تنسيق كا ^{2 +} الكشف العابر في العضلات الملساء

أولا ، يتم تحضير محلول تحميل الكالسيوم وتسخينه وغليه. يتم تشريح المثانة البولية وفتحها وتثبيتها بشكل مسطح وأخذ شريط من المثانة. يضاف شريط التفريغ إلى محلول التحميل ، ويتم تحضينه وشطفه ، وتثبيته بشكل مسطح.

إثارة أرضية الكالسيوم الأربعة داخل الأنسجة بواسطة ضوء الليزر والضوء المنبعث الذي تم التقاطه الناتج. يتم تحليل الأفلام المكونة من إطارات فردية من خلال مقارنة الإطارات المتتالية. يتم طرح الخلفية.

عتبة حافة الخلية أين يمكن العثور على الأحداث ويتم أخذ نسبة بين الأدمغة المتتالية. إذا كانت الأحداث المتبقية تتطابق مع معايير محددة مسبقا، يتم تمييزها وتصنيفها. مرحبا ، اسمي جون يونغ من مختبرات كيث برين وتوم كينان في قسم علم الأدوية بجامعة أكسفورد.

أنا روب آموس ، أيضا من مختبرات Brain and Canne واسمي Keith Brain. اليوم ، سيظهر لك جون وروب تقنية تصوير الكالسيوم في العضلات الملساء. نستخدم هذا في مختبرنا لدراسة إطلاق الناقل العصبي من الأعصاب اللاإرادية وتأثيره على العضلات الملساء.

لذلك دعونا نبدأ. مؤشر الكالسيوم عضو أخضر ، 4 88 BAFTA 1:00 AM يأتي في قارورة 500 ميكرولتر تحتوي على 50 ميكروغرام من المسحوق. لتحضير مؤشر الكالسيوم عند 40 ميكرولتر من محلول Onic F1 27 إلى المسحوق ورجها برفق لمدة 30 ثانية بعد ذلك عند 460 ميكرولتر من محلول ملحي فسيولوجي PSS ، ورجه برفق لمدة 30 ثانية أخرى.

الحل النهائي ، 10 أضراس صغيرة من الأعضاء الخضراء. 4 88 BAFTA 1:00 AM يوفر أربعة حصص من 125 ميكرولتر لكل منها. تجنب التعرض للضوء وقم بتخزين المحلول عند سالب 20 درجة مئوية قبل تشريح الأنسجة المعنية.

قم بإزالة مؤشر الكالسيوم من الفريزر وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة بينما يكون مؤشر الكالسيوم غير موجود. ضع ملليلتر واحد من PSS في أنبوب اختبار وحمام مائي عند 33 درجة مئوية. قم بتأمين الفقاعات في أنبوب الاختبار باستخدام سدادة ، أو يمكنك أيضا استخدام perfil ثم الفقاعات بخليط 95٪ من الأكسجين إلى 5٪ من ثاني أكسيد الكربون بمعدل ظهور فقاعة واحدة في الثانية.

تشريح عضو العضلات الملساء من. في هذه الحالة ، تكون المثانة البولية من الفأر. ضع العضو في حوالي 50 ملم من PSS لغسله بعد غسل الأنسجة بعناية ، وقم بإزالة الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة بعناية.

تشريح الفتح وفقا لنوع لوريان العضلات الملساء للمثانة البولية. افتح طوليا من عنق المثانة ، ونهاية التدليل إلى أعلى القبة. نهاية الجمجمة قم بإعداد أربعة شرائط ، طولها من ستة إلى ثمانية ملليمترات وعرض واحد إلى ملليمترين على طول السطح الظهري لقطع الرافعة في اتجاه حزم العضلات المهيمنة.

ضع الأنسجة المقطعة و PSS قبل الحرب والفقاعات لتحميل مؤشر الكالسيوم عند 125 ميكرولتر من 10 ميكرومولار عضو أخضر ، 4 88 ب إلى 1:00 صباحا إلى الأنسجة الموجودة في أنبوب الاختبار ورجها قليلا باليد لخلطها. أعد الأنبوب إلى الحمام المائي. استأنف الفقاعات وقم بتغطية الحمام المائي بورقة من ورق الألمنيوم.

الوقت الذي تستغرقه الأنسجة الكافية لتناول مؤشر الكالسيوم باختلاف حجم الأنسجة وسمك طبقة العضلات الملساء. على سبيل المثال ، بالنسبة لثيران الفأر وثيران الفئران ، فهي 70 دقيقة. بينما بالنسبة لفئران detrusor و فأر VAs deens, نحن نحتضن لمدة 120 دقيقة.

بمجرد تحميل الأنسجة بمؤشر الكالسيوم ، يمكن تحضيرها للفحص المجهري. أولا ، اشطف المنديل في PSS فقاعات لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتركيب المنديل في طبق تحضير مبطن بواقي S.

تمديده قليلا لتشكيل ورقة مسطحة. قم بتثبيت الأنسجة باستخدام أطوال قصيرة. على سبيل المثال ، ملليمترين من السلك الفضي بقطر 25 إلى 50 ميكرومتر وإدخال المسامير بزاوية.

تجنب استخدام المسامير التي يزيد طولها عن بضعة ملليمترات لأنها قد تخدش الهدف. يعد التثبيت الدقيق للأنسجة أمرا مهما من تقليل تلقائية الأنسجة وتسهيل موقع مناسب للتصوير. بعد تثبيت الأنسجة ، ضع طبق التحضير على مرحلة المجهر.

احرص على ألا يهرب PSS من المنطقة المبطنة بواقي السيل. لأن هذا قد يؤدي إلى تغطية مساحة كبيرة في PSS. عندما يبدأ الصخ الفائق لأغراض العرض التوضيحي ، سيتم تنفيذ الخطوات التالية في الضوء.

يرجى ملاحظة أن هذه التجارب تجرى عادة في الظلام. قم بتشغيل المضخة من أجل دمج المستحضر بشكل فائق. مع PSS ، غالبا ما يتم استخدام معدل 100 مل في الساعة.

قم بتشغيل وحدة التسخين ، ضع أنابيب التدفق والتدفق ومسبار درجة الحرارة على طبق التحضير لتثبيت كل منها على الشريط المعدني بواسطة المغناطيس الموجود على قاعدته. سيحدد ارتفاع طرف أنبوب التدفق عمق PSS. احرص على التأكد من أن التدفق الخارج يزيل PSS بالفعل لأنه لا يحدث في بعض الأحيان.

البداية اضبط درجة الحرارة على وحدة السخان للوصول إلى درجة الحرارة المرغوبة بين 33 و 35 درجة مئوية. اسمح للأنسجة بالتوازن لمدة 10 دقائق على الأقل بهدف طاقة منخفضة. 10 أو 20 مرة.

استخدم مضان epi أو مثير بالضوء الأزرق لعرض العضلات الملساء وتحديد المنطقة المناسبة للمراقبة. منذ التعرض للإثارة ، ستعمل الإضاءة على تبييض المؤشر الضوئي. تجنب الاستخدام لأكثر من بضع ثوان في المرة الواحدة.

تجنب البصر باستخدام الهياكل الساطعة لأنها قد تسبب عددا كبيرا من الإيجابيات الخاطئة في خوارزمية اكتشاف الصور. حاول اختيار موقع به الحد الأدنى من الحركة وعدد كبير من خلايا العضلات الملساء في هذا المجال. بمجرد تحديد الموقع للصورة ، قم بالتبديل إلى هدف طاقة أعلى مثل 40 x.

قم بتدوير المرحلة أو المحور البصري بحيث تكون خلية العضلات الملساء أو الخلايا أفقية. هذا مواز لمحور المسح السريع. خلايا العضلات الملساء جاهزة الآن للتصوير عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

في هذا البروتوكول ، نستخدم مجهر متحد البؤر من Leica SP اثنين من المستقيمين. أغلق الثقب بقرص واحد جيد التهوية. اضبط طاقة الليزر بين 25 و 35٪ على مرشح custo البصري القابل للضبط.

هذه القيمة هي مقايضة بين السطوع وتبييض الصورة. للتحضير لتحليل البيانات ، قم بتنزيل الصورة وتثبيتها J.قم بتنزيل الإصدار الخاص بالنظام الأساسي ثم قم بالتحديث إلى أحدث إصدار عن طريق تنزيل أحدث ملف جرة ImageJ لاستبدال الملف القديم. بعد ذلك ، قم بتنزيل ملف جرة كاتب Excel وقم بتثبيته في دليل جرة المكونات الإضافية.

انسخ هذه الملفات إلى دليل المكونات الإضافية. قم بتثبيت كل من هذه البرامج النصية باستخدام وحدات ماكرو المكونات الإضافية. تثبيت وظيفة الصورة J.The البرنامج لمجهر Leica SP اثنين من المجهر متحد البؤر الذي نستخدمه يسمى Leica.

يحفظ LCS إطارات فردية لكل سلسلة كملف منفصل. لإعادة بناء السلسلة. تأكد من أن جميع الإطارات المراد إعادة إنشائها موجودة في مجلد واحد.

على سبيل المثال ، ملفات البيانات المتداخلة. ثم حدد ماكرو Leica SP two stacker من قائمة وحدات ماكرو المكونات الإضافية. حدد الدليل الجذر في مجلد بيانات الحالة هذا.

حدد المجلد المطلوب من القائمة المنسدلة. في هذه الحالة ، تحدد tiffs دليل إخراج أو تنشئ دليلا جديدا. على سبيل المثال، مكدسات مجلدات البيانات.

سيقوم البرنامج النصي بعد ذلك بإعادة بناء السلسلة من الإطارات الفردية لتصحيحها من الحركة. نحن نستخدم خوارزمية متاحة مجانا تقوم بمحاذاة أو مطابقة الإطارات داخل سلسلة من التنزيلات المكدس والحفارة والتسجيل التوربيني. انسخ الملفات الخاصة بكل منها إلى مجلد المكدسين.

قم بتحميل مكدس لتتم معالجته ثم انتقل إلى إطار يوضح بوضوح مجال الاهتمام. ستتم محاذاة الإطارات الأخرى مع هذا الإطار المرجعي. بعد ذلك ، انتقل إلى مكدسات المكونات الإضافية.

Stack Reg. جرب كل من التحويلات المختلفة لتحديد ما هو الأكثر فاعلية لكل موقع. ستختلف العوامل التي تؤثر على الكشف عن عابرات الكالسيوم عن طريق قياس خصائص معينة ومعلمات الجسيمات لكل موقع.

تزداد حساسية وخصوصية الكشف. وبالتالي ، لكل موقع ، سنحسب عتبة العتبة المطروحة للنسبة وعتبة حافة الخلية. للبدء ، انتقل إلى المكونات الإضافية ووحدات الماكرو وقم بتثبيت وتحديد jn CTO dot oh ثمانية إصدار نقطة IJM JM. ثم انتقل إلى المكونات الإضافية ووحدات الماكرو تحميل المكدس.

حدد سلسلة واحسب معلمات الجسيمات التالية. لحساب عتبة الطرح، حدد منطقة مستطيلة ذات أهمية على ما تعتقد أنه مقياس أساسي. متوسط الملاحظة لحساب عتبة النسبة ، حدد منطقة مستطيلة ذات أهمية حول منطقة مسطحة بصريا من خلية أو خلايا العضلات الملساء.

قم بقياس المتوسط والانحراف المعياري. كرر العملية مرتين أخريين ، أو يمكنك رسم ثلاثة مربعات في وقت واحد بالضغط على Shift. احسب إضافة ملاحظة أسفل عتبة النسبة.

احسب على أنه الانحراف المعياري مقسوما على متوسط جمع واحد ، ثم اضرب النتيجة في 32. بحساب متوسط القيم من التكرارات الثلاثة ، يعد عامل 32 ضروريا لحساب خوارزمية النسبة حيث لا يتم تعيين أي تغيير من إطار المتابعة إلى قيمة عدد صحيح 32. هذا يعطي نطاقا ديناميكيا جيدا لاكتشاف الزيادات والنقصان في النسبة.

بالنسبة لصورة ثمانية بت، حدد عتبة ضبط الصورة. حدد أبيض وأسود. حدد تحت حد الشريحة العلوي وقم بتدوين القيمة المقابلة.

هذا على يمين شريط التمرير. سيتم احتساب الأحداث التي تحدث في المناطق السوداء فقط. انقر فوق إعادة تعيين.

الآن بعد أن تم حساب عتبة العتبة المطروحة للنسبة وعتبة حافة البيع ، يمكننا تحليل مكدسات الصور. تحديد موقع المكدسات المراد تحليلها. حدد سلسلة واحدة فقط في هذه المرحلة.

هذا هو الملف الأول ، ويجب أن يكون الملف الأخير هو نفسه. ثم حدد موقعا لإخراج ملفات البيانات والمكدسات. على سبيل المثال ، إخراج مجلد البيانات.

أدخل قيم العتبة لطرح عتبة النسبة وعتبة حافة البيع. اترك الإعدادات الأخرى بقيمها الافتراضية. ستنتج الخوارزمية نافذة مزدوجة اللوحة تظهر فيها السلسلة المعالجة على اليسار والأصل على اليمين.

افتح هذا الملف من مجلد الإخراج وانتقل إلى هذا بعناية لتقييم عدد الإيجابيات الخاطئة والمناسبات التي لم يتم فيها اكتشاف الأحداث المرئية بالعين. لكل سلسلة، تنتج الخوارزمية ملف Excel يوضح بالتفصيل خصائص الحدث المكتشف مثل منطقة السعة، ووضع الإيجابيات الخاطئة المحددة من خلال مراجعة ملفات الصور التي يمكن إزالة مخرجات الخوارزمية يدويا من ملف Excel هذا. على الرغم من أنه يجب أن يكون لديك معايير صارمة للقيام بذلك.

هذا فيلم عن عابر الكالسيوم في العضلات الملساء. في هذا المثال ، يتكون الفيلم من 100 إطار فردي تم الحصول عليه بخمسة هرتز. سنحصل على العديد من هذه الأفلام في كل تجربة عند التحقيق ، على سبيل المثال ، في تأثير دواء معين على تواتر الكالسيوم العابر.

هنا نرى العديد من الكالسيوم التلقائي العابر في خلايا العضلات الملساء. تظهر نتيجة خوارزمية الكشف عن الجسيمات هنا. لكل سلسلة ، تنتج الخوارزمية ملف Excel يوضح بالتفصيل خصائص الحدث المكتشف مثل مساحة السعة والموضع.

لذلك أظهرنا طريقة لتصوير نشوة الكالسيوم في أعضاء العضلات الملساء مثل المثانة البولية ، وأظهرنا طريقة نحلل بها عابرات الكالسيوم باستخدام خوارزمية أنتجناها في المختبر. الأشياء المهمة التي يجب تذكرها هي تحضير الأنسجة جيدا لتصوير الكالسيوم. لذلك في حالة الأنسجة التي أظهرناها اليوم ، هذا يزيل النسيج الضام ويزيل أي دهون قد تحجب المجال.

من المهم أيضا تثبيت الأنسجة في ورقة مسطحة. حسنا ، حظا سعيدا في تجاربك وشكرا لك على المشاهدة.