Name: الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 3 (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: تعلم تقنية وسم الحمض النووي الريبوزي المضاد باستخدام تقنية ربط الأصباغ الأمينية من خلايا هيلا المصابة بفيروس الجدري. تُعد هذه الطريقة أساسية لتحليل التعبير الجيني عبر المصفوفات الدقيقة في دراسات علم الفيروسات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

معهد وايتهيد زملاء صناديق

الجزء 1 : آرنا العلامات : الأمينية اقتران الآليل من الأصباغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1μg من العينات آرنا في أنابيب microcentrifuge 1.5mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فراغ تجفيف العينات في درجة حرارة منخفضة أو معدومة حتى تجف تماما. سقف كل أنبوب في أقرب وقت كما هو جاف -- لا overdry! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى اقتران 9μl العازلة لكل أنبوب وresuspend وآرنا بواسطة vortexing بلطف لمدة 1 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع العينات في الجزء السفلي من الأنبوب ثم يسمح العينة الجلوس على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 22μl DMSO ذات جودة عالية إلى كل أنبوب Cy3 أو Cy5 صباغة. أنبوب واحد من صبغة يكفي لمدة 2 العينات. الصبغة Cy3 هو لوصفها عينات مرجعية الخاص بك ، وصبغ Cy5 هو لوصفها عينات الاختبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة الأصباغ إلى مزيج دقيق. الحفاظ على الأصباغ في الظلام حتى جاهزة للاستخدام. لا تعد صبغة في وقت سابق من 1 ساعة قبل استخدامها. تأكد من عدم الماء يحصل في مزيج صبغ / DMSO في أي لحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 11μl الصبغة DMSO / قبرصي على استعداد لكل عينة. مزيج جيد من قبل vortexing بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عن 30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغطية العينات مع البربون أو الاحتفاظ بها في درج للحد من التعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة ، إضافة إلى 4.5μl hydroxlyamine كل عينة لإرواء التفاعل. مزيج جيد من قبل vortexing بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغطية العينات مع البربون أو الاحتفاظ بها في درج للحد من التعرض للضوء. </li></ol> الجزء 2 : إعتبر آرنا تنظيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة حبات الحمض النووي الريبي ملزمة لفترة وجيزة للحصول على مزيج حتى قبل استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج آرنا ملزم في درجة حرارة الغرفة (الجدول 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج جيد من قبل vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquote الاحتياطي شطف آرنا في أنبوب 1.5mL واحتضان في 50-60 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 70μl من مزيج آرنا ملزمة لكل عينة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينات من لوحة إلى لوحة PCR جولة القاع 96 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50μl 100 ٪ الأيزوبروبانول لكل عينة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز بلطف على لوحة شاكر المداري على الأقل 2 دقيقة لمزيج دقيق العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي. ترك لوحة على الوقوف حتى يصبح المزيج شفافة والخرز ومكعبات ملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف. يجب أن يكون إما طاف ردي مشرق أو زرقاء لامعة في هذه المرحلة نظرا لجزيئات صبغة فردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة محلول الغسيل 100μl آرنا إلى كل بئر ويهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري بسرعة معتدلة. قد لا تفريق حبات تماما في هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل مرة الثانية مع الحل 2 100μl اغسل آرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الثانية 2 ، تجفيف الخرز التي تهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري في أقصى سرعة. لا overdry العينات! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل في آرنا من الخرز بإضافة 20μl شطف آرنا محمى الاحتياطي على كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هزة بقوة على لوحة شاكر مدارية لمدة 3 دقائق ، ثم تحقق للتأكد من مشتتة تماما الخرز المغناطيسي. إذا لم يكن كذلك ، لا تزال تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة حبات المغناطيسي قد فرقت بشكل كامل ، نقل الى وقفة لوحة المغناطيسي لالتقاط حبات المغناطيسي. وطاف يحتوي على تنظيف ، وعينات آرنا المسمى ، ويجب أن يكون إما وردي شاحب أو أزرق شاحب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية آرنا eluted لوحة PCR جديد (أو أنابيب PCR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (خطوة اختيارية) للتحقق من تركيز الحمض النووي الريبي وكمية من الصبغة في العينات عن طريق قياس 1.5μl على معمل NanoDrop باستخدام وحدة ميكروأري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هجن فورا آرنا صفت على منصة ميكروأري من اختيارك ، أو بدلا من ذلك ، يمكنك تخزين آرنا المسمى في -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للتهجين. </li></ol> الجدول ميكس آرنا 1 تجليد <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> المبلغ : 1 رد الفعل </td></tr><tr><td> الخرز RNA ملزم * </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> حبة * إعادة تعليق الحل </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> 100 ٪ الأيزوبروبانول ** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> آرنا مركزة الاحتياطي تجليد </td><td> 50μl </td></tr></tbody></table> * مزيج من الخرز RNA ملزم معحبة حل إعادة تعليق first ** إضافة الأيزوبروبانول وتخلط جيدا قبل إضافة تركز آرنا العازلة ملزمة.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

خطوات حاسمة عند إجراء اقتران الأمينية الآليل ، فمن الأهمية بمكان أن resuspend الصبغة DMSO في فترة وجيزة (أقل من 1 ساعة) قبل توصيل المياه وضمان عدم وجود مزيج يحصل في صبغ / DMSO ، لأنها سوف تتفاعل مع مجموعة نشطة على صباغة. لا overdry الحمض النووي الريبي (يمكن أن تجفف وصولا الى 2uL - 1 بدلا من يجف تماما) ، وكذلك في resuspend العازلة اقتران. خلال رد فعل اقتران ، والحفاظ على رد الفعل في الظلام ، مع التحريك بين الحين وتد...

<table><tbody><tr><td>مجموعة صبغات CyDye التفاعلية للوسم اللاحق</td><td>كاشف</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN5661</td><td>تحتوي على صبغتي Cy3 وCy5</td></tr><tr><td>مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND-1000 UV-VIS</td><td>أخرى</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>أو مقياس طيف ضوئي مكافئ</td></tr></tbody></table>

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 3

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

الأسرة<em&gt; Poxviridae</em&gt; تتكون من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل الكبيرة التي تحتوي على الفيروسات التي تحاكي حصرا في السيتوبلازم من الخلايا المصابة. أعضاء<em&gt; الجدري</em&gt; جنس تتضمن الجدري ، والعامل المسبب للجدري الصغيرة الإنسان ، والقرود ، والوقس (VAC) ، وعضو من عائلة prototypic الفيروس. داخل الجينوم الوقس كبيرة نسبيا (~ 200 كيلوبايت) ، يتم ترميز ثلاثة أنواع من الجينات : في وقت مبكر ، وسيطة ، والمتأخر. بينما كتب جميع الطبقات الثلاث polymerases RNA فيروسي ترميز ، ولكل فئة يؤدي وظيفة مختلفة في دورة حياة الفيروس. Poxviruses استخدام استراتيجيات متعددة لتعديل البيئة المضيفة الخلوي أثناء العدوى. من أجل فهم كل من استضافة وتنظيم التعبير الجيني والفيروسات ، واستخدمت على نطاق ونحن الجينوم النهج لتحليل النص وفرة من كل الفيروسات والخلايا المضيفة. هنا ، علينا أن نظهر للالتهابات دوام خلايا هيلا مع فيروس الوقس وأخذ عينات الحمض النووي الريبي في الوقت عدة نقاط في مرحلة ما بعد الإصابة. يتم عزل كل من الحمض النووي الريبي مجموع المضيفة والفيروسية وتضخيم للتهجين لميكروأرس لتحليل التعبير الجيني.

بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 3 يصف عملية وضع العلامات fluorescently تضخيم الحمض النووي الريبي من كل من المضيف والعينات الفيروسية التي اقتران الآليل الأمينية من الأصباغ. الجزء 3 من 3.

تتكون عائلة Poxviridae من فيروسات تحتوي على حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) مزدوج السلسلة وكبير الحجم، وتتكاثر حصرياً في سيتوبلازم الخلايا المصابة. وتعد أعضاء...

مرحباً، أنا جودي Y من مختبر كيت روبينز في معهد وايت هيد للأبحاث الطبية الحيوية. سنوضح هنا كيفية وسم عينات الـ RNA المضادة للمعنى التي تم جمعها من كل من خلايا hela المصابة بفيروس vaccinia ومن الفيروس نفسه، وذلك عن طريق ربط الأصباغ باستخدام amino all LEO. بعد ذلك، سنبين كيفية تنقية الـ A RNA الموصوم وتحضيره ليتم تهجينه من أجل تحليل التعبير الجيني باستخدام المصفوفات الدقيقة (microarray).تسلط فيديوهات JoVE السابقة الضوء على كيفية إجراء خطوات العدوى الفيروسية، وعزل الـ RNA الكلي، وتضخيم الـ RNA. لذا، فلنبدأ. لبدء عملية وسم الـ RNA، أضف أولاً 1 µg من عينات الـ RNA إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL.يتم تجفيف العينات بالتفريغ الهوائي باستخدام حرارة منخفضة أو بدون حرارة حتى تجف تماماً. وتُغلق كل أنبوبة بالغطاء فور جفافها. ومن المهم عدم الإفراط في تجفيف العينات بعد جفافها.أضف 9 µL من محلول التوصيل المنظم (coupling buffer) إلى كل أنبوب، وأعد تعليق الـ A RNA عن طريق الرج الدوار الخفيف (vortexing) لمدة دقيقة واحدة، ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لتجميع العينة في قاع الأنبوب، واترك العينة بعد ذلك في الثلج. بعد ذلك، أضف 22 µL من DMSO عالي الجودة إلى كل أنبوب من صبغة SCI three أو S five، حيث يكفي أنبوب واحد من الصبغة لعينةين. تُستخدم صبغات S SI three لوسم عينات المرجع، بينما تُستخدم صبغة SCI five لوسم عينات الاختبار.قم برج الأصباغ باستخدام جهاز vortex للمزج جيداً. تذكر الاحتفاظ بالأصباغ في الظلام حتى يحين وقت استخدامها. لا تقم بتحضير الصبغة قبل أكثر من ساعة واحدة من الاستخدام، وتأكد من عدم وصول أي كمية من الماء إلى مزيج الصبغة و DMSO في أي مرحلة.الآن، أضف 11 µL من خليط صبغة D-M-S-O-S المُحضرة إلى كل عينة، واخلطها جيداً باستخدام جهاز الـ vortex. قم بالتحضين برفق لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غطِّ العينات بورق القصدير أو احتفظ بها في درج لتقليل التعرض للضوء.بعد فترة التحضين، أضف 4.5 µL من الهيدروكسيلامين إلى كل عينة لإيقاف التفاعل، ثم اخلط جيداً باستخدام جهاز الـ vortex. حضّن العينات بلطف لمدة 15 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة. غطِّ العينات بورق القصدير أو احفظها في درج لتقليل التعرض للضوء.لتنظيف الملصق، يتم رج خرزات ربط الـ RNA باستخدام جهاز الـ vortex. وباختصار، للحصول على خليط متجانس قبل الاستخدام، يتم تحضير خليط ربط الـ A RNA في درجة حرارة الغرفة. اخلط خليط الربط جيداً عن طريق الرج بجهاز الـ vortex، ثم انقل مقداراً من منظم استخلاص الـ A RNA إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter وحضنه عند درجة حرارة 50 إلى 60 degrees Celsius لمدة 10 minutes على الأقل.أضف 70 µL من خليط ربط الـ RNA إلى كل عينة، وامزج جيداً عن طريق السحب والطرد بالماصة من ثلاث إلى أربع مرات. بعد المزج، انقل العينات من لوحة PCR إلى لوحة ذات قاع مستدير تحتوي على 96 بئراً. بعد ذلك، أضف 50 µL من الإيزوبروبانول بتركيز 100% إلى كل عينة، وامزج جيداً عن طريق السحب والطرد بالماصة من ثلاث إلى أربع مرات. رج اللوحة برفق باستخدام هزاز مداري لمدة دقيقتين على الأقل.لخلط العينات جيداً. انقل اللوحة إلى حامل مغناطيسي. لالتقاط الخرزات المغناطيسية.اترك الطبق على الحامل حتى يصبح الخليط شفافاً وتترسب خرزات الربط في القاع. اسحب الطافي بعناية باستخدام جهاز شفط فراغي دون تحريك الخرزات المغناطيسية. وبدلاً من ذلك، يمكن إزالة الطافي بعناية باستخدام ماصة ثم التخلص منه.يجب أن يكون السائل الطافي إما وردياً فاقعاً أو أزرق فاقعاً في هذه المرحلة بسبب جزيئات الصبغة غير المدمجة. وبمجرد التخلص من السائل الطافي، قم بإزالة اللوحة من الحامل المغناطيسي. الآن، أضف 100 µL من محلول غسيل RNA إلى كل بئر، ورج اللوحة لمدة دقيقة واحدة على الهزاز المداري بسرعة متوسطة.قد لا تتشتت الحبيبات بالكامل في هذه الخطوة، لذا أعد الطبق إلى الحامل المغناطيسي لجمع الحبيبات المغناطيسية. اسحب السائل الطافي بعناية باستخدام جهاز شفط بالتفريغ دون تحريك الحبيبات المغناطيسية.بدلاً من ذلك، قم بإزالة السائل الطافي بعناية باستخدام الماصة وتخلص منه. ارفع الصفيحة من الحامل المغناطيسي. كرر عملية الغسل مرة ثانية باستخدام 100 µL من محلول غسيل RNA A.بعد الغسلة الثانية، جفف الحبيبات عن طريق هز اللوحة لمدة دقيقة واحدة على الهزاز المداري بأقصى سرعة. تجنب التجفيف المفرط للعينات، ثم استخلص الـ A RNA من الحبيبات بإضافة 20 µL من محلول استخلاص A RNA المسخن مسبقاً.قم برج اللوحة لكل عينة بقوة على الهزاز المداري لمدة ثلاث دقائق. ثم تحقق من تشتت الحبيبات المغناطيسية بشكل كامل. وفي حال عدم حدوث ذلك، استمر في الرج.بمجرد تشتت الحبيبات المغناطيسية تماماً، انقل الطبق إلى حامل مغناطيسي لالتقاط الحبيبات المغناطيسية. يحتوي السائل الطافي على عينات A RNA المسمى والمنقاة، ويجب أن يكون لونه إما وردياً فاتحاً أو أزرق فاتحاً. بعد ذلك، انقل A RNA المذكور بعناية إلى طبق PCR جديد أو أنابيب PCR.في هذه المرحلة، يمكنك التحقق من تركيز الـ RNA وكمية الصبغة في العينات عن طريق قياس 1.5 µL باستخدام جهاز NanoDrop spectrophotometer. وباستخدام وحدة المصفوفة الدقيقة (microarray module)، قم بتهجين الـ A RNA الموّسم فوراً على منصة microarray من اختيارك. أو بدلاً من ذلك، يمكنك تخزين الـ A RNA الموّسم عند درجة حرارة -80 °C حتى تصبح مستعداً لعملية التهجين.هذه قراءة ممثلة بجهاز المطياف الضوئي ومخطط للكثافة الضوئية (OD) تم إنتاجه باستخدام مطياف NanoDrop لقياس تركيز العينة ودمج الصبغة. يمكنك رؤية قمم الكثافة الضوئية عند 260 نانومتر لحساب تركيز العينات، بالإضافة إلى القمتين حول 532 و635 نانومتر اللتين تمثلان صبغتي S3 وSCI على التوالي. لقد عرضنا لك للتو كيفية وضع علامات فلورية على عينات RNA المدمجة في الأليلات المناعية المضخمة من أجل التهجين بالمصفوفات الدقيقة.عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إعادة تعليق الصبغة في DMSO قبل أقل من ساعة من عملية الربط، والتأكد من عدم وصول الماء إلى خليط الصبغة مع DMSO لأن ذلك سيؤدي إلى تفاعله مع المجموعة النشطة في الصبغة. ومن المهم أيضاً تذكر عدم تجفيف RNA بشكل مفرط إذا لزم الأمر؛ حيث يمكن تجفيف العينات حتى يتبقى 1 إلى 2 µL بدلاً من التجفيف التام، ثم إعادة تعليقها جيداً في محلول الربط المنظم أثناء تفاعل الربط.احتفظ بالتفاعلات في الظلام مع التحريك الخفيف من حين لآخر، وقم بالطرد المركزي لترسيب السوائل إذا رغبت في ذلك. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.تأكد من مشاهدة الفيديوهات الأخرى في هذه السلسلة حيث نوضح كيفية إجراء عدوى زمنية باستخدام فيروس vaccinia، واستخلاص الـ RNA من العينات، وإجراءات التضخيم الخطي لعينات الـ RNA.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. جزء 1 من 3.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 1

بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 2 من 3.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 2

ويمكن تحديد العوامل المضيفة المشاركة في رواية عدوى فيروسية من خلال فقدان الجينوم على نطاق خلية مقرها الفحص رني الدالة.

فحوص للكشف عن العوامل رني المضيفة المعنية في الوقس عدوى فيروس باستخدام ذبابة الفاكهة خلايا

Oncolytic الفيروسات واعدة لمداواة السرطان. القدرة على التأكد من عينات الأنسجة infectability يعيش الحصول عليها من المرضى قبل العلاج هو ميزة فريدة من نوعها لهذا النهج العلاجي. هذا البروتوكول توضح كيفية معالجة الأنسجة...

فيفو السابقين العدوى من الأنسجة الحية مع الفيروسات Oncolytic

وصفنا بروتوكول لتحديد الأدوار الرئيسية للجزيئات إشارة المضيف في النسخ المتماثل للهربس التحللي نموذج، غاما هربس 68 (γHV68). استخدام سلالات الفئران المعدلة وراثيا والخلايا الليفية الجنينية لتكرار التحللي γHV68، وبروتوكول يسمح كل من توصيف المظهري والجزيئي للفيروس الاستجواب في استضافة التفاعلات في النسخ المتماثل التحللي الفيروسية.

تشريح المضيف للفيروسات التفاعل في النسخ المتماثل التحللي من الفيروسة الموديل

ووصف طريقة تتبع الخلايا العصبية مرتبطة synaptically. نستخدم TVA خصوصية خلية المنبع لبحث ما إذا كان السكان الخلية ذات الاهتمام يتلقى مساهمات من أنواع الخلايا متشابك تعريف وراثيا.

تتبع الفيروسية من الدوائر العصبية تعريف وراثيا

ويرد هنا وصف بروتوكول سريع ووحدات لتوليد فيروسات vaccinia المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الموسومة الفلورية في وقت واحد باستخدام طريقة الاختيار المهيمن العابر.

منهجية لتوليد كفاءة من البروتينات فيروس Vaccinia الموسومة الفلورية

وصفنا استخدام مراسل الفلورسنت فيروس اللقاحية التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من العدوى الفيروسية والتعبير الجيني من خلال التعبير مرحلة محددة من fluorophores مراسل متميزة طيفيا. نحن بالتفصيل طريقة القائمة على لوحة لتحديد بدقة المرحلة التي يتأثر تكاثر الفيروس ردا على تثبيط جزيء صغير.

اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني

نقدم هنا، البروتوكولات لتحديد إيمونومودولاتورس 1) الفيروسات المشفرة التي تروج للنسخ المتماثل المفصليات وعوامل المضيف 2) حقيقية النواة التي تقيد المفصليات النسخ المتماثل. تسمح هذه الأساليب المستندة إلى الأسفار والتلألؤ الباحثين سرعة الحصول على قراءات الكمية من النسخ المتماثل المفصليات في فحوصات التبسيط مع انخفاض نسب الإشارات إلى الضجيج.

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

ICP0 يخضع إزفاء النووية إلى هيولى خلال هامبورغ-1 العدوى. ولا يعرف الآلية الجزيئية لهذا الحدث. هنا يصف لنا استخدام مجهر [كنفوكل] كأداة لقياس حركة ICP0 في هامبورغ-1 العدوى، الذي يرسي الأساس لتحليل كمي إزفاء ICP0 في الدراسات الميكانيكية في المستقبل.

التحليل الزمني إزفاء النووية إلى هيولى بروتين الفيروس 1 الحلأ البسيط بالفحص المجهري [كنفوكل] إيمونوفلوريسسينت

تعلم تقنية وسم الحمض النووي الريبوزي المضاد باستخدام تقنية ربط الأصباغ الأمينية من خلايا هيلا المصابة بفيروس الجدري. تُعد هذه الطريقة أساسية لتحليل التعبير الجيني عبر المصفوفات الدقيقة في دراسات علم الفيروسات.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 3

استكشف المزيد من الفيديوهات