3-4 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في احتضان 16 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في thermocycler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة 2 ساعة ، والمضي قدما في خطوة لتنظيف [كدنا] أو تجمد على الفور في -20 درجة مئوية. </li></ol> الجزء 2 : مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل [كدنا] تنظيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الصرفة [كدنا] من الثلاجة والسماح لها لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. يهز زجاجة لresuspend تماما المغناطيسي الخرز ملزم [كدنا] قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة nuclease خالية من الماء في أنبوب 1.5mL واحتضان في 50-60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل خلال حضانة لل2hr السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 180μl البحتة [كدنا] لكل عينة ، ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا. نقل العينات إلى لوحة الجولة القاع 96 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستمرار في خلط العينات التي تهز برفق على لوحة شاكر المداري ما لا يقل عن 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي. ترك لوحة على الوقوف لحوالي 6 دقائق ، أو حتى يصبح المزيج شفافة والخرز ومكعبات ملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150μl الاحتياطي اغسل [كدنا] إلى كل بئر ويهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري بسرعة معتدلة. والخرز NOT تفريق في هذه الخطوة ، نظرا لانخفاض التوتر السطحي للالعازلة يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل مرة الثانية مع 2 150μl الاحتياطي اغسل [كدنا]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الثانية 2 ، تجفيف الخرز التي تهز لوحة لمدة 2 دقيقة على شاكر المداري في أقصى سرعة. لا overdry! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل [كدنا] من الخرز بإضافة 18μl الماء nuclease خالية محمى على كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هزة بقوة لوحة لمدة 3 دقائق على شاكر المداري ، ثم تحقق للتأكد من مشتتة تماما الخرز المغناطيسي. إذا لم يكن كذلك ، لا تزال تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة حبات المغناطيسي قد فرقت بشكل كامل ، نقل الى وقفة لوحة المغناطيسي لالتقاط حبات المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية eluted [كدنا] (~ 16μl) لوحة PCR جديد (أو أنابيب PCR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتقال مباشرة إلى الخطوة التالية ، أو تجميد [كدنا] في -20 درجة مئوية. </li></ol> الجزء 3 : النسخ في المختبر (IVT) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج الرئيسي IVT في درجة حرارة الغرفة (الجدول 3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بلطف ميكس ماجستير أو نفض الغبار إلى المزيج ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى كل 24μl العينة ، والمزيج بلطف صعودا ونزولا pipetting 3-4 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 14 ساعة في thermocycler ، ثم اضغط على 4 درجات مئوية حتى على استعداد لاتخاذ الخطوة التالية. </li></ol> الجزء 4 : آرنا تنظيف بعد IVT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة حبات الحمض النووي الريبي ملزمة لفترة وجيزة للحصول على مزيج حتى قبل استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج آرنا ملزم في درجة حرارة الغرفة (الجدول 4) ويمكن القيام بذلك في وقت مبكر -- ويمكن تخزين هذا المزيج أعد ملزمة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج جيد من قبل vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة شطف آرنا الاحتياطي في أنبوب 1.5mL واحتضان في 50-60 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 70μl من مزيج آرنا ملزملكل عينة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينات من لوحة إلى لوحة PCR جولة القاع 96 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50μl 100 ٪ الأيزوبروبانول لكل عينة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز بلطف على لوحة شاكر المداري على الأقل 2 دقيقة لمزيج دقيق العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي. ترك لوحة على الوقوف حتى يصبح المزيج شفافة والخرز ومكعبات ملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة محلول الغسيل 100μl آرنا إلى كل بئر ويهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري بسرعة معتدلة. قد لا تفريق حبات تماما في هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل مرة الثانية مع الحل 2 100μl اغسل آرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الثانية 2 ، تجفيف الخرز التي تهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري في أقصى سرعة. لا overdry العينات! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل في آرنا من الخرز بإضافة 40μl شطف آرنا محمى الاحتياطي على كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هزة بقوة على لوحة شاكر مدارية لمدة 3 دقائق ، ثم تحقق للتأكد من مشتتة تماما الخرز المغناطيسي. إذا لم يكن كذلك ، لا تزال تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة حبات المغناطيسي قد فرقت بشكل كامل ، نقل الى وقفة لوحة المغناطيسي لالتقاط حبات المغناطيسي. وطاف يحتوي على آرنا أدرجت نيراتوفيتشي الأميني الآليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية آرنا eluted لوحة PCR جديد (أو أنابيب PCR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (خطوة اختيارية) للتحقق من تركيز الحمض النووي الريبي من العينات عن طريق قياس 1.5μl على معمل NanoDrop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل فورا على الخطوة التالية ، أو تخزين آرنا في -80 درجة مئوية. </li></ol> الجدول رقم 1 : [كدنا] شارع ستراند 1 التجميعي ميكس ماجستير <table border="1" cellpadding="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> المبلغ : 1 رد الفعل </td></tr><tr><td> 10X الاحتياطي ستراند الأولى </td><td> 2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> dNTP ميكس </td><td> 4 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز المانع </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> مجموعة النصي </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> الجدول 2 : [كدنا] ستراند الثانية 2 التجميعي ميكس ماجستير <table border="1" cellpadding="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> المبلغ : 1 رد الفعل </td></tr><tr><td> Nuclease المياه مجانا </td><td> 63 ميكرولتر </td></tr><tr><td> 10X الاحتياطي ستراند الثانية </td><td> 10 ميكرولتر </td></tr><tr><td> dNTP ميكس </td><td> 4 ميكرولتر </td></tr><tr><td> بوليميراز الدنا </td><td> 2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز H </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> الجدول 3 : IVT ماجستير ميكس <table border="1" cellpadding="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> المبلغ : 1 رد الفعل </td></tr><tr><td> aaUTP حل (75 ملم) </td><td> 2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ATP ، CTP ، GTP مزيج (25 ملم) </td><td> 12 ميكرولتر </td></tr><tr><td> T7 UTP حل (75 ملم) </td><td> 2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> T7 الاحتياطي الرد 10X </td><td> 4 ميكرولتر </td></tr><tr><td> T7 أنزيم ميكس </td><td> 4 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> الجدول 4 : آرنا ميكس تجليد <table border="1" cellpadding="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> المبلغ : 1 رد الفعل </td></tr><tr><td> الخرز RNA ملزم * </td><td> 10 ميكرولتر </td></tr><tr><td> حبة * إعادة تعليق الحل </td><td> 4 ميكرولتر </td></tr><tr><td> 100 ٪ الأيزوبروبانول ** </td><td> 6 ميكرولتر </td></tr><tr><td> آرنا مركزة الاحتياطي تجليد </td><td> 50 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> * مزيج من الحمض النووي الريبي ملزمة مع حبات الحل إعادة تعليق خرزة الأولى. ** إضافة الأيزوبروبانول وتخلط جيدا قبل إضافة تركز آرنا العازلة ملزمة.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

خطوات حاسمة لا ينصح الجولة الثانية من التضخيم كما لوحظت التحيز في البيانات صفيف. الاختلاط في كل خطوة بعناية الأنزيمية (1 و 2 ش التوليف حبلا الثانية [كدنا] ، IVT) أمر حاسم للحصول غلة جيدة التضخيم ، كما هو احتضان كل خطوة الأنزيمية في درجة حرارة مناسبة. A cycler PCR مع غطاء قابل للتعديل ساخنة يفضل -- حتى الانحرافات صغيرة مثل 2-3 درجات خلال IVT في فرن الهواء أو الماء التهجين تهجين الحمام يمكن أن ت...

<table><tbody><tr><td>طقم تضخيم aRNA Amino Allyl MessageAmp II</td><td>كاشف</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>يكفي لـ 20 تفاعلاً</td></tr><tr><td>طقم تضخيم aRNA Amino Allyl MessageAmp II</td><td>كاشف</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>يكفي لـ 100 تفاعل، بتنسيق 96 بئراً</td></tr><tr><td>مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND-1000 UV-VIS</td><td>أخرى</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>أو مقياس طيف ضوئي مكافئ</td></tr></tbody></table>

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

الأسرة<em&gt; Poxviridae</em&gt; تتكون من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل الكبيرة التي تحتوي على الفيروسات التي تحاكي حصرا في السيتوبلازم من الخلايا المصابة. أعضاء<em&gt; الجدري</em&gt; جنس تتضمن الجدري ، والعامل المسبب للجدري الصغيرة الإنسان ، والقرود ، والوقس (VAC) ، وعضو من عائلة prototypic الفيروس. داخل الجينوم الوقس كبيرة نسبيا (~ 200 كيلوبايت) ، يتم ترميز ثلاثة أنواع من الجينات : في وقت مبكر ، وسيطة ، والمتأخر. بينما كتب جميع الطبقات الثلاث polymerases RNA فيروسي ترميز ، ولكل فئة يؤدي وظيفة مختلفة في دورة حياة الفيروس. Poxviruses استخدام استراتيجيات متعددة لتعديل البيئة المضيفة الخلوي أثناء العدوى. من أجل فهم كل من استضافة وتنظيم التعبير الجيني والفيروسات ، واستخدمت على نطاق ونحن الجينوم النهج لتحليل النص وفرة من كل الفيروسات والخلايا المضيفة. هنا ، علينا أن نظهر للالتهابات دوام خلايا هيلا مع فيروس الوقس وأخذ عينات الحمض النووي الريبي في الوقت عدة نقاط في مرحلة ما بعد الإصابة. يتم عزل كل من الحمض النووي الريبي مجموع المضيفة والفيروسية وتضخيم للتهجين لميكروأرس لتحليل التعبير الجيني.

بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 2 من 3.

تتكون عائلة Poxviridae من فيروسات تحتوي على حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) مزدوج السلسلة وكبير الحجم، وتتكاثر حصرياً في سيتوبلازم الخلايا المصابة. وأعضاء...

مرحباً، أنا جودي ين من مختبر كيت روبينز في معهد وايت هيد للأبحاث الطبية الحيوية. بعد إصابة خلايا hela بفيروس vaccinia وعزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) الكلي، كما ظهر في بروتوكول فيديو Joe السابق، يمكن عزل الـ RNA الفيروسي وتضخيمه باستخدام النسخ العكسي والنسخ في المختبر (in vitro transcription)، وسيتم استخدام الـ RNA المضخم لاحقاً في تحليل المصفوفات الدقيقة (microarray) للتعبير الجيني الفيروسي والمضيف. لذا، فلنبدأ.لبدء تخليق cDNA من الـ RNA، أضف الحجم الموصى به من الإيثانول بتركيز 100% إلى محاليل الغسيل المنظمة قبل استخدام مجموعة ambient amino allele message AMP two. في أنبوب تفاعل PCR، أضف ما بين 100 nanograms إلى 5 micrograms من الـ RNA الكلي و1 microliter من بادئ T seven oligo. أكمل الحجم إلى 12 microliters باستخدام ماء خالٍ من النوكلياز. قم بتحضين العينات عند درجة حرارة 70 °C لمدة 10 دقائق في جهاز التدوير الحراري.بعد ذلك، أخرج عينات الـ RNA من درجة حرارة 70 درجة مئوية في جهاز الطرد المركزي. باختصار، ضع العينات على الثلج بعد عملية الطرد المركزي. قم بتحضير المزيج الرئيسي لتخليق الشريط الأول مع زيادة في الحجم بنسبة 10% لتغطية أخطاء نقل السوائل.اتركه في درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم الماصة بلطف لنقل الخليط الرئيسي (master mix) أو قم بنقره للمزج، ثم قم بطرده مركزياً لفترة وجيزة. بعد الطرد المركزي، انقل 8 µL من الخليط الرئيسي إلى كل عينة RNA، واخلطها باستخدام الماصة عن طريق السحب والدفع من ثلاث إلى أربع مرات، ثم حضنها عند 42 °C لمدة ساعتين في جهاز التدوير الحراري (thermocycler). بعد الحضن، قم بطرد العينات مركزياً لفترة وجيزة وضعها على الثلج. انتقل فوراً إلى الخطوة التالية من تخليق cDNA.قم بتحضير المزيج الرئيسي لتخليق الشريط الثاني على الثلج مع زيادة بنسبة 10% في الحجم لتعويض خطأ الماصة، ثم انقل المزيج الرئيسي بلطف باستخدام الماصة أو عن طريق رج الأنبوب، ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة بعد ذلك. انقل 80 µL إلى كل عينة واخلط بلطف عن طريق السحب والدفع بالماصة من ثلاث إلى أربع مرات. قم بالتحضين عند 16 °C لمدة ساعتين في جهاز الدور الحراري.بعد فترة الحضانة التي تستمر لساعتين، انتقل إلى خطوة تنقية الـ cDNA أو قم بالتجميد فوراً عند درجة حرارة 20- درجة مئوية. لبدء تنقية الـ cDNA مزدوج السلسلة، قم أولاً بإخراج cDNA pure من الثلاجة واتركه ليصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام، ورُج الزجاجة لإعادة تعليق حبيبات ربط الـ cDNA المغناطيسية بالكامل قبل الاستخدام، ثم ضع مقداراً محدداً من الماء الخالي من النوكلياز في أنبوب سعة 1.5 مل وقم بحضانته عند درجة حرارة 50 إلى 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل.خلال فترة الحضن السابقة التي استمرت لساعتين، أضف 180 µL من CD NA pure إلى كل عينة واخلطها جيداً عن طريق سحب السائل ودفعه للأعلى والأسفل باستخدام الماصة. انقل العينات إلى لوحة ذات 96 بئراً ذات قاع مستدير. بعد نقل العينات إلى اللوحة، استمر في خلط العينات عن طريق رج اللوحة بلطف على هزاز مداري لمدة دقيقتين على الأقل.انقل الطبق إلى حامل مغناطيسي لجمع الحبيبات المغناطيسية. اترك الطبق على الحامل لمدة ست دقائق تقريبًا أو حتى يصبح الخليط شفافًا وتترسب الحبيبات الرابطة. اسحب السائل الطافي بعناية باستخدام شفاط تفريغ دون تحريك الحبيبات المغناطيسية.بدلاً من ذلك، قم بإزالة الطافي بعناية باستخدام ماصة وتخلص منه. بعد التخلص من الطافي، قم بإزالة اللوحة من الحامل المغناطيسي. أضف 150 microliters من cDNA wash buffer إلى كل بئر وقم برج اللوحة لمدة دقيقة واحدة على الهزاز المداري بسرعة متوسطة.لن تتشتت الحبيبات في هذه الخطوة بسبب انخفاض التوتر السطحي للمحلول المنظف. بعد الرج، أعد اللوحة إلى الحامل المغناطيسي. لالتقاط الحبيبات المغناطيسية، اسحب السائل الطافي بعناية باستخدام جهاز شفط فراغي دون تحريك الحبيبات المغناطيسية.أو قم بإزالة السائل الطافي بعناية باستخدام ماصة وتخلص منه. أخرج اللوحة من الحامل المغناطيسي. كرر عملية الغسيل مرة ثانية باستخدام 150 microliters من CDNA wash buffer.بعد الغسلة الثانية، جفف الحبيبات عن طريق هز اللوحة لمدة دقيقتين على الهزاز المداري بأقصى سرعة. من المهم عدم ترك الحبيبات تجف بشكل مفرط. بعد ذلك، قم باستخلاص cDNA من الحبيبات عن طريق إضافة 18 µL من الماء الخالي من النوكلياز المسخن مسبقاً إلى كل عينة مع الرج بقوة.رجّ اللوحة لمدة ثلاث دقائق على الهزاز المداري. ثم تحقق من التأكد من تشتت الحبيبات المغناطيسية بالكامل. إذا لم تكن كذلك، استمر في الرج.بمجرد تشتت الحبيبات المغناطيسية بالكامل، انقل الطبق إلى حامل مغناطيسي. لالتقاط الحبيبات المغناطيسية، انقل cd NA المستخلص بعناية إلى طبق PCR جديد أو أنابيب PCR. يجب أن تستعيد ما يقرب من 16 µL من سائل الاستخلاص لكل عينة.انتقل مباشرة إلى الخطوة التالية أو قم بتجميد الـ cd NA عند درجة حرارة -20 °C. قم بتحضير المزيج الرئيسي لعملية IVT في درجة حرارة الغرفة. اسحب المزيج الرئيسي بلطف باستخدام الماصة أو قم بنقره للمزج ثم استخدم جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة.بعد عملية الطرد المركزي، أضف 24 µL إلى كل عينة واخلط برفق عن طريق السحب والدفع بالماصة من ثلاث إلى أربع مرات، ثم حضن العينات عند 37 °C لمدة 14 ساعة في جهاز التدوير الحراري (thermocycler). بعد ذلك، تُحفظ العينات عند 4 °C حتى يحين موعد الخطوة التالية، مع رجّ حبيبات ربط الـ RNA باستخدام جهاز الخلط الدوامي (vortex) لفترة وجيزة للحصول على مزيج متجانس قبل الاستخدام. قم بتحضير خليط ربط الـ RNA (A) في درجة حرارة الغرفة.يمكن القيام بذلك مسبقاً. يمكن تخزين خليط الربط المُحضّر في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد. اخلط جيداً باستخدام جهاز مزج الدوامات (vortexing) ثم انقل كمية مقدرة من A RNA elution buffer إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter واتركه في الحاضنة عند درجة حرارة 50 to 60 °C لمدة 10 دقائق على الأقل.الآن، أضف 70 µL من مزيج ربط RNA إلى كل عينة، وامزج جيداً عن طريق السحب والضخ بالماصة من ثلاث إلى أربع مرات. انقل العينات من لوحة PCR إلى لوحة ذات قاع مستدير تحتوي على 96 بئراً. بعد ذلك، أضف 50 µL من الإيزوبروبانول بتركيز 100% إلى كل عينة، وامزج جيداً عن طريق السحب والضخ بالماصة من ثلاث إلى أربع مرات.قم برج الصفيحة برفق باستخدام هزاز مداري لمدة دقيقتين على الأقل. ولخلط العينات جيداً، انقل الصفيحة إلى حامل مغناطيسي لالتقاط الحبيبات المغناطيسية.اترك الطبق على الحامل حتى يصبح الخليط شفافاً وتترسب حبيبات الربط. بعد ترسب الحبيبات، اسحب السائل الطافي بعناية باستخدام الشافط الفراغي دون تحريك الحبيبات المغناطيسية. وبدلاً من ذلك، يمكن إزالة السائل الطافي بعناية باستخدام ماصة ثم التخلص منه.أخرج الطبق من الحامل المغناطيسي. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول غسل RNA إلى كل بئر ورج الطبق لمدة دقيقة واحدة على هزاز مداري بسرعة متوسطة، ولا يشترط تشتت الخرزات بشكل كامل. في هذه الخطوة، انقل الطبق إلى حامل مغناطيسي.لالتقاط الخرزات المغناطيسية. اسحب السائل الطافي بعناية باستخدام جهاز شفط فراغي دون تحريك الخرزات المغناطيسية. بدلاً من ذلك، قم بإزالة السائل الطافي بعناية باستخدام ماصة ثم تخلص من السائل الطافي.بمجرد إزالة السائل الطافي، انقل الطبق من الحامل المغناطيسي. كرر عملية الغسل مرة ثانية باستخدام 100 µL من محلول غسل RNA. بعد الغسلة الثانية، جفف الخرزات عن طريق هز الطبق لمدة دقيقة واحدة على الهزاز المداري بأقصى سرعة.تذكر عدم تجفيف العينات بشكل مفرط؛ قم باستخلاص A RNA من الحبيبات عن طريق إضافة 40 microliters من A RNA elution buffer الذي تم تسخينه مسبقاً. بالنسبة لكل عينة، قم برج اللوحة بقوة على الهزاز المداري لمدة ثلاث دقائق، ثم تحقق من التأكد من تشتت الحبيبات المغناطيسية بشكل كامل.إذا لم يحدث ذلك، استمر في الرج. وبمجرد تشتت الحبيبات المغناطيسية تماماً، انقل الصفيحة إلى حامل مغناطيسي لالتقاط الحبيبات المغناطيسية. يحتوي السائل الطافي على الأليل الأميني المنقى، مدمجاً مع RNA.انقل الـ RNA المستخلص بعناية إلى طبق PCR جديد أو أنابيب PCR. في هذه المرحلة، يمكنك التحقق من تركيز الـ RNA في العينات عن طريق قياس 1.5 µL باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop. استمر فوراً في الخطوة التالية أو قم بتخزين الـ RNA عند -80 °C.لقد شرحنا لك للتو كيفية وضع علامة فلورية على عينات RNA المدمجة من الأليلات المناعية المُضخمة من أجل تهجين المصفوفات الدقيقة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن إجراء جولة ثانية من التضخيم غير مستحسن. ونظرًا لملاحظة وجود انحيازات في بيانات المصفوفة، فمن المهم أيضًا تذكر أن الخلط الدقيق في كل خطوة إنزيمية يُوصى به للشريطين الأول والثاني.تعد عملية تخليق cDNA، أو خطوة النسخ المختبري (IVT)، أمرًا بالغ الأهمية للحصول على عوائد تضخيم جيدة، كما هو الحال بالنسبة لحضن كل خطوة إنزيمية في درجة الحرارة المناسبة. ويُفضل استخدام جهاز دورات PCR بغطاء مسخن قابل للتعديل، حيث إن الانحرافات البسيطة التي تتراوح بين درجتين إلى ثلاث درجات خلال عملية النسخ المختبري، سواء في فرن تهجين هوائي أو حمام مائي للتهجين، يمكن أن تؤثر بشكل كبير على عائد المنتج المُضخم.هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم. تأكدوا من مشاهدة الفيديوهات الأخرى في هذه السلسلة، حيث نعرض كيفية إجراء عدوى زمنية باستخدام فيروس vaccinia، واستخلاص RNA من العينات، بالإضافة إلى تحضير وتنقية RNA المسمى فلوريسنتياً.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. جزء 1 من 3.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 1

بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 3 يصف عملية وضع العلامات fluorescently تضخيم الحمض النووي الريبي من كل من المضيف والعينات الفيروسية التي اقتران الآليل الأمينية من الأصباغ. الجزء 3 من 3.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 3

ويمكن تحديد العوامل المضيفة المشاركة في رواية عدوى فيروسية من خلال فقدان الجينوم على نطاق خلية مقرها الفحص رني الدالة.

فحوص للكشف عن العوامل رني المضيفة المعنية في الوقس عدوى فيروس باستخدام ذبابة الفاكهة خلايا

Oncolytic الفيروسات واعدة لمداواة السرطان. القدرة على التأكد من عينات الأنسجة infectability يعيش الحصول عليها من المرضى قبل العلاج هو ميزة فريدة من نوعها لهذا النهج العلاجي. هذا البروتوكول توضح كيفية معالجة الأنسجة...

فيفو السابقين العدوى من الأنسجة الحية مع الفيروسات Oncolytic

وصفنا بروتوكول لتحديد الأدوار الرئيسية للجزيئات إشارة المضيف في النسخ المتماثل للهربس التحللي نموذج، غاما هربس 68 (γHV68). استخدام سلالات الفئران المعدلة وراثيا والخلايا الليفية الجنينية لتكرار التحللي γHV68، وبروتوكول يسمح كل من توصيف المظهري والجزيئي للفيروس الاستجواب في استضافة التفاعلات في النسخ المتماثل التحللي الفيروسية.

تشريح المضيف للفيروسات التفاعل في النسخ المتماثل التحللي من الفيروسة الموديل

ووصف طريقة تتبع الخلايا العصبية مرتبطة synaptically. نستخدم TVA خصوصية خلية المنبع لبحث ما إذا كان السكان الخلية ذات الاهتمام يتلقى مساهمات من أنواع الخلايا متشابك تعريف وراثيا.

تتبع الفيروسية من الدوائر العصبية تعريف وراثيا

ويرد هنا وصف بروتوكول سريع ووحدات لتوليد فيروسات vaccinia المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الموسومة الفلورية في وقت واحد باستخدام طريقة الاختيار المهيمن العابر.

منهجية لتوليد كفاءة من البروتينات فيروس Vaccinia الموسومة الفلورية

وصفنا استخدام مراسل الفلورسنت فيروس اللقاحية التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من العدوى الفيروسية والتعبير الجيني من خلال التعبير مرحلة محددة من fluorophores مراسل متميزة طيفيا. نحن بالتفصيل طريقة القائمة على لوحة لتحديد بدقة المرحلة التي يتأثر تكاثر الفيروس ردا على تثبيط جزيء صغير.

اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني

نقدم هنا، البروتوكولات لتحديد إيمونومودولاتورس 1) الفيروسات المشفرة التي تروج للنسخ المتماثل المفصليات وعوامل المضيف 2) حقيقية النواة التي تقيد المفصليات النسخ المتماثل. تسمح هذه الأساليب المستندة إلى الأسفار والتلألؤ الباحثين سرعة الحصول على قراءات الكمية من النسخ المتماثل المفصليات في فحوصات التبسيط مع انخفاض نسب الإشارات إلى الضجيج.

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

ICP0 يخضع إزفاء النووية إلى هيولى خلال هامبورغ-1 العدوى. ولا يعرف الآلية الجزيئية لهذا الحدث. هنا يصف لنا استخدام مجهر [كنفوكل] كأداة لقياس حركة ICP0 في هامبورغ-1 العدوى، الذي يرسي الأساس لتحليل كمي إزفاء ICP0 في الدراسات الميكانيكية في المستقبل.

التحليل الزمني إزفاء النووية إلى هيولى بروتين الفيروس 1 الحلأ البسيط بالفحص المجهري [كنفوكل] إيمونوفلوريسسينت

تعلم تحليل التعبير الجيني الفيروسي والمضيف في خلايا HeLa المُصابة بفيروس الجدري. يوضح هذا البروتوكول عزل الحمض النووي الريبوزي وتضخيمه لتحليل المصفوفات الدقيقة.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 2

استكشف المزيد من الفيديوهات