زرع عدسة في اسماك الزرد وتطبيقاتها في تحليل المسوخ العين

لبدء عملية زراعة العدسة، يتم أولاً تحضين المانحين من أسماك الزيبرفيش المعدلة وراثياً والتي تعبر عن GFP والمستقبلات من أسماك الزيبرفيش البرية لمدة 30 دقيقة في أطباق بتري منفصلة تحتوي على محلول رينجر الخاص بأسماك الزيبرفيش الخالي من الكالسيوم. بعد ذلك، يتم تثبيت يرقات الأسماك في خطين متوازيين من مادة agros منخفضة درجة الانصهار؛ حيث يخصص الخط A للمانحين والخط B للمستقبلات. وبالنسبة للمستقبلات، يتم إزالة العين الكاملة للمانح بينما يتم إزالة العدسة فقط من المستقبل.

تتم إزالة الأنسجة المحيطة بعدسة المتبرع قبل وضع العدسة في عين المضيف. بعد عملية الزرع، تُحفظ الأسماك في أطباق ذات 24 بئراً مُصنفة. يجب أن تظهر العدسة المزروعة فلورة GFP في المضيف.

بطبيعة الحال، لم تخضع العين المقابلة للمضيف للجراحة ولا تعبر عن GFP. مرحباً، أنا Yj. وأنا Kaya McCullough، ونحن من مختبر الدكتورة Yma Maki في قسم طب العيون في كلية الطب بجامعة هارفارد. سنعرض لكم اليوم إجراءً لزراعة العدسة في أسماك الزيبرا البرية Daniel Rio.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لنقل العدسات من الحيوانات ذات النمط البري إلى الحيوانات الطافرة والعكس صحيح. وهذا يتيح لنا تحديد ما إذا كانت الجينات الطافرة تعمل في العدسة بشكل ذاتي أو غير ذاتي. لذا، لنبدأ الآن.

يتم الحفاظ على سلالات سمك الزيبرا في ظروف مرافق الأسماك القياسية عند 28.5 درجة C، ضمن دورة ضوئية تتكون من 14 ساعة إضاءة و10 ساعات ظلام. في المساء الذي يسبق التجربة المخطط لها، يوضع الذكور والإناث في حوض مزود بحاجز لفصلهما عن بعضهما البعض. يجب أن ينتج عن النمط الجيني لهذه الأسماك ذرية ذات تعبير GFP وأي طفرة مستهدفة. وبالتوازي، استخدم الإجراء نفسه لإعداد عمليات تهجين بين حيوانات النوع البري غير المعدلة وراثياً خلال ساعة واحدة.

بعد إضاءة المصابيح في الصباح، قم بإزالة الفواصل للسماح للأسماك بالتزاوج. وبعد مرور 15 إلى 30 دقيقة، صب مياه الحوض في مصفاة لجمع الأجنة، ثم اغسلها بدفقة من مياه البيض باستخدام زجاجة غسيل في طبق بتري مقاس 100 × 15 ملم. بعد ذلك، قم بتنظيف البيض عن طريق سحب الأجنة غير المخصبة وأي شوائب باستخدام الماصة.

استبدل ماء البيض القديم بماء بيض جديد. يمكن تخزين الأجنة في حاضنة عند درجة حرارة 28.5 degree C قبل عملية زرع العدسة. وعندما تكون مستعداً للمضي قدماً في عملية الزرع، قم بتجهيز الأجنة عن طريق إزالة الغشاء الكوريوني يدوياً.

باستخدام مسبار معدني وملقط، يجب الآن تحضين الأجنّة المغلفة بـ dec في 0.2%EDTA في وسط ZFR خالٍ من الكالسيوم لمدة 30 دقيقة. وخلال فترة التحضين، يمكن تجهيز الإبر اللازمة للتشريح. تتطلب عملية الزرع إبرة مدببة لقطع الأنسجة المحيطة بالعدسة وفصل أجنّة Woolies من agros.

تتطلب العملية أيضاً إبرة غير حادة لتحريك العدسة المتبرعة وإدخالها في المضيف، حيث يتم صنع أي من الإبرتين أولاً عن طريق قطع طرف ماصة باستور باستخدام سكين ألماس. بعد ذلك، يتم إدخال شعيرة زجاجية في طرف ماصة باستور بحيث يكون حوالي نصف طولها بداخلها. ثم يتم إدخال سلك تنغستن رفيع بعناية في الطرف المفتوح للشعيرة باستخدام اللهب.

قم بصهر الزجاج فوق السلك باستخدام الملاقط مع الإمساك بطرف الزجاج بثبات بواسطة سلك معدني أثناء تدوير الطرف الآخر للإبرة. يجب أن يلتف الزجاج الذي أصبح ليناً حول المعدن، ليمسكه في مكانه. يؤدي ذلك إلى صنع إبرة ثلمة من أجل إنشاء إبرة مدببة.

ثبّت سلك التنجستن فوق لهب لمدة تتراوح من دقيقة إلى 1.5 دقيقة لحرق المعدن، وذلك لتكوين طرف دقيق للغاية. تحقق من جودة الطرف باستخدام المجهر.

يجب ألا ينثني الطرف الجيد أو ينحني، بل يجب أن يستدق بسلاسة وصولاً إلى نقطة دقيقة لا يتجاوز قطرها 50 micrometers. قم بتعقيم كلتا الإبرتين في اللهب لبضع ثوانٍ واتركهما لتبردا قبل البدء في الإجراء؛ في أنبوب طرد مركزي بلاستيكي، قم بتحضير 1.2% low melting point aros وZFR خالٍ من الكالسيوم مسخن مسبقاً إلى 40 °C في حمام مائي، وعند المرحلة المطلوبة، اسحب الأجنة المانحة باستخدام ماصة باستور واطردها ببطء في أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على aros. قم بحضن البويضات في aros لمدة خمس ثوانٍ تقريباً.

انقل الأجنة باستخدام الماصة ورتبها في صف واحد على طبق بتري من البوليسترين بقطر مائة مليمتر عن طريق السحب ببطء وعناية، حيث سيستقر معظم الأجنة على جوانبها بحيث تكون العين متجهة للأعلى. كرر هذه العملية الآن مع بيوض المضيف ورتبها في صف موازٍ لبيوض المانح قبل أن يتصلب الأجار. استخدم إبرة غير مدببة لتدوير أي أجنة غير موجهة بشكل صحيح بحيث تكون العين متجهة للأعلى عند تصلب الأجار.

قم بتغطيته بمحلول aro بنسبة 0.2% ذو نقطة انصهار منخفضة. وباستخدام إبرة مدببة، قم بإزالة أي من محلول aro الموجود حول العينين، ثم استأصل بعناية فائقة عين المتبرع بأكملها، والتي ستطفو على السطح. بعد ذلك، قم بتحرير العدسة من العين.

يتم ذلك عن طريق سحب الإبرة عبر أنسجة العين من الأسفل إلى الأعلى. هذا الإجراء مخصص للمضيف فقط. يتم استئصال العدسة باستخدام ضربات صغيرة بإبرة مدببة، مع القص في أقرب نقطة ممكنة من العدسة دون تمزيقها.

تجنب إزالة الكثير من الأنسجة من بقية عين المضيف. بمجرد تحررها، ستطفو العدسات في الوسط. باستخدام إبرة غير مدببة، ادفع عدسة المتبرع بعناية لتصبح فوق موقع عدسة المضيف مباشرة، ثم ادفعها لأسفل لتستقر في موضعها باستخدام إبرة غير مدببة.

يمكن التخلص من عدسة المضيف. تُترك أجنة المانح والمضيف في Aros بتركيز 1.2% لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة، حيث يساعد وسط نمو الأجنة في التئام الجروح.

بعد ذلك، قم بتحرير الأجنة من حبيبات الأغاروز باستخدام إبرة معدنية مدببة. انقل الأجنة إلى طبق يحتوي على 24 بئراً ومملوء بوسط استنبات الأجنة، بحيث يشغل كل جنين بئراً منفصلاً.

تأكد من تسمية الآبار بشكل صحيح ليكون من الواضح أي مضيف يتوافق مع أي متبرع بعد اكتمال عملية نقل العدسة. اترك الأجنة لتنمو عند درجة حرارة 28.5 °C حتى الوقت المطلوب. وبالنسبة للملاحظة المظهرية، فإننا نفحص عادةً تمايز العدسة خلال يوم أو يومين.

يجب أن تحافظ العدسة المشتقة من المتبرع على تعبير GFP بعد زراعتها في عين المضيف. إذا لم يتم إنقاذ النمط الظاهري الطافر في بيئة النوع البري، فإن هذا يشير إلى أن النمط الظاهري ذاتي. أما إذا تم إنقاذه، فيعتبر النمط الظاهري غير ذاتي.

ولهذا تداعيات مهمة على وظيفة الجين الأساسي. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية إجراء عملية نقل العدسة في جنين سمكة الزيبرا. عند القيام بهذا الإجراء، من المهم توخي الحذر الشديد في كيفية تشكيل الإبر وكيفية تشريح العدسة نفسها.

علاوة على ذلك، يجب ترتيب الأجنة بسرعة قبل حدوث دحرجة البويضات بمجرد اكتمال عملية النقل. ولا تنسَ إضافة وسط الأجنة إلى ثماني ثقوب في خشب الشفاء. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.