Name: تنسيق كا 2 + الكشف العابر في العضلات الملساء (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: تعلم تقنية تصوير الكالسيوم عالي الدقة في العضلات الملساء المعزولة باستخدام المجهر الضوئي التكويفي. يوضح هذا البروتوكول تحضير الأنسجة وتحليل إشارات الكالسيوم لدراسة وظائف العضلات الملساء.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وفرت الدعم المالي ويلكوم ترست (جائزة لكبار الشخصيات وJSY 074128 زمالة بحوث لKLB). مجلس البحوث الطبية دراسية للRJA ويستند Leica_SP2_Stacker ، خوارزمية تستخدم لاستيراد المشاجرات ل &#39;إعادة البناء&#39; في سلسلة ، على Leica_tiff_sequence المساعد لايكا SP2 قراءة في ImageJ المشاجرات ، التي وضعها توني كولينز واستخدامها بإذنه. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg وTurboReg ، تستند الخوارزميات المستخدمة لتصحيح حركة الأنسجة ، وعلى venaz ث وزملاؤه (1998) 9. وقد كتب Excel_writer.jar بواسطة كورت دي فوس (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). ويستند JNCT0.08JoVE.ijm ، الخوارزمية الكشف عن الجسيمات ، على خوارزمية كتبه الدماغ كوالا لمبور ومفصلة من قبل 5.

الجزء 1 : إعداد كا 2 + المؤشر (اوريغون الأخضر 488 - BAPTA 01:00) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 يأتي في 500 قارورة AM ميكرولتر وكمية صغيرة (50 ميكروغرام) من مسحوق. إضافة Pluronic 40 ميكرولتر F - 127 حل لمسحوق ، والهز برفق لمدة 30 ثانية ، ثم يضاف 460 PSS ميكرولتر ، ويهز بلطف لمدة 30 ثانية. الحل النهائي ، و 10 ميكرومتر أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 صباحا ، ويوفر 4 × 125 aliquots ميكرولتر. تجنب التعرض للضوء وتخزينها على سي -20 </li></ol> الجزء 2 : كا 2 + التحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المؤشر + كا 2 (ولاية أوريغون الأخضر 488 - BAPTA 1:00) من التجميد (-20 م) والسماح لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ 1 مل من جهاز الأمن الوقائي في أنبوب اختبار وضعها في حمام ماء. يا فقاعة مع 95 ٪ 05/02 ٪ CO 2 بمعدل حوالي 1 فقاعة الظهور في الثانية الواحدة. عوامات ويجب أن يكون المضمون في أنبوب اختبار ، وعلى سبيل المثال مع كدر أو مع Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الأنسجة من الحيوانات ، وطبق بيتري Sylgard مبطنة ، وإزالة بعناية النسيج الضام. بغض النظر عن نوع الجهاز العضلات الملساء ، ينبغي الاستعاضة عن كل PSS دقائق (10) ويجب غسلها جيدا الأنسجة (على سبيل المثال عن طريق استبدال جهاز الأمن الوقائي ثلاث مرات) تشريح التالية. لالأسهر : النظر في قطع الجهاز طول الطرق لإنتاج ورقة من الأنسجة. لالمثانة البولية : فتح طوليا من عنق المثانة (الخلفي) على الجزء العلوي من القبة (الأمامية). إعداد أربعة شرائط ، 6 -- 8 مم طويلة و 1 -- 2 ملم واسعة ، على طول السطح الظهري للالنافصة ، وقطع في اتجاه الحزم العضلات المهيمنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان تشريح الأنسجة في جهاز الأمن الوقائي &quot;ما قبل تحسنت وانفجر&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 125 ميكرولتر من 10 ميكرومتر أوريغون الخضراء BAPTA - 488 1:00 إلى أنبوب اختبار ويعطي يهز قليلا ، من جهة ، وإلى مزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئناف محتدما ويترك ، مع تغطية احباط. الوقت المستغرق لأنسجة كافية لتناول الكالسيوم 2 + مؤشر يتفاوت مع حجم الأنسجة وسماكة طبقة العضلات الملساء. على سبيل المثال : 70 دقيقة (الماوس النافصة ، anococcygeus الجرذان) إلى 120 دقيقة (النافصة الجرذ ، الفأر الأسهر). </li></ol> الجزء 3 : إعداد &quot;كا 2 + تحميل&#39; الأنسجة للفحص المجهري حذرا من النسيج تعلق أمر ضروري من أجل تقليل حركة عفوية من النسيج (خاصية التصوير من خلايا العضلات الملساء من الأنسجة سليمة نسبيا) ، وتيسير موقع موقع مناسب للتصوير (كما شقة قطعة من النسيج قد يكون الاستطلاع في بعدين ، بدلا من ثلاثة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأنسجة في PSS انفجر ما لا يقل عن 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل في إعداد طبق Sylgard مبطنة ، وتمتد إلى الأنسجة (قليلا) لتشكيل ورقة مسطحة. تجنب استخدام الطويل &quot;دبابيس&quot; التي قد تخدش الهدف ، واستخدام أطوال قصيرة بدلا من 25-50 ميكرون قطر الأسلاك الفضية ب &quot;دبابيس&quot; وتدرج في زاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف إعداد طبق على المسرح المجهر ، والحرص على التأكد من أن PSS لا الهروب من منطقة Sylgard مبطنة للطبق (لأن هذا قد يؤدي إلى تغطية منطقة كبيرة يجري في جهاز الأمن الوقائي ، وعندما يبدأ superfusion). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على مضخة من أجل إعداد superfuse مع PSS. غالبا ما يتم توظيف نسبة 100 مل للساعة الواحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل في وحدة تدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب تدفق وتدفق ، والتحقيق في درجة الحرارة على طبق التحضير (لصق كل لقطاع المعادن بواسطة المغناطيس على قاعدتها). فإن ارتفاع غيض من أنبوب تدفق تحديد عمق PSS. توخي الحذر لضمان تدفق هو في الواقع إزالة PSS (كما هو الحال في بعض الأحيان ليس في البداية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة في وحدة سخان للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة ، على سبيل المثال 33-35 C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للتوازن الأنسجة لا يقل عن 10 دقيقة. </li></ol> الجزء 4 : اختيار موقع لصورة التعرض للإضاءة والإثارة photobleach المؤشر ، وبالتالي تجنب استخدام أكثر من بضع ثوان في كل مرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع هدف منخفضة الطاقة (10X أو 20X) استخدام epifluorescence ومثيرة مع ضوء أزرق ، لعرض العضلات الملساء ، وتحديد منطقة مناسبة لمراقبته. محاولة لاختيار الموقع على أساس : الحركة (التي يجب أن يكون الحد الأدنى) ، وعدد خلايا العضلات الملساء في هذا المجال. &quot;هياكل&quot; مشرق قد يسبب عددا كبيرا من &quot;ايجابيات كاذبة&quot; في صورة خوارزمية الكشف ، وبالتالي تجنب المواقع التي تحتوي على أعداد كبيرة من الخلايا (على سبيل المثال) أو الظهارية يتخلل الليفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحول إلى هدف أكبر من الطاقة (40X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير مرحلة أو المحور البصري حتى الخلية العضلات الملساء (ق) وتقع الأفقية (الموازية للمحور أي مسح سريع). </li></ol> الجزء 5 : متحد البؤر المجهري تفاصيل عن كيفية &quot;إعداد&quot; المجهر مبائر محددة لكل نوع المجهر ، ولكنالاعتبارات الرئيسية هي : السرعة (هو الحد الأدنى المطلوب من 5 هرتز لمعظم العابرين كا + 2) ، والقرار وحجم الحقل (وكلاهما يتاجر حالا مع السرعة). بعض بروتوكول التالية محددة إلى مجهر لايكا SP2 مبائر تستقيم. بروتوكول نموذجي هو : 100 سلسلة الإطار ، حصلت على 5 هرتز (256 × 256 بكسل ، حوالي 100 × 100 ميكرون) أو 13.5 هرتز (256 × 64 بكسل ؛ حوالي 100 × 25 ميكرون). رئيس مجموعة مسح للتحرك ثنائي إتجاهي (لتحقيق أقصى قدر من السرعة الاستحواذ) والحصول على 1000 هرتز في كل سطر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الثقب إلى &quot;القرص مهواة&#39; واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة ليزر (488 نانومتر) على السلطة بين 25 و 35 ٪ على AOTF ؛ هذه القيمة هي مفاضلة بين السطوع وphotobleaching. (وهذا الأخير هو مشكلة خاصة خلال تسجيلات طويلة.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على ست مجموعات في كل موقع ، و4-6 في مواقع &quot;المعاملة&quot;. انها لهدف مشترك لمراقبة نفسه قبل ستة مواقع للمخدرات (&quot;السيطرة&quot; على سبيل المثال) وآخر من المخدرات ، على الرغم من photobleaching كبيرة قد يسبب المجرب لتحيد عن ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن الضروري مع كا 2 + التصوير التي يتم تنفيذها &quot;ضوابط الوقت&quot;. </li></ol> الجزء 6 : إعداد لتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل وتثبيت صورة من J : http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. تحميل النسخة منصة محددة ، ومن ثم التحديث إلى أحدث إصدار عن طريق تحميل أحدث ملف imageJ.jar من http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar ، ليحل محل الملف القديم. التفاح مستخدمي ماك : إذا كان يعمل ببطء ، تأكد من أنك تستخدم أحدث إصدار من الجهاز الظاهري جافا (JVM) متوفرة من Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل Excel_writer.jar من : http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html وتثبيت الإضافات في [الدليل] جرة&gt; الدليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ الملفات التالية إلى الدليل الإضافات : Leica_SP2_Stacker.class ؛ JNCT0.08Release.ijm. تثبيت كل من هذه البرامج النصية باستخدام الإضافات [القائمة]&gt; وحدات الماكرو تثبيت &lt;... ImageJ ظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم المجهر لايكا مبائر SP2 ، البرنامج (لايكا LCS) الذي يولد كل سلسلة ك &quot;فيلم&quot; واحد للعرض داخل البرنامج ، ولكن كما يوفر الأطر الفردية. لإعادة بناء الأطر في سلسلة : (ط) تأكد من أن كل &quot;إطارات&quot; من أجل إعادة بنائها في مجلد واحد (مثل &#39;DataFolder&gt; المشاجرات&#39;). (ثانيا) حدد الإضافات [القائمة]&gt; وحدات الماكرو&gt; Leica_SP2_Stacker. حدد الدليل الجذر (على سبيل المثال &#39;DataFolder&#39;). حدد المجلد المطلوب من القائمة المنسدلة (&#39;المشاجرات /&#39; مثلا). حدد الدليل الإخراج أو إنشاء واحدة جديدة (&#39;DataFolder&gt; الأكوام&quot; مثلا). البرنامج النصي ثم إعادة بناء سلسلة من الأطر الفردية. </li></ol> الجزء 7 : تصحيح للحركة رغم أنه قد يكون مصغرا الحركة من موقع تصوير مع يعلقون جيدة والأنسجة بالتساوي طاقتها ، وبعض الأجهزة تقلصات العضلات الملساء المعرض العفوية التي لا يمكن إلغاؤها من جانب الحذر تعلق وحدها. نحن هنا وصف استخدام خوارزمية متاحة بحرية أن تؤيد أو إطارات مباريات ضمن سلسلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنزيل &quot;StackReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) و &quot;TurboReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت كل الإضافات إلى الدليل باستخدام الإضافات&gt; وحدات الماكرو تثبيت &lt;... </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل كدسة بحيث تتم معالجتها (ملف&gt; فتح...) ونقل بعد ذلك إلى الإطار الذي يظهر بوضوح في مجال الاهتمام. وسوف تكون محاذاة الإطارات الأخرى في هذا الإطار المرجعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإضافات&gt; مداخن&gt; StackReg. حاول كل من &quot;التحولات&quot; مختلفة (أي الترجمة ، هيئة جامدة ، تناوب مقيس ، أفيني) لتحديد ما هو الأكثر فعالية. (مزيد من التفاصيل : http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> الجزء 8 : الجسيمات خوارزمية الكشف لكل &quot;موقع&quot; المصورة ، وسوف تختلف العوامل التي تؤثر على الكشف عن كا 2 + العابرين. من خلال قياس بعض خصائص كل موقع (&#39;المعلمات الجسيمات&#39; -- مفصلة أدناه) ، مما يسهل عملية الكشف. وهكذا في كل موقع ، واحد يحسب &#39;عتبة طرح&#39; ، &#39;الحد الأدنى لنسبة&quot; و &quot;عتبة حافة الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإضافات [القائمة]&gt; وحدات الماكرو&gt; تثبيت... ثم اختر &quot;JNCT0.08Release.ijm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإضافات [القائمة] تحميل&gt;&gt; وحدات الماكرو المكدس (اختصار : لتر). حدد سلسلة وحساب المعلمات الجسيمات : <ol style="list-style:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أ. عتبة لطرح (= الخلفية) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عائد الاستثمار مستطيلة على ما كنت تعتقد أن &#39;خلفية&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس (اختصار : م). يدون يعني. <ol style="list-style:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ب. حساب الحد الأدنى لنسبة </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مستطيلالعائد على الاستثمار في جميع أنحاء منطقة مسطحة بصريا من الخلية (ق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس (اختصار : م). علما الانحراف إلى أسفل وقياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيد من تكرار مرتين أو يمكنك رسم ثلاثة صناديق في آن واحد عن طريق الضغط على &quot;التحول&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب ويدون عتبة نسبة = (1 + SD / الوسط) × 32 ، بمتوسط ​​القيم من ثلاثة مكررات / المواقع. <ol style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ج. خلية حافة عتبة </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة&gt; مداخن&gt; Z المشروع... اختيار نوع الإسقاط : &quot;كثافة متوسط&#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة&gt; ضبط&gt; العتبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الأبيض والأسود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعريف &quot;ضمن&quot; (التمرير العلوي) والحد من انخفاض قيمة علما المقابلة (على يمين شريط التمرير). وسيتم احتساب فقط الأحداث التي تحدث في مناطق السود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;إعادة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل المداخن (اختصار : 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما عليك سوى اختيار سلسلة واحدة في هذه المرحلة ، أي &quot;الملف الأول&quot; و &quot;الملف الأخير&quot; يجب أن تكون هي نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل قيم &quot;عتبة طرح&#39; &#39;عتبة نسبة&#39; ، و &#39;عتبة حافة الخلية. ترك الإعدادات الأخرى في قيمها الافتراضية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تنتج الخوارزمية إطار ثنائي في الجزء الذي يظهر في سلسلة معالجتها على اليسار وعلى اليمين الأصلي. من خلال هذا الانتقال بعناية لتقييم عدد من ايجابيات كاذبة والمناسبات التي لم تكن الأحداث ، مرئية بالعين ، تم الكشف عنها. للحصول على كشف أدق من كا 2 + العابرين قد يكون من الضروري تعديل طفيف على بعض من &#39;المعلمات الجسيمات. في حين أن العملية قد تبدو &quot;ضرب وتفوت&quot; قليلا في المحاولة الأولى ، واحد يحصل بسرعة على ما يشعر المعلمات الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل سلسلة ، الخوارزمية ينتج ملف Excel الذي تفاصيل خصائص الحدث الكشف (مثل المنطقة ، وموقف السعة). &quot;ايجابيات كاذبة&quot; -- التي تم تحديدها من خلال مراجعة ملفات الصور التي النواتج الخوارزمية (مثل الخطوة 8.17) -- يمكن إزالتها ، من جهة ، وهذا من ملف Excel. </li></ol>

<ol><li>Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+force+and+Ca2%2B+in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li>
<li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li>
<li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+purinergic+Ca2%2B+transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li>
<li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2%2B+transients+in+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li>
<li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li>
<li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li>
<li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
</ol>

وبذلت جهود لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة ومعاناتهم ، وأجريت التجارب في جميع وفقا للحيوانات المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) عام 1986 وقانون المجتمعات الأوروبية توجيه المجلس 86/09/EEC.

اختيار الفلورسنت كا 2 + مؤشر أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 حيث تم اختيار AM كا 2 + المؤشر لأنه (ط) هو مشرق مقارنة بالمؤشرات الأخرى (مثل Fluo - 4 والأخضر الكالسيوم) 1 ؛ تركيز + (ب) هو حساسية للتغيرات فسيولوجية في كا 2 مع د K حجم مماثل من 1 إلى داخل الخلايا كا 2 + تركيز [كا 2 +] ط (مثلا الأسهر 2) ، (الثالث) يحمل الكثير من خلايا العضلات الملساء ، مما السلس اقتران الخلايا العضلية ليتم رصدها. ومع ذلك ، ولاية أوريغون الخضراء BAPTA - 488 01:00 هو غير ratioable كا 2 + المؤشر ، ولا يمكن بسهولة مثل استخدامها لتحديد المطلق [كا 2 +] ط. وعلاوة على ذلك ، فإنه قد العازلة أيضا كا 2 + اذا كان حاضرا في تركيزات عالية وتصبح مشبعة مع التغيرات في السعة العالية [كا 2 +] ط. تثبيط انقباض عفوية قد يكون خفض انقباض عفوية الأجهزة العضلات الملساء عقاقيري ، مثل حظر حركة كا 2 + من خلال نوع L - كا 2 + قنوات (مثلا : النيفيديبين 3 ؛ ديلتيازيم 4). علما أن هذه الأدوية سوف يقلل كثيرا من سعة كامل الخلية كا 2 + ومضات / العابرين. تقلص الأسهر النتائج من مزيج من النقل العصبي في المقام الأول وpurinergic noradrenergic. تنسيق كا 2 + العابرين في هذه الأنسجة ، ولكن ، حساسة للحصار مستقبلات noradrenergic (مثلا α 1 الأدرينية ، التي برازوسين 5) حتى يمكن تقليل الحركة دون أن يؤثر ذلك التنسيق كا 2 + العابرين. بدلا من ذلك ، قد يتم منع الانكماش &#39;المصب&#39; عن طريق تثبيط ضوء سلسلة الميوسين مثل كيناز بواسطة wortmannin 6. الاستنتاجات رصد كا 2 + مضان في القرار submicron هي تقنية قوية لدراسة آثار ما بعد الإفراج صلي 5،7 العصبي ، والإفراج عن كا 2 + من مخازن الداخلية (مثل &quot;الشرارات&quot; 8). تحليل كا 2 + العابرين باستخدام المنهجية المذكورة هنا هي فعالة من حيث التكلفة مقارنة المتاحة تجاريا حزم ويسمح تحليل الصور مصممة خصيصا من خلال تحليل الإضافات جافا مخصصة لكتابة ImageJ.

<table ><tbody ><tr ><td >Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td ><td >Invitrogen</td ><td >O6807</td ><td >10 x 50 &amp;#x03BC;g</td ></tr><tr ><td >محلول Pluronic F-127</td ><td >Invitrogen</td ><td >P3000MP</td ><td >محلول بتركيز 20% في DMSO</td ></tr><tr ><td >مجهر Leica SP2 confocal الرأسي</td ><td >Leica Microsystems</td ><td ></td ><td ></td ></tr><tr ><td >طاولة هوائية (&amp;#8216;محطة عمل معزولة عن الاهتزازات&amp;rsquo;)</td ><td >Newport Corp.</td ><td >M-VW-3046-OPT-012140</td ><td ></td ></tr><tr ><td >إلاستومر Sylgard 184</td ><td >Dow Corning</td ><td ></td ><td ></td ></tr></tbody></table>

تنسيق كا 2 + الكشف العابر في العضلات الملساء

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

كاليفورنيا 2 + التصوير من العضلات الملساء ، رؤية ثاقبة الآليات الخلوية التي قد لا تسفر عن تغييرات محتملة في الغشاء ، مثل الافراج عن كا 2 + من مخازن الداخلية ، ويسمح لخلايا متعددة في وقت واحد يمكن رصدها لتقييم ، على سبيل المثال ، في اقتران المخلوي الأنسجة. التحت خلوية كا 2 + العابرين شائعة في العضلات الملساء ، ولكن يصعب قياسها بدقة بسبب المشاكل الناجمة عن وقوعها العشوائية ، أكثر من حقل واسع في كثير من الأحيان من العرض ، في الجهاز الذي يجعله عرضة للتعاقد. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير سلسلة من البروتوكولات والتصوير الروتينية للحصول على تحليل ومن ثم تحليلها ، وبطريقة آلية ، والتردد ، والموقع والسعة من مثل هذه الأحداث. بينما يمكن تطبيق هذا النهج في سياقات أخرى ، عملنا يشمل الكشف عن purinergic كا 2 + العابرين المحلية لتحديد مواقع اطلاق سراح الارسال مع القرار submicron. ATP يتم تحريرها باعتبارها cotransmitter من الأعصاب اللاإرادية ، حيث يربط P2X1 المستقبلات في العضلات الملساء للالنافصة والأسهر. كاليفورنيا 2 + يدخل العضلات الملساء ، مما أدى إلى purinergic neuroeffector العابرين كا + 2 (NCTs). الاتصال كا 2 + العابرين تسمح برصد البصرية الإفراج العصبي بطريقة العديد من المزايا أكثر من الكهربية. وبصرف النظر عن القرار المكانية تحسنت كثيرا ، وتسجيل البصرية لديه ميزة إضافية تتمثل في السماح للتسجيل من مواقع الارسال الافراج مميزة كثيرة في وقت واحد. وعلاوة على ذلك ، فإن الطائرة الضوئية التركيز هو أسهل للحفاظ على أو تصحيح خلال سلسلة طويلة من تسجيل هو ضعيتها microelectrode an حادة داخل الخلايا. باختصار ، هو وضع الخطوط العريضة لطريقة التصوير من كا 2 + مضان الذي تفاصيل إعداد الأنسجة ، واقتناء وتحليل البيانات. نحن مخطط استخدام البرامج النصية عدة لتحليل مثل الكالسيوم 2 + العابرين.

تفاصيل أساليب عالية الدقة كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; التصوير من العضلات الملساء داخل أجهزة معزولة ، ومنها : التحضير لاكتساب صورة من الأنسجة ، وتحليل البيانات.

يوفر تصوير أيونات الكالسيوم (+Ca2) في العضلات الملساء رؤية عميقة للآليات الخلوية التي قد لا تؤدي إلى تغيرات في جهد الغشاء، مثل تحرر أيونات الكالسيوم (+Ca2)...

أولاً، يتم تحضير محلول تحميل الكالسيوم، وتدفئته، وسدّه بالفقاعات. ثم يتم تشريح المثانة البولية، وفتحها، وتثبيتها بالدبابيس بشكل مسطح، وأخذ شريحة من العضلة undetrusor. تُضاف شريحة العضلة detrusor إلى محلول التحميل، وتُحضن ثم تُشطف، وتُثبت بالدبابيس بشكل مسطح.يتم استثارة مؤشر الكالسيوم الموجود داخل النسيج بواسطة ضوء الليزر، ثم يتم التقاط الضوء المنبعث الناتج عن ذلك. وتُحلل المقاطع المرئية المكونة من إطارات فردية عن طريق مقارنة الإطارات المتتالية، مع طرح الخلفية.تحدد عتبة حافة الخلية المواضع التي يمكن العثور فيها على الأحداث، ويتم أخذ نسبة بين الأدمغة المتتالية. وإذا كانت الأحداث المتبقية تطابق معايير محددة مسبقاً، يتم تمييزها وتصنيفها. مرحباً، اسمي جون يونغ من مختبرات كيث برين وتوم كينين في قسم фармаكولوجيا بجامعة أكسفورد.أنا روب أموس، ومن مختبرات براين وكان، واسمي كيث براين. اليوم، سيقدم لكم جون وروب تقنية تصوير الكالسيوم في العضلات الملساء. نحن نستخدم هذه التقنية في مختبرنا لدراسة إفراز الناقل العصبي من الأعصاب اللاإرادية وتأثيره على العضلات الملساء.لنبدأ الآن. يتوفر مؤشر الكالسيوم organ green 488 BAFTA 1:00 AM في عبوات سعة 500 µL تحتوي على 50 µg من المسحوق. ولتحضير مؤشر الكالسيوم، أضف 40 µL من محلول Onic F1 27 إلى المسحوق ورج العبوة بلطف لمدة 30 ثانية، بعد ذلك أضف 460 µL من محلول الملح الفسيولوجي PSS، ورجها بلطف لمدة 30 ثانية أخرى.يوفر المحلول النهائي، بتركيز 10 µM من صبغة organ green 488 BAFTA، أربع حصص حجم كل منها 125 µL. يجب تجنب التعرض للضوء وتخزين المحلول عند درجة حرارة -20 °C قبل تشريح النسيج المطلوب.أخرج مؤشر الكالسيوم من المجمد واتركه ليذوب في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح سائلاً. ضع 1 mL من محلول PSS في أنبوب اختبار وفي حمام مائي عند درجة حرارة 33 °C. ثبّت جهاز فقاعات (bubbler) في أنبوب الاختبار باستخدام سدادة، أو يمكنك استخدام غشاء برافيل (perfil)، ثم قم بالفقاعة بمزيج مكون من 95% oxygen و 5% carbon dioxide بمعدل ظهور فقاعة واحدة تقريباً في الثانية.قم بتشريح العضو ذو العضلات الملساء من الحيوان. في هذه الحالة، هي المثانة البولية لفأر. ضع العضو في حوالي 50 ملليمتر من محلول PSS لغسله، وبعد غسل النسيج بعناية، قم بإزالة الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة.قم بإجراء التشريح المفتوح وفقاً لنوع العضلات الملساء للمثانة البولية. افتح طولياً من عنق المثانة، من الطرف السفلي وصولاً إلى قمة القبة. وفي الطرف القحفي، قم بتحضير أربع شرائح، يتراوح طولها بين 6 إلى 8 mm وعرضها بين 1 إلى 2 mm على طول السطح الظهري للمثانة، مع القص في اتجاه الحزم العضلية السائدة.ضع النسيج الذي تم تشريحه وPSS الذي تم تدفئته مسبقاً وفقاعته لتحميل مؤشر الكالسيوم بمقدار 125 µL من 10 µM من organ green 488B إلى النسيج في أنبوب الاختبار، وقم برجّه قليلاً باليد للمزج. أعد الأنبوب إلى الحمام المائي. استأنف عملية الفقاعة وقم بتغطية الحمام المائي بورقة من القصدير.يختلف الوقت اللازم لامتصاص كمية كافية من مؤشر الكالسيوم في الأنسجة باختلاف حجم النسيج وسُمك طبقة العضلات الملساء. فعلى سبيل المثال، يستغرق الأمر 70 دقيقة بالنسبة للعضلة الدافعة في الفئران والـ oxs في الجرذان. بينما نقوم بالتحضين لمدة 120 دقيقة بالنسبة للعضلة الدافعة في الجرذان والـ VAs deens في الفئران.بمجرد تحميل النسيج بالمؤشر الكالسيومي، يمكن تحضيره للفحص المجهري. أولاً، اشطف النسيج في محلول PSS المفرغ بالفقاعات لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بتثبيت النسيج في طبق تحضير مبطن بـ S guard.قم بشدها قليلاً لتكوين ورقة مسطحة. ثبت النسيج باستخدام قطع قصيرة، على سبيل المثال، أسلاك فضية بطول 2 mm وقطر يتراوح من 25 إلى 50 µm، وأدخل الدبابيس بزاوية.تجنب استخدام الدبابيس التي يتجاوز طولها بضعة مليمترات لأنها قد تخدش العدسة الشيئية. يعد تثبيت النسيج بالدبابيس بعناية أمراً هاماً لتقليل التقلص التلقائي للنسيج ولتسهيل تحديد موقع مناسب للتصوير. بعد تثبيت النسيج، ضع طبق التحضير على منصة المجهر.يجب الحذر من تسرب PSS خارج المنطقة المبطنة بحارس السيليكون في الطبق، حيث قد يؤدي ذلك إلى تغطية مساحة كبيرة بـ PSS. وعندما تبدأ عملية الغمر الفائق (superfusion) لأغراض العرض التوضيحي، سيتم تنفيذ الخطوات التالية في الضوء.يرجى ملاحظة أن هذه التجارب تُجرى عادةً في الظلام. قم بتشغيل المضخة من أجل تروية المستحضرات. وفي حالة استخدام PSS، غالباً ما يتم اعتماد معدل تدفق قدره 100 milliliters per hour.قم بتشغيل وحدة التسخين، وضع أنابيب التدفق الداخل والخارج ومجس درجة الحرارة على طبق التحضير مع تثبيت كل منها في الشريط المعدني بواسطة المغناطيس الموجود في قاعدتها. سيحدد ارتفاع طرف أنبوب التدفق الخارج عمق محلول الملح الفسيولوجي (PSS). يجب توخي الحذر للتأكد من أن التدفق الخارج يقوم بالفعل بإزالة محلول PSS، حيث إنه قد لا يفعل ذلك في بعض الأحيان.اضبط درجة الحرارة في وحدة التسخين في البداية لتصل إلى درجة الحرارة المطلوبة والتي تتراوح بين 33 و 35 °C. اترك النسيج ليتوازن لمدة 10 دقائق على الأقل باستخدام عدسة شيئية ذات قوة تكبير منخفضة، 10 أو 20 مرة.استخدم الفلورة فوق المجهرية (epi fluorescence) أو التحفيز بضوء أزرق لرؤية العضلات الملساء وتحديد المنطقة المناسبة للمراقبة. وبما أن التعرض لإضاءة التحفيز سيؤدي إلى تبييض المؤشر ضوئياً، فتجنب استخدامه لأكثر من بضع ثوانٍ في المرة الواحدة.تجنب المواقع ذات البنى الساطعة لأنها قد تتسبب في ظهور عدد كبير من النتائج الإيجابية الكاذبة في خوارزمية اكتشاف الصور. حاول اختيار موقع يتميز بأقل قدر من الحركة وعدد كبير من خلايا العضلات الملساء في المجال. بمجرد اختيار الموقع المراد تصويره، انتقل إلى عدسة شيئية ذات قوة تكبير أعلى مثل 40 x.قم بتدوير المنصة أو المحور البصري بحيث تكون خلية أو خلايا العضلات الملساء في وضع أفقي، أي موازية لمحور المسح السريع. وبذلك تصبح خلايا العضلات الملساء جاهزة للتصوير باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy).في هذا البروتوكول، نستخدم مجهراً بؤرياً قائماً من طراز Leica SP two. يتم إغلاق الثقب (pinhole) ليكون بمقدار قرص هوائي واحد (one airy disc). اضبط قدرة الليزر بين 25 و 35% باستخدام مرشح custo optic القابل للضبط.تعد هذه القيمة بمثابة توازن بين السطوع والابيضاض الضوئي. وللتحضير لتحليل البيانات، قم بتنزيل وتثبيت برنامج ImageJ. قم بتنزيل الإصدار الخاص بنظام التشغيل لديك، ثم حدّثه إلى أحدث إصدار عن طريق تنزيل أحدث ملف jar لبرنامج ImageJ لاستبدال الملف القديم. بعد ذلك، قم بتنزيل ملف jar الخاص بـ Excel writer وتثبيته في دليل plugins jar.انسخ هذه الملفات إلى دليل الملحقات (plugins directory). ثبّت كل سيناريو من هذه السيناريوهات باستخدام وحدات الماكرو الخاصة بالملحقات. ثبّت وظيفة Image J. يُسمى البرنامج الخاص بمجهر Leica SP2 confocal الذي نستخدمه بـ Leica.يقوم نظام LCS بحفظ الإطارات الفردية لكل سلسلة كملف منفصل. لإعادة بناء السلسلة، تأكد من وجود جميع الإطارات المراد إعادة بنائها في مجلد واحد.على سبيل المثال، مجلد بيانات tiffs. ثم اختر ماكرو Leica SP two stacker من قائمة plugins macros. اختر الدليل الرئيسي، وهو في هذه الحالة مجلد البيانات.اختر المجلد المطلوب من القائمة المنسدلة. في هذه الحالة، حدد دليل إخراج لملفات tiffs أو أنشئ دليلاً جديداً. على سبيل المثال، مجلد data stacks.بعد ذلك، سيقوم البرنامج بإعادة بناء السلاسل من الإطارات الفردية لتصحيح الحركة. نحن نستخدم خوارزمية متاحة مجانًا تقوم بمحاذاة أو مطابقة الإطارات ضمن سلسلة المجلدات التي تم تنزيلها، وهي rig و turbo reg. انسخ الملفات الخاصة بكل منهما إلى مجلد stacks.قم بتحميل مجموعة الصور المراد معالجتها، ثم انتقل إلى إطار يُظهر بوضوح مجال الاهتمام؛ حيث سيتم محاذاة الإطارات الأخرى وفقاً لهذا الإطار المرجعي. بعد ذلك، انتقل إلى قائمة plugins stacks.تسجيل المكدس. جرب كل تحويل من التحويلات المختلفة لتحديد الأكثر فعالية لكل موقع. ستتفاوت العوامل المصورة التي تؤثر على اكتشاف العبورا الكالسيومية من خلال قياس خصائص معينة ومعلمات الجسيمات لكل موقع.تزداد حساسية وخصوصية الكشف. وبناءً على ذلك، سنقوم بحساب عتبة لكل موقع، وهي العتبة المطروحة للنسبة وعتبة حافة الخلية. للبدء، انتقل إلى plugins، ثم macros، ثم install واختير jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. بعد ذلك، انتقل إلى plugins ثم macros ثم load stack.اختر سلسلة واحسب معاملات الجسيمات التالية. لحساب عتبة الطرح، حدد منطقة اهتمام مستطيلة فوق ما تعتقد أنه قياس الخلفية، ثم سجل المتوسط. ولحساب عتبة النسبة، حدد منطقة اهتمام مستطيلة حول منطقة مسطحة بصرياً من خلية أو خلايا العضلات الملساء.قم بقياس وتسجيل المتوسط والانحراف المعياري. كرر هذه العملية مرتين إضافيتين، أو يمكنك رسم ثلاثة مربعات في آن واحد بالضغط على مفتاح shift. احسب وسجل القيمة الحدية للنسبة.احسب قيمة الانحراف المعياري مقسوماً على (المتوسط زائد واحد)، ثم اضرب النتيجة في 32. وعند حساب متوسط القيم من المكررات الثلاثة، يكون عامل الضرب 32 ضرورياً لمراعاة خوارزمية النسبة حيث يتم تعيين عدم التغير عن الإطار السابق بقيمة صحيحة تبلغ 32. ويوفر ذلك نطاقاً ديناميكياً جيداً للكشف عن الزيادات والنقصان في النسبة.بالنسبة لصورة ثمانية البتات، اختر "ضبط عتبة الصورة" (image adjust threshold). ثم اختر "الأبيض والأسود". حدد الحد العلوي للمنزلق وسجل القيمة المقابلة.يوجد هذا إلى يمين المنزلق. سيتم حساب الأحداث التي تقع في المناطق السوداء فقط. انقر فوق إعادة الضبط.بعد حساب حد الطرح بالنسبة المئوية وحد حافة الخلية، يمكننا الآن تحليل مجموعات الصور. حدد موقع المجموعات المراد تحليلها. اختر سلسلة واحدة فقط في هذه المرحلة.هذا هو الملف الأول، ويجب أن يكون الملف الأخير مماثلاً له. بعد ذلك، حدد موقعاً لإخراج ملفات البيانات والمجموعات. على سبيل المثال، مجلد إخراج البيانات.أدخل قيم العتبة للطرح، وعتبة النسبة، وعتبة حافة الخلية. اترك الإعدادات الأخرى على قيمها الافتراضية. سينتج الخوارزمية نافذة ذات جزءين، حيث تظهر السلسلة المعالجة على اليسار والأصلية على اليمين.افتح هذا الملف من مجلد المخرجات وراجعه بدقة لتقييم عدد الإيجابيات الكاذبة والحالات التي لم يتم فيها اكتشاف أحداث مرئية بالعين المجردة. بالنسبة لكل سلسلة، يُنتج الخوارزم ملف Excel يفصل خصائص الحدث المكتشف مثل السعة والمساحة والموضع؛ ويمكن إزالة الإيجابيات الكاذبة يدوياً من ملف Excel هذا من خلال مراجعة ملفات الصور التي يخرجها الخوارزم، على أن تتبع معايير صارمة عند القيام بذلك.هذا مقطع فيديو يوضح عابرية الكالسيوم في العضلات الملساء. في هذا المثال، يتكون المقطع من 100 إطار فردي تم التقاطها بتردد خمسة هرتز. نقوم بالتقاط العديد من هذه المقاطع في التجربة الواحدة عند استقصاء تأثير عقار معين على تردد عابرية الكالسيوم، على سبيل المثال.نرى هنا العديد من العوابر الكلسية التلقائية في خلايا العضلات الملساء. تظهر هنا نتيجة خوارزمية الكشف عن الجسيمات. وبالنسبة لكل سلسلة، تنتج الخوارزمية ملف Excel يفصل خصائص الحدث المكتشف مثل السعة والمساحة والموقع.لقد استعرضنا طريقة لتصوير انتقالات الكالسيوم في الأعضاء ذات العضلات الملساء مثل المثانة البولية، كما استعرضنا وسيلة لتحليل تلك الانتقالات الكالسيومية باستخدام خوارزمية قمنا بتطويرها في المختبر. ومن المهم تذكر ضرورة تحضير النسيج جيداً للتصوير الكالسيومي؛ ففي حالة النسيج الذي استعرضناه اليوم، يتضمن ذلك إزالة الأنسجة الضامة وإزالة أي دهون قد تحجب مجال الرؤية.من المهم أيضاً تثبيت النسيج في شكل ورقة مسطحة. حسناً، نتمنى لكم التوفيق في تجاربكم وشكراً لكم على المشاهدة.

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

نقدم طريقة سريعة لعزل الأحداث الكالسيوم (ميكروثانية) أبطأ من الدفقات في الخلايا الحية باستخدام ليزر متحد البؤر المجهر. الأسلوب التدابير تقلبات كثافة مضان من المؤشرات التي تفحص الكالسيوم خط بكسل تسجيل عدة مئات في الخلية. تحليل الرسم البياني يسمح لنا عزل جداول زمنية لتدفقات الكالسيوم مختلفة.

قياس الكالسيوم السريع في تدفقاتها العضلية

وظيفة الخلايا الوعائيةتعتمد على نشاط الرسل داخل الخلايا.  الموصوفة هنا هي طريقة تصوير الفوتون خارج الجسم الحي تسمح بقياس مستويات الكالسيوم وأكسيد النيتريك داخل الخلايا استجابة للمنبهات الفسيولوجية والدوائية في خلايا البطانية والعضلات الملساء الفردية في الشريان الأورطي المعزول.

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر

حاليا ، يتم استخدام معظم مؤشرات الكالسيوم المتاحة لتحديد عابرات الكالسيوم السيتوبلازمية كمقاييس غير مباشرة للكالسيوم المنبعث من الشبكة الساركوبلازمية في خلايا العضلات الملساء المستنبتة. يصف هذا البروتوكول استخدام مؤشر محدد قائم على FRET يسمح بالقياس المباشر لإشارات الكالسيوم داخل تجويف الشبكة الساركوبلازمية.

التصوير متحد البؤر قياس التقلبات الكالسيوم داخل الهيولى العضلية شبكية من مثقف خلايا العضلات الملساء عن طريق الحنق المستندة إلى

تصف هذه الورقة بروتوكولا يقيم التغيرات في حساسية الشعيرات العضلية Ca2+ أثناء الانقباض في الخلايا العضلية القلبية المعزولة من قلب الفئران. جنبا إلى جنب مع الفيزيولوجيا الكهربية للقلب ، ومستويات العصارة الخلوية الانقباضية / الانبساطي Ca2+ والانكماش / الاسترخاء ، يعد هذا القياس ضروريا في دعم الآليات التي تتوسط اقتران الإثارة والتقلص القلبي في القلوب السليمة والمريضة.

تقييم خيط عضلي كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; الحساسية الكامنة وراء القلب الإثارة، تقلص اقتران

نقدم هنا بروتوكولا للكالسيوم في صورة إشارات في سكان أنواع الخلايا الفردية في الوصلات العصبية العضلية مورين.

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الخاصة بالخلية إشارات في المشبك الثلاثية للحجاب الحاجز الماوس

يقدم هذا البروتوكول مجموعة من ساركومير والكالسيوم والبيانات الهندسية العيانية من ترابيكولا القلب المتعاقدة بنشاط مع الجسم الحي السابق. ويمكن إجراء هذه القياسات المتزامنة من خلال دمج ثلاث طرق للتصوير.

في وقت واحد برايتفيلد، فلورسينس، والتصوير الطبوغرافي التماسك البصري من التعاقد ترابيكولاي القلب السابق فيفو

يصف البروتوكول طريقة تحميل صبغة الكالسيوم الفلورية من خلال العصب المقطوع إلى أطراف العصب الحركي للفأر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة فريدة لتسجيل انتقالات الكالسيوم السريعة في النهايات العصبية الطرفية باستخدام المجهر البؤري.

تسجيل انتقالات الكالسيوم في الوصلة العصبية العضلية للفأر بدقة زمنية عالية باستخدام المجهر البؤري

يصف هذا البروتوكول إعداد واستخدام شرائح الرئة المقطوعة بدقة للفأر لتقييم مجرى الهواء وانقباض العضلات الملساء الشريانية داخل الرئة في بيئة حية تقريبا.

استخدام شريحة الرئة المقطوعة بدقة لدراسة التنظيم الانقباضي للمجرى الهوائي والعضلات الملساء الشريانية داخل الرئة

القياس الفلوري الوظيفي الموجه للموقع هو طريقة لدراسة حركات مجال البروتين في الوقت الفعلي. يسمح تعديل هذه التقنية لتطبيقها في الخلايا الأصلية الآن باكتشاف وتتبع حركات مستشعر الجهد الفردي من قنوات Ca2+ ذات الجهد الكهربائي في ألياف العضلات الهيكلية المعزولة بالفئران.

قياس الفلور الوظيفي الموجه للموقع في الخلايا الأصلية لدراسة استثارة العضلات الهيكلية

تقدم هذه المقالة طريقة للمراقبة الكمية في الوقت الفعلي لتركيزات أيون الكالسيوم (Ca2+) في الخلايا باستخدام تصوير Ca2+ أحادي الخلية باستخدام صبغة Fura-2 / AM. تتيح هذه التقنية تحميل الصبغة بكفاءة والحساب الدقيق لمستويات Ca2+ من خلال نسب شدة التألق ، مما يجعلها نهجا بسيطا وسريعا لتطبيقات البحث.

تصوير الكالسيوم أحادي الخلية لدراسة تنشيط قنوات أيونات الكالسيوم

تعلم تقنية تصوير الكالسيوم عالي الدقة في العضلات الملساء المعزولة باستخدام المجهر الضوئي التكويفي. يوضح هذا البروتوكول تحضير الأنسجة وتحليل إشارات الكالسيوم لدراسة وظائف العضلات الملساء.

تنسيق كا^{2 +} الكشف العابر في العضلات الملساء

استكشف المزيد من الفيديوهات