تنسيق كا ^{2 +} الكشف العابر في العضلات الملساء

أولاً، يتم تحضير محلول تحميل الكالسيوم، وتسخينه، وتمرير فقاعات الهواء فيه. ثم تُستأصل المثانة البولية، وتُفتح، وتُثبت بالدبابيس بشكل مسطح، ويؤخذ شريط من العضلة الدافعة. يُضاف شريط العضلة الدافعة إلى محلول التحميل، ويُحضن ثم يُشطف، ويُثبت بالدبابيس بشكل مسطح.

يتم استثارة مؤشر الكالسيوم في الطبقة الرابعة داخل النسيج بواسطة ضوء الليزر، ويتم التقاط الضوء المنبعث كنتيجة لذلك. تُحلل المقاطع المرئية المكونة من إطارات فردية من خلال مقارنة الإطارات المتتالية، ثم يتم طرح الخلفية.

تحدد عتبة حافة الخلية المواضع التي يمكن العثور فيها على الأحداث، ويتم حساب النسبة بين الأدمغة المتتالية. وإذا كانت الأحداث المتبقية تطابق معايير محددة مسبقاً، يتم تمييزها وتصنيفها. مرحباً، اسمي جون يونغ من مختبرات كيث براين وتوم كينان في قسم علم الصيدلة بجامعة أكسفورد.

أنا روب أموس، وأنا أيضاً من مختبري Brain وCanne، واسمي كيث برين. اليوم، سيقوم جون وروب بشرح تقنية تصوير الكالسيوم في العضلات الملساء. نحن نستخدم هذه التقنية في مختبرنا لدراسة إفراز الناقلات العصبية من الأعصاب اللاإرادية وتأثيرها على العضلات الملساء.

فلنبدأ الآن. يتوفر مؤشر الكالسيوم organ green 488 BAFTA 1:00 AM في قوارير سعة 500 µL تحتوي على 50 µg من المسحوق. لتحضير مؤشر الكالسيوم، أضف 40 µL من محلول Onic F1 27 إلى المسحوق ورجّ بلطف لمدة 30 ثانية، بعد ذلك أضف 460 µL من محلول الملح الفسيولوجي PSS، ورجّ بلطف لمدة 30 ثانية أخرى.

يوفر المحلول النهائي، بتركيز 10 µM من organ green 488 BAFTA، أربع حصص حجم كل منها 125 µL. يجب تجنب التعرض للضوء وتخزين المحلول عند درجة حرارة 20- °C قبل تشريح النسيج المستهدف.

أخرج مؤشر الكالسيوم من المجمد واتركه يذوب في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح سائلاً. ضع 1 mL من محلول PSS في أنبوب اختبار وفي حمام مائي عند درجة حرارة 33 °C. قم بتثبيت فقاعة (bubbler) في أنبوب الاختبار باستخدام سدادة، أو يمكنك أيضاً استخدام perfil، ثم قم بالفقاعة بمزيج من 95% oxygen و 5% carbon dioxide بمعدل ظهور فقاعة واحدة تقريباً في الثانية.

قم بتشريح العضو العضلي الأملس من الحيوان. في هذه الحالة، هي المثانة البولية لفأر. ضع العضو في حوالي 50 millimeters من PSS لغسله، وبعد غسل النسيج بعناية، قم بإزالة الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة.

يتم التشريح والفتح وفقاً لنمط العضلات الملساء للمثانة البولية. افتح طولياً من عنق المثانة، من الطرف السفلي وصولاً إلى قمة القبة في الطرف القحفي. قم بتجهيز أربعة شرائح، يتراوح طول كل منها بين 6 إلى 8 mm وعرضها بين 1 إلى 2 mm على طول السطح الظهري للمستودع، مع القص في اتجاه حزم العضلات السائدة.

ضع النسيج المُشرّح ومحلول PSS الذي تم تدفئته مسبقاً ومشبع بالفقاعات لتحميل مؤشر الكالسيوم، بكمية 125 µL من مادة organ green 488 B بتركيز 10 µM إلى النسيج الموجود في أنبوب الاختبار، ورجّه قليلاً باليد للمزج. أعِد الأنبوب إلى الحمام المائي. استأنف عملية التدفق الفقاعي وغطِّ الحمام المائي بورقة من رقائق الألومنيوم.

تختلف المدة التي تستغرقها الأنسجة لامتصاص كمية كافية من مؤشر الكالسيوم باختلاف حجم النسيج وسماكة طبقة العضلات الملساء. فعلى سبيل المثال، تستغرق هذه العملية 70 دقيقة بالنسبة للعضلة الدافعة في الفأر والعضلة العاصرة الخارجية في الجرذ، بينما يتم التحضين لمدة 120 دقيقة بالنسبة للعضلة الدافعة في الجرذ والأوردة الذيلية في الفأر.

بمجرد تحميل النسيج بمؤشر الكالسيوم، يمكن تحضيره للفحص المجهري. أولاً، اشطف النسيج في محلول PSS المـُفقاع لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بتثبيت النسيج في طبق تحضير مبطن بواقٍ من نوع S guard.

مدّ النسيج قليلاً لتشكيل ورقة مسطحة. قم بتثبيت النسيج باستخدام قطع قصيرة، على سبيل المثال، 2 mm من سلك فضي بقطر 25 إلى 50 µm، وأدخل الدبابيس بزاوية مائلة.

تجنب استخدام دبابيس يزيد طولها عن بضعة مليمترات لأنها قد تخدش العدسة الشيئية. يعد تثبيت النسيج بالدبابيس بعناية أمراً هاماً لتقليل الانكماش التلقائي للنسيج وتسهيل تحديد موقع مناسب للتصوير. بعد تثبيت النسيج، ضع طبق التحضير على منصة المجهر.

احرص على ألا يخرج الـ PSS من المنطقة المبطنة بحواجز السيليكون في الطبق، لأن ذلك قد يؤدي إلى تغطية مساحة كبيرة بالـ PSS. وعندما يبدأ الإفراط في التروية (superfusion) لأغراض العرض التوضيحي، سيتم تنفيذ الخطوات التالية في الضوء.

يرجى ملاحظة أن هذه التجارب تُجرى عادةً في الظلام. قم بتشغيل المضخة من أجل التروية المستمرة للمستحضر. مع استخدام PSS، غالباً ما يتم اعتماد معدل تدفق قدره 100 milliliters per hour.

قم بتشغيل وحدة التسخين، وضع أنابيب التدفق الداخل والخارج ومسبار درجة الحرارة على طبق التحضير، مع تثبيت كل منها في الشريط المعدني بواسطة المغناطيس الموجود في قاعدتها. سيحدد ارتفاع طرف أنبوب التدفق الخارج عمق PSS. توخَّ الحذر للتأكد من أن التدفق الخارج يقوم بالفعل بإزالة PSS، حيث قد لا يحدث ذلك أحياناً.

في البداية، اضبط درجة الحرارة في وحدة التسخين للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة التي تتراوح بين 33 و 35 درجة Celsius. اترك النسيج ليتوازن حرارياً لمدة 10 دقائق على الأقل باستخدام عدسة شيئية منخفضة القوة، 10 أو 20 مرة.

استخدم الفلورة فوق البؤرية أو التحفيز بضوء أزرق لعرض العضلات الملساء وتحديد المنطقة المناسبة للمراقبة. وبما أن التعرض للإثارة والإضاءة سيؤدي إلى تبييض المؤشر ضوئيًا، تجنب استخدامه لأكثر من بضع ثوانٍ في المرة الواحدة.

تجنب الرؤية في المناطق ذات البنى الساطعة لأنها قد تتسبب في عدد كبير من النتائج الإيجابية الكاذبة في خوارزمية الكشف عن الصور. حاول اختيار موقع يتميز بأدنى حد من الحركة وبعدد كبير من خلايا العضلات الملساء في الحقل. بمجرد اختيار الموقع المراد تصويره، انتقل إلى عدسة شيئية ذات قوة تكبير أعلى مثل 40x.

قم بتدوير المنصة أو المحور البصري بحيث تكون خلية العضلات الملساء أو الخلايا في وضع أفقي، أي موازية لمحور المسح السريع. وبذلك تصبح خلايا العضلات الملساء جاهزة للتصوير باستخدام المجهر البؤري.

في هذا البروتوكول، نستخدم مجهر Leica SP two confocal العمودي. أغلق الثقب (pinhole) ليكون بمقدار قرص هوائي واحد (one airy disc). اضبط قدرة الليزر بين 25 و35% على مرشح custo optic القابل للضبط.

تعتبر هذه القيمة بمثابة توازن بين السطوع والبهتان الضوئي. وللتحضير لتحليل البيانات، قم بتنزيل وتثبيت برنامج Image J. قم بتنزيل الإصدار الخاص بنظام التشغيل لديك، ثم قم بالتحديث إلى أحدث إصدار عن طريق تنزيل أحدث ملف jar الخاص ببرنامج ImageJ لاستبدال الملف القديم. بعد ذلك، قم بتنزيل ملف jar الخاص بـ Excel writer وتثبيته في دليل plugins jar.

انسخ هذه الملفات إلى دليل المكونات الإضافية (plugins directory). قم بتثبيت كل من هذه النصوص البرمجية باستخدام ماكرو المكونات الإضافية في وظيفة التثبيت الخاصة ببرنامج ImageJ. يُسمى البرنامج الخاص بمجهر Leica SP2 confocal الذي نستخدمه Leica.

يقوم نظام LCS بحفظ الإطارات الفردية لكل سلسلة كملف منفصل. لإعادة بناء السلسلة، تأكد من وجود جميع الإطارات المراد إعادة بنائها في مجلد واحد.

على سبيل المثال، مجلد بيانات tiffs. ثم اختر ماكرو Leica SP two stacker من قائمة plugins macros. اختر الدليل الرئيسي، وفي هذه الحالة يكون مجلد البيانات.

اختر المجلد المطلوب من القائمة المنسدلة. في هذه الحالة، حدد دليل المخرجات لملفات tiffs أو قم بإنشاء دليل جديد. على سبيل المثال، مجلد البيانات stacks.

سيعمل السكربت بعد ذلك على إعادة بناء السلاسل من الإطارات الفردية لتصحيح الحركة. نحن نستخدم خوارزمية متاحة مجانًا تعمل على محاذاة أو مطابقة الإطارات ضمن سلسلة المجموعات التي تم تنزيلها، وهي rig و turbo reg. انسخ الملفات الخاصة بكل منهما إلى مجلد stacks.

قم بتحميل مجموعة الصور المراد معالجتها، ثم انتقل إلى إطار يظهر بوضوح مجال الاهتمام؛ حيث سيتم محاذاة الإطارات الأخرى وفقاً لهذا الإطار المرجعي. بعد ذلك، انتقل إلى plugins stacks.

تسجيل المكدس. جرب كل عملية من عمليات التحويل المختلفة لتحديد الأكثر فعالية لكل موقع. ستتفاوت العوامل المصورة التي تؤثر على اكتشاف العابرات الكلسية عن طريق قياس خصائص معينة، وهي بارامترات الجسيمات لكل موقع.

يتم زيادة حساسية وخصوصية الكشف. وبناءً على ذلك، سنقوم بحساب العتبة لكل موقع، بما في ذلك العتبة المطروحة للنسبة وعتبة حافة الخلية. للبدء، انتقل إلى plugins، ثم macros، ثم install واختر jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. بعد ذلك، انتقل إلى plugins ثم macros ثم load stack.

اختر سلسلة واحسب معاملات الجسيمات التالية. لحساب عتبة الطرح (subtracted)، حدد منطقة اهتمام مستطيلة فوق ما تعتقد أنه قياس الخلفية، وسجل المتوسط. ولحساب عتبة النسبة (ratio)، حدد منطقة اهتمام مستطيلة حول منطقة مسطحة بصرياً في خلية أو خلايا العضلات الملساء.

قم بقياس وتسجيل المتوسط والانحراف المعياري. كرر العملية مرتين إضافيتين، أو يمكنك رسم ثلاثة مربعات في آن واحد بالضغط على مفتاح shift. احسب وسجل قيمة العتبة للنسبة.

احسب الانحراف المعياري مقسوماً على المتوسط مضافاً إليه واحد، ثم اضرب النتيجة في 32. وعند حساب متوسط القيم من المكررات الثلاثة، يكون العامل 32 ضرورياً لمراعاة خوارزمية تحديد النسب حيث يتم تعيين القيمة التي لا تظهر تغيراً عن الإطار السابق كقيمة صحيحة قدرها 32. وهذا يوفر نطاقاً ديناميكياً جيداً للكشف عن الزيادات والنقصان في النسبة.

بالنسبة لصورة ذات ثمانية بت، اختر "ضبط عتبة الصورة" (image adjust threshold). اختر "الأبيض والأسود". حدد القيمة تحت الحد العلوي للمنزلق ودون القيمة المقابلة.

هذا يقع على يمين المنزلق. سيتم حساب الأحداث التي تقع في المناطق السوداء فقط. انقر فوق إعادة الضبط.

بعد حساب عتبة الطرح لنسبة النسبة وعتبة حافة الخلية، يمكننا الآن تحليل مجموعات الصور المتراكمة. حدد موقع المجموعات المراد تحليلها، مع اختيار سلسلة واحدة فقط في هذه المرحلة.

هذا هو الملف الأول، ويجب أن يكون الملف الأخير هو نفسه. ثم حدد موقعاً لإخراج ملفات البيانات والمجموعات (stacks). على سبيل المثال، مجلد مخرجات البيانات.

أدخل قيم العتبة للطرح، وعتبة النسبة، وعتبة حافة الخلية. اترك الإعدادات الأخرى على قيمها الافتراضية. سينتج الخوارزمية نافذة مزدوجة العرض تظهر فيها السلسلة المعالجة على اليسار والأصلية على اليمين.

افتح هذا الملف من مجلد المخرجات وراجعه بعناية لتقييم عدد الإيجابيات الكاذبة والحالات التي لم يتم فيها اكتشاف أحداث مرئية بالعين المجردة. بالنسبة لكل سلسلة، ينتج الخوارزمي ملف Excel يفصل خصائص الحدث المكتشف مثل السعة والمساحة والموقع؛ ويمكن إزالة الإيجابيات الكاذبة التي يتم تحديدها من خلال مراجعة ملفات الصور التي يخرجها الخوارزمي يدويًا من ملف Excel هذا، على أن تلتزم بمعايير صارمة عند القيام بذلك.

هذا مقطع فيديو يوضح العبور الكالسيومي في العضلات الملساء. في هذا المثال، يتكون المقطع من 100 إطار فردي تم الحصول عليها بتردد خمسة هرتز. نقوم بتصوير العديد من هذه المقاطع في كل تجربة عند دراسة تأثير عقار معين، على سبيل المثال، على تردد العبور الكالسيومي.

نرى هنا العديد من النبضات الكلسية العفوية في خلايا العضلات الملساء. تظهر هنا نتيجة خوارزمية اكتشاف الجسيمات. فلكل سلسلة، تُنتج الخوارزمية ملف Excel يفصل خصائص الحدث المكتشف مثل السعة والمساحة والموقع.

لقد استعرضنا طريقة لتصوير تغيرات الكالسيوم في أعضاء العضلات الملساء مثل المثانة البولية، كما استعرضنا كيفية تحليل تلك التغيرات في الكالسيوم باستخدام خوارزمية قمنا بتطويرها في المختبر. ومن الأمور الهامة التي يجب تذكرها هي تحضير النسيج جيداً للتصوير الكالسيومي؛ ففي حالة النسيج الذي استعرضناه اليوم، يتضمن ذلك إزالة الأنسجة الضامة وإزالة أي دهون قد تحجب مجال الرؤية.

من المهم أيضاً تثبيت النسيج في شكل ورقة مسطحة. حسناً، نتمنى لكم التوفيق في تجاربكم وشكراً لكم على المشاهدة.