التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

في الواقع، ما سأفعله هو تثبيته هنا أولاً ثم استبداله. والآن سأقوم بعملية السحب، وسأحاول أن أكون رقيقاً قدر الإمكان. حسناً. سأنتظر بضع ثوانٍ فقط. حسناً. جيد.

تتمثل الميزات الهامة لشبكة تصوير نمط الحياة الخاصة بنا في أنها تعتمد على مجهر مقلوب، مما يعني أن العدسة الشيئية والعينات الموجودة هنا تقع في الأسفل. وبذلك تكون العدسة الشيئية موجهة للأعلى، ويكون المجهر بأكمله، أو عملياً المجهر بالكامل، بما في ذلك العدسات الشيئية والعينات، عند درجة حرارة 37 °C. لذا فإن كل شيء داخل هذا الصندوق البلاستيكي يكون عند درجة حرارة 37 °C.

ويوجد فوق المنصة مباشرةً مزيج من الهواء وCO2. وهو عبارة عن 5%CO2. لذا فإن الفكرة تكمن في أن العينة توجد فعلياً داخل خلية، فهي تشبه حاضنة الخلايا.

وبذلك يكون لدينا هذا الخلاط للهواء وCO2، حيث يتم ترطيبه وتسخينه ثم نقله عبر الأنابيب إلى العينة الموجودة على المنصة. حسناً، سنقوم اليوم بإجراء قياس الفلورة لقناة واحدة فقط، وهي فلورة GFP. هذا هو الخرطوم الذي يدخل منه CO2 بنسبة 5%CO2، وهو يثبت ببساطة في حامل المنصة.

هذا أمر مهم. ومن ثم يمكننا إغلاق هذه، وإزالتها، ثم ننتقل إلى الموضع الأول. وما سأفعله هو الذهاب إلى الحقل الأول، وهو عينة الضبط الخاصة بي، وسأختار المواضع بناءً على ما أراه على الشاشة.

لذا، سأحرص على النظر فعلياً عبر المجهر في كل بئر جديدة، لأن المستوى البؤري لكل بئر يختلف عن الآخر، حيث إن قاع الطبق ليس مسطحاً تماماً. لذا، ستحتاج إلى إجراء تعديلات دقيقة عند الانتقال من بئر إلى أخرى. حالياً، أنا في البئر الأولى، وما سأقوم به هو ضبط التركيز، لذا سأقوم فقط بتشغيل الضوء، أي الضوء النافذ للمجهر.

وأقوم بالتأكد من توجيه كل الضوء إلى العدسات العينية. لذا، أنظر من خلالها للتأكد من الحصول على مجال رؤية واضح ونقي. بعد ذلك، أقوم بإطفاء هذا الضوء وتشغيل ضوء الفلورسنت، للتأكد من أن الخلايا التي أفحصها تبدو سليمة وغير خاضعة للموت الخلوي المبرمج (apoptotic).

وبعد ذلك، أقوم بإيقاف تشغيل ذلك. وما سأفعله بعد ذلك هو الإرسال، لذا سأبدأ الآن في اختيار المواضع، وهو ما يعني أنني يجب أن أوجه مسار الضوء إلى الكاميرا. هذه هي الكاميرا هنا.

لذا، أقوم بضبط المجهر ليوجه كامل الضوء إلى الكاميرا، بحيث لا يظهر أي شيء في العدسات العينية. ما سأفعله هو اختيار مجموعة المرشحات المناسبة من خلال البرنامج الذي يتحكم في المجهر، وهي في حالتنا هذه psy، ومن ثم أقوم بتحديد وقت التعريض.

وأنا أعرف هذه الخلايا جيداً، وأعلم أنها تتطلب وقت تعريض يبلغ 0.2 second. لذا، هذا ما أوجه البرنامج للقيام به. ومن ثم سأضغط على زر التركيز (focus).

هذا هو، وهو حي أساساً. سيضيء المصباح ويمكنك، أوه، لا أعرف ما إذا كان بإمكانك رؤية الخلايا، ولكن السبب في أن هذا المجال جيد هو لأن جميع الخلايا، حتى من حيث فلورتها، لا توجد خلايا استماتية. تميل الخلايا الاستماتية إلى أن تكون ساطعة جداً، ولا توجد شوائب أو أوساخ في المجال.

ويمكنكم أن تروا أنها في الواقع، هذه خلية في الطور الاستوائي وتلك أيضاً خلية في الطور الاستوائي، أما تلك فهي خلية ربما خرجت للتو من عملية الانقسام الفتيلي. ويمكنني معرفة ذلك لأن مجموعتي الكروماتين هاتين تبدوان موجهتين بدقة تجاه بعضهما البعض، كما لو أنها خرجت للتو من طور an.

إذًا، هذا مجال رؤية جيد. والآن، وبعد أن تأكدت من أن وقت التعريض ومجموعة المرشحات صحيحة، وهذا سيعتمد على البرنامج المستخدم، سأقوم بتحديد المواقع، والآن قام البرنامج بحفظ إحداثيات الموضع X وY وZ لهذا المجال. وعندما أختار مجالًا آخر، سأقوم بفتح الغالق وأرى ما يظهر على الشاشة، وسأختار المجالات بناءً على ذلك بدلاً من النظر المباشر في المجال.

لذا، لا أرى أيًا من منشطاتي هناك. ولكن مرة أخرى، حتى وإن كانت متمركزة بشكل جيد، فإن هذه الخلايا ستمر عبر جهاز PS الخاص بي، سأواصل، إليكم مثال جيد هنا. هذا مثال جيد على ما سأتجنبه، هل ترون مدى سطوع ذلك؟

هذا السطوع شديد جداً. ومن المرجح أن تكون هذه بقايا خلية ميتة مبرمجياً (apoptotic cell). والسبب في تجنبي لذلك هو أنه نظراً لشدة سطوعها، فعندما يقوم البرنامج بالتركيز التلقائي، سيركز فقط على تلك النقطة ولن تكون في نفس المستوى مع بقية هذه الخلايا.

وبالتالي لن أحصل على أي معلومات من ذلك الحقل. يبدو هذا جيداً. يوجد هنا طور تمهيدي متأخر (pro metaphase)، وهذا طور استوائي (metaphase).

لذلك، سأقوم بأخذ ثلاث وضعيات لكل بئر. لقد كانت ثلاث وضعيات والآن سأنتقل إلى البئر التالي، لذا ما سأفعله على الأرجح هو التقاط الصور كل 10 دقائق؛ حيث يمثل ذلك حلاً وسطاً.

دائمًا ما يكون التصوير الحيوي بمثابة عملية موازنة، أليس كذلك؟ حيث يتعين عليك إجراء التصوير مع الحفاظ على صحة الخلايا في الوقت ذاته، خاصة إذا كنت مهتمًا بالانقسام الفتيلي. لذا، يجب عليك تقليل تعرض الخلايا للخطوط الفلورية إلى أدنى حد.

ولكن، بما أنك ترغب في الحصول على معلومات، فإنه يتعين عليك التقاط الصور، لذا يجب عليك التوصل إلى حل وسط، واتخاذ قرار بشأن ما تريد تصويره، ونوع المعلومات التي تود التقاطها. وبالنسبة لأغراضنا، فإن عملية الانقسام الفتيلي تستغرق عادةً حوالي ساعة واحدة.

لذا، إذا كنا نعتمد فواصل زمنية مدتها 10 دقائق، فإن ذلك يعد جيداً للغاية. حيث يمكننا رؤية الطور التمهيدي، والطور الاستوائي، والطور الانفصالي، كما يمكننا تحديد متى تكون هناك معالجات أو عقاقير أو siRNAs تؤثر على مراحل دورة الخلية المحددة هذه. لذا، فإن هذا يكفي لأغراضنا، ولكننا نطمح دائماً إلى المزيد.

نرغب دائماً في الحصول على المزيد من المواضع، أو دقة أعلى في الوقت والفاصل الزمني، أو ما شابه ذلك؛ لذا فإن الأمر يتطلب تسوية. والآن، سأضغط على زر البدء.

وبناءً على ذلك، يقوم برنامجنا بإجراء عملية ضبط تركيز تلقائي في المرحلة الأولى. لذا، بمجرد الضغط على زر البدء، سيبدأ الضبط التلقائي للتركيز، وستلاحظ أن الغالق يفتح ويغلق أثناء عملية التركيز التلقائي. سأقوم الآن بالضغط على زر البدء.

هذا هو فتح وإغلاق الغالق. يعمل المحرك Z حاليًا في محاولة لإيجاد المستوى الذي يتميز بأعلى تباين، والذي سيكون الأكثر دقة في التركيز. يمكنك أن تلاحظ على الشاشة عملية البحث المتكررة عن أفضل مستوى تركيز، وهو أمر قد يكون مثيرًا للقلق.

لذا فإن ما يقوم به هو تشغيل محرك Z للعثور على المستوى الأكثر تركيزاً، أو الأكثر وضوحاً في الصورة. ثم يقوم بالتقاط صورة هناك ويحفظ موضع Z هذا، وبعد ذلك سنستخدم موضع Z ذاته للمسارات الاثني عشر التالية.

وبعد ذلك، سنقوم بعملية التركيز التلقائي مرة أخرى. ما نوع التجارب التي يجرونها؟ حسناً، يهتم مختبرنا في الغالب بفهم العوامل التي تنظم التقدم الانقسامي، أو على الأقل، هذا هو الأمر الذي أهتم بفهمه أكثر من غيره.

من خلال التصوير الحي للخلايا، وخاصة باستخدام مجهر التصوير طويل الأمد متعدد المواضع الخاص بنا، يمكنك تصوير الخلايا لمدة يومين أو ثلاثة أيام وهي تدخل في مرحلة الانقسام الفتيلي (mitosis)، كما يمكنك تصوير جولات متعددة من الانقسام الفتيلي لفهم العملية. وبعد ذلك، يمكنك إضافة عقاقير أو جزيئات RNA أو أي نوع من التدخلات على الخلايا التي ترغب في دراستها، مما يتيح لك فهم كيفية أهمية تلك العقاقير أو الجينات في تنظيم تقدم الانقسام الفتيلي.

نظرًا لأن هذا العمل لا يقتصر على الخلايا المثبتة بل يشمل الخلايا الحية، يمكنك فهم متى تحتاج إلى إحداث اضطراب للتأثير على الانقسام الفتيلى أو تحديد أي مرحلة من مراحل الانقسام الفتيلى قد تأثرت. لذا فهو فعال للغاية من هذا الجانب. ما هي العناصر التقنية الرئيسية لهذه التجارب؟

ما هي المشكلات المحتملة؟ حسناً، أكبر مشكلة بجانب إعداد الجهاز، علماً أن إعداد الجهاز ليس بالأمر الهين. يمتلك الكثير من الناس الجهاز، ولكن تكمن الصعوبة في التأكد من أنه يعمل بشكل جيد للتطبيق الخاص بك.

إن العنصر المادي ليس، كما تعلم، بسيطاً. فهناك عملية إعداد الجهاز، ثم بمجرد جمع البيانات، تظهر مشكلة حقيقية في تحليل البيانات. الأمر يتطلب التعامل مع هذه المقاطع المصورة؛ فإذا كنت تجمع 40 مقطعاً، كل منها يحتوي على 30 خلية، أي أن لديك 40 مجالاً قمت بتصويرها ويحتوي كل مجال منها على 30 خلية، فعندئذٍ يتعين عليك الجلوس مع كل مقطع من هذه المقاطع وفحص كل خلية من تلك الخلايا الموجودة في ذلك المقطع.

لذا، فإن تحليل البيانات يستغرق وقتاً طويلاً جداً؛ حيث يستغرق تحليل البيانات التي استغرق جمعها يومين فترة تصل إلى أسبوع كامل. وهذا يمثل عقبة كبيرة جداً أمام جمع كميات ضخمة من البيانات.

لذا، بينما تتوفر عملية جمع البيانات بإنتاجية عالية، إلا أن التحليل ليس كذلك. لذا، ماذا يمكنك أن تفعل لجعل هذه التجربة ذات إنتاجية عالية حقاً؟ يقوم مختبرنا حالياً بتطوير برنامج يقوم بتحليل البيانات تلقائياً.

وهو برنامج جيد للغاية، رغم أنه ليس مثاليًا. تظل العين البشرية دائمًا هي الأفضل، لكن البرنامج يقترب من ذلك.

إذًا، ما هي التطبيقات المثيرة للاهتمام لهذه التجربة؟ هل هناك مجالات أخرى يمكن ذكرها؟ بخلاف انقسام الخلايا؟

تقصد من أجل، أوه، من أجل التصوير الحي للخلايا؟ نعم. حسنًا، يمكنك إجراء اختبارات حركية الخلايا. ويمكنك، اعتمادًا على نوع المجهر المستخدم، أن تلاحظ كيف تتحرك الخلايا، كما يمكنك مراقبة تطور الورم إذا أردت ذلك حقًا.

ولكن هناك، إذا توفر لديك إعداد التصوير المناسب، فلن تكون محدوداً بأي شيء تقريباً. يتصادف أن المجهر الخاص بنا ذو مجال واسع ونستخدم عدسة شيئية 20x. لذا فهو إعداد منخفض الدقة إلى حد ما، ولكنه كافٍ لما نحتاج إلى رؤيته.

لذا هناك بالفعل، ولكن بالتأكيد لن تكون مقيداً. فأي تجربة ذات طبيعة ديناميكية، وهو ما ينطبق على علم الأحياء، ستستفيد حقاً من التصوير الحي. لذا فإن تصوير الكالسيوم، رغم عدم إمكانية إجرائه على جهازنا، يُعد تصويراً لخلايا حية.

ستحتاج بالتأكيد إلى التصوير الحي للخلايا من أجل ذلك. كما ذكرت، فإن المقايسات المرضية ومقايسات الحركة وهذه الأنواع من الاختبارات ستستفيد حقاً من التصوير الحي للخلايا. هل تود أن تتحدث قليلاً عن خبرتك السابقة؟

كم من الوقت قضيت في العمل على هذه التقنيات؟ وما الذي كنت تعمل عليه قبل ذلك؟ واو. لذا، في مرحلة الدكتوراه، لم أعمل.

لقد أجريت الكثير من الفحوصات باستخدام المجهر البؤري، ولكن لم يسبق لي إجراء تصوير حي. ولذلك، خلال فترة أبحاث ما بعد الدكتوراه، ساعدت الدكتور كينج في الحصول على هذا الجهاز الذي استخدمناه لإعداد هذه الشظايا وتفعيله وبدء تشغيله. وبناءً على ذلك، اكتسبت خلال فترة أبحاث ما بعد الدكتوراه خبرة كبيرة في كل من التصوير بالحقل الواسع مع التصوير الزمني المتلاحق باستخدام مجهرنا، وهو المجهر ذو الحقل الواسع، وكذلك التصوير الزمني المتلاحق باستخدام المجهر البؤري.

وأود أن أقول إنها قوية حقاً؛ فهي تمنحك الكثير من المعلومات، ولكن ليس من السهل جعلها تعمل بشكل مثالي. لذا فهي تتطلب بالفعل الكثير من التركيز والاهتمام بالتفاصيل في كل خطوة صغيرة من العملية.

ومع ذلك، ستظل هناك بعض المشكلات. لذا فهو تطبيق صعب، ولكن يمكنك حقاً الاستفادة منه؛ فإذا كان هو ما تحتاجه لدراسة مسألتك، مسألتك العلمية، فإنه حينئذٍ يكون ذا قيمة لا تقدر بثمن من هذا المنظور، ولكنه صعب. لذا، ابحث عن شخص يتقن القيام بذلك واستعن به.

هذه هي نصيحتي. إنها مفيدة جداً.