تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

يبدأ هذا الإجراء بزراعة سلالة الطعم في الوسائط التي تحتوي على أحماض أمينية طبيعية في سلالة التحكم SLAC والنظائر الثقيلة ليسين وأرجينين. يتم خلط كميات متساوية من كلتا السلالتين وتحللها عن طريق الطحن والنيتروجين السائل المحللة الخام ، والتي يتم تكويرها أولا بواسطة أجهزة الطرد المركزي ثم يتم تطهيرها عن طريق الارتباط بخرز الأسفار. ثم يتم ربط محللة الخلية بخرز IgG.

التلميح إلى البروتينات المرتبطة بخرز IgG بواسطة البروتياز والانقسام والترسيب. العينة جاهزة الآن للتحليل بواسطة قياس الطيف الكتلي. مرحبا ، أنا جيسي تشاو من المختبر الوحيد في قسم البيولوجيا البيئية الخلوية في معهد علوم الحياة بجامعة كولومبيا البريطانية.

اليوم أعرض لك إجراء للتحليل البروتيني الكمي يسمى سيلاك. جنبا إلى جنب مع تنقية التقارب. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة مجمعات البروتين.

لذلك دعونا نبدأ في هذا الإجراء ، تحتوي سلالة الطعم على أحماض أمينية طبيعية بينما تحتوي سلالة التحكم SLAC على نظائر ثقيلة وليسين وأرجينين. للبدء ، أولا ، قم بزراعة لترا واحدا ، كل من سلالة الطعم وسلالة التحكم بشكل منفصل إلى القيمة الموضحة على شاشتك. بعد ذلك ، صب المزرعة في أنابيب الطرد المركزي Nalgene سعة 500 مل.

موازنة الحمل في خلايا الحبيبات عند 2, 580 RCF صب الوسائط وإعادة تعليق الحبيبات. مع 50 مل من البارد D H2O أثناء نقل الخلايا إلى 50 ملليلتر ، أنابيب الطرد المركزي ، تقوم أجهزة الطرد المركزي بالأنابيب لحبيبات الخلايا عند 3000 RCF. في هذه المرحلة ، يمكنك تجميد الحبيبات عند سالب 80 درجة مئوية.

المهم أن تتذكر مطابقة ثقافة سلالة التحكم مع ثقافة سلالة الطعم في واحد لواحد عن طريق وزن الحبيبات الجافة. أعد تعليق كل حبيبات خلية في 10 مل من NP 40 المخزن المؤقت مع كوكتيل مثبط البروتياز من واحد إلى 2000. امزج مزرعتي الخلية عن طريق صب أنبوب واحد مباشرة إلى الآخر.

لبدء طحن الخلايا أولا ، اسكب النيتروجين السائل في الملاط المبرد مسبقا واتركه يتبخر تماما. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من الخلايا إلى الهاون. صب بعض النيتروجين السائل لتجميد الخلايا.

طحن الخلايا حتى تصبح الخلايا ناعمة. ذرور. كرر العملية حتى يتم طحن جميع الخلايا. تأكد من عدم السماح للخلايا بالذوبان.

أضف النيتروجين السائل عند الضرورة. بعد ذلك ، انقل المسحوق إلى دورق مثلج بارد وقم بإذابة درجة حرارة الغرفة. عندما تبدأ الحواف في الذوبان ، أضف 20 مل من المخزن المؤقت NP 40 مع واحد إلى 200 صورة بعد إذابته.

انقل المحللة الخام إلى أنابيب Nalgene سعة 40 ملليلتر وتدور بسرعة 16,000 دورة في الدقيقة في دوار Sovos SA 600 لمدة 30 دقيقة. أثناء الانتظار ، خذ 300 ميكرولتر من SROs اثنين من حبة B واغسل الخرزات في 300 ميكرولتر من NP 40 العازلة ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بتعليق الخرزات في مخازن مؤقتة سعة 300 ميكرولتر بحيث تكون في ملاط فردي.

الخطوة التالية هي التنظيف المسبق لمحللة الخلية. للقيام بذلك أولا ، انقل السوبر ناتين إلى أنبوب جديد وأضف حبة Spheros اثنين من B. احتضن على منصة دوارة في غرفة باردة لمدة 30 دقيقة.

أثناء الحضانة ، خذ 300 ميكرولتر من IgG SROs ستة حبات واغسل الخرزات في 300 ميكرولتر من NP 40 العازلة ثلاث مرات. ثم قم بتعليق الخرزات في 300 ميكرولتر مخازن بحيث تكون في ملاط فردي. بعد الحضانة ، قم بتكبيل SROs.

اثنان تكون الخرز في. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. تذكر أن تحفظ حصة من محللة الخلية للنشاف الغربي لاحقا.

ثم أضف حبات IgG. افصل المحتويات إلى أنبوبين لمزيد من الارتباط الفعال ، واحتضن على منصة دوارة في غرفة باردة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، اجمع الخرزات في عمود كروماتوغرافيا عند أربع درجات مئوية.

تأكد من حفظ حصة من الفصيل غير المقيد. اغسل الخرز ب 10 ملليلتر. NP 40 المخزن المؤقت.

بعد ذلك ، اغسل الخرز بثلاثة ملليلتر. مخزن مؤقت TEVC. مرة أخرى ، تذكر أن تحفظ جزءا من الخرز.

سيعكس هذا كفاءة الربط لتخلص من الخرز. أولا ، أضف خمسة ميكرولترات من A-C-T-E-V إلى مليلتر واحد من المخزن المؤقت TEVC. أضف مخزن TEVC المؤقت إلى الخرزات واخلطها.

انقل المحتويات إلى أنبوبين EINOR سعة 1.5 مليلتر من خلط أكثر كفاءة واحتضانها على منصة دوارة في غرفة باردة طوال الليل. بعد ذلك ، قم بتدوير الخرزات ونقل المصفاة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. اغسل الخرزات ب 0.5 مل إضافية من عازلة TEVC بعد الغسيل.

اجمع بين الثمانية في أنبوب واحد. يجب أن يكون لديك 1.5 مل من ELU ثمانية في المجموع. احفظ حصة من TEV Elu ثمانية للتعليل.

اضبط الحصص على 25٪ TCA مع TCA مائة بالمائة. للقيام بذلك ، افصل 1.5 ملليلتر LU ثمانية إلى أنبوبين سعة 750 ميكرولتر لكل منهما. أضف 250 ميكرولتر من TCA بنسبة 100٪ إلى الأنبوب.

يجب أن يتحول المحلول الخاص بك إلى حليبي. بعد ذلك ، ضعه على الجليد لمدة 30 دقيقة. دوامة الخليط بشكل دوري بعد الحضانة.

تدور بأقصى سرعة في جهاز الطرد المركزي المنضدية في غرفة باردة لمدة 30 دقيقة. يغسل مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من الأسيتون المثلج البارد الذي يحتوي على 0.05 حمض الهيدروكلوريك العادي. ثم تدور لمدة خمس دقائق بأقصى سرعة عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، اغسلها مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من الثلج البارد والأسيتون وتدور لمدة خمس دقائق بسرعة قصوى عند أربع درجات مئوية. بعد الغزل ، قم بإزالة الأسيتون والحبيبات الجافة بعناية لتلوين الفضة. أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS مرة واحدة.

إذا كنت تخطط لاستخدام البروتين المترسب للتحليل القائم على قياس الطيف الكتلي ، فمن المستحسن أن ترسبه باستخدام الإيثانول. للقيام بذلك أولا ، أضف 20 ميكروغراما من الجليكوجين بعد ذلك قم بتخفيف العينات خمس مرات باستخدام مائة بالمائة من الإيثانول واضبطها على 50 ملي مولار بيكربونات الصوديوم مع مخزون 2.5 مولار عند درجة الحموضة 5.0. امزج المحلول عن طريق قلب الأنبوب.

اتركه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، قم بتقسيم المحتويات إلى أنبوبين من einor. بيليه البروتين المترسب عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 12 ، 000 GS في درجة حرارة الغرفة.

يجب أن يشتمل الفصل المحفوظ أثناء إجراء التنقية على محللة الخلية التي تم تطهيرها مسبقا ، والكسر المرتبط ، والكسر غير المرتبط ، والكسر المراوغ. نوصي بتحليل محتويات البروتين في الحصص المذكورة أعلاه عن طريق النشاف الغربي باستخدام الجسم المضاد Antit TAP أو تلطيخ الفضة لتعكس كفاءة الربط والتصفية للتجربة. في هذا الجل الفضي الصبغة المنقى SCS اثنين من الصنبور عند تفاعله ، تم تصور الشركاء ومقارنتهم بعنصر تحكم غير مميز في هذه اللطخة الغربية.

تم تحليل الفصائل المختلفة التي تم التقاطها أثناء تنقية صنبور SCS اثنين بواسطة النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة للصنبور Antit. لاحظ أن صنبور SCS اثنين هاجروا بوزن جزيئي أقل بعد انقسام البروتياز TEV ، ولم يتبق صنبور S SCS على حبات IgG بعد الشطف. هذا أكد أن التنقية كانت عالية الكفاءة.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية تنقية مجمعات البروتين عن طريق تنقية التقارب باستخدام حبات IgG. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التأكد من مطابقة السلالة الأساسية وسلالة التحكم بوزن القشرة الجافة قبل البدء في إجراء التنقية. نظرا لأن LAC توفر لنا قياسات غير متحيزة ومضادة لشركاء ربط البروتين ، فإننا نقوم فقط بتنفيذ المرحلة الأولى من تنقية الصنبور لتقليل فقدان العينة.

إذا واجهت كميات كبيرة من الربط غير المحدد ، فقد ترغب في تنفيذ البروتوكول بأكمله ، والذي يمكن العثور عليه في دليل ميناء الزنبرك البارد. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.

مرحبا ، هيا يا مارك. آه ، اذهب.