Name: قياس جدار الخلية النباتية ملحق (زحف) المستحثة بواسطة الرقم الهيدروجيني حمضي والفا Expansin (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: تعلم قياس تمدد جدار الخلية النباتية المستحث بالرقم الهيدروجيني الحمضي والبروتينات Expansin باستخدام مقياس التمدد بقوة ثابتة. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات نمو النبات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد وضعت التقنيات المعروضة هنا بتمويل من المنح المقدمة من وزارة الطاقة (علوم الطاقة الحيوية) ومؤسسة العلوم الوطنية.

الجزء 1 : زراعة وتخزين المواد النباتية المناسبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تجربتنا ، hypocotyls الشباب من شتلات الخيار etiolated بمثابة مصدرا مريحا للمواد الجدار الخلوي لهذه التجارب. وزرعت بذور الخيار على الورق الرطب في ضوء مربع واقية ، والتي تبقي في خزانة في غرفة مظلمة درجة حرارة ثابتة وضعت في 26 درجة مئوية. درجة الحرارة بالضبط ليست حرجة ، وعلى ما بين 22 درجة و 30 درجة مئوية وينبغي أن يكون على ما يرام ، ولكن درجة الحرارة سيحدد مدى سرعة الوصول الى مرحلة الشتلات المناسبة للتنمية. الأكثر دفئا وحرارة ، وأسرع وتطوير الشتلات. نحن عادة استخدام الشتلات عندما نمت إلى حوالي 5 سم في الطول ، الذي تم التوصل 3-4 أيام بعد البذر. فمن المهم أن تكون الشتلات نمت في الظلام ، وحتى كميات صغيرة من الضوء تؤثر على معدل التنمية الشتلات وخصائص جدار الخلية التي نقيس مع هذه التقنية. في يوم 3 يمكنك ملاعبة في المربع ، وذلك باستخدام الضوء الأخضر الباهت تصفيتها ، للاطمئنان على وضع الغرسات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقطع الشتلات بسرعة ومعبأة في علب بلاستيكية صغيرة ، 100-150 شتلة في المربع ، وتخزينها في -80 ° C. عند هذه الدرجة التي لا تزال مفيدة لعدة اسابيع. </li></ol> الجزء 2 : تحضير عينات جدار الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل مجموعات صغيرة (8-10) من الشتلات خفض المجمدة من الفريزر إلى حاوية تحتوي على كتلة عازلة المجمد -80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير متآكل إهاب تغطي التحتفلقي مع السامور. يتم ذلك عن طريق الرسم مرارا التحتفلقي بين الإبهام والسبابة ، والتي هي المغلفة مع الطين سميكة من مسحوق السامور الرطب. فإنه يأخذ القليل الخبرة في معرفة المبلغ الصحيح من الضغط لاستخدام : الكثير من الضغط وطبقة البشرة يبدأ تكون تمزيقه وممزقة ، والضغط قليلا جدا ، ولن يكون permeabilized إهاب. واحد أيضا على العمل بسرعة لأنه كما يذوب في التحتفلقي المجمدة ، يصبح رخو ويصعب السيطرة عليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وانخفض التحتفلقي متآكل في الماء المثلج لإزالة معظم السامور التمسك ثم تخزينها على الماء المثلج بينما أعد hypocotyls المتبقية بطريقة مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع hypocotyls إلى الطول المطلوب ، وعادة 1،2 سم ، مع واحدة جديدة شفرة حلاقة وارتفع محاذاة ثم على شريحة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن نحن بحاجة إلى تسطيح الجدران لإزالة الخلايا والنسغ لتسهيل لقط. يتم وضع شريحة زجاجية الثاني على رأس مجموعة من عينات 80-10 ، وتشكيل لبيع الشطائر. يتم وضع الوزن (400-500 ز) على أعلى شريحة زجاجية لمدة 5 دقائق. لوزن نستخدمها بشكل روتيني دورق يحتوي على كمية مناسبة من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوة اختيارية : اعتمادا على هذه التجربة ، قد يكون المعطل لhypocotyls مع المعالجة الحرارية وجيزة عند هذه النقطة. للقيام بذلك ونحن ربط الشرائح الزجاجية مع زوج من الأربطة المطاطية ، وضعت في وعاء التجميع مع 100 مل من غير المتأينة المياه في درجة حرارة الغرفة ووضعه في فرن الميكروويف بكل طاقته. مع المايكرويف لدينا تبدأ المياه في الغليان بنحو 50 ق ونتوقف في الميكروويف 15 ق بعد الغليان يبدأ. يتم سكب الماء الساخن بسرعة خارج والاستعاضة بالماء البارد لوقف تمسخ. قد تضطر لتغيير هذه التوقيتات ، والميكروويف الخاص بك قد تكون مختلفة من بلدنا. التدفئة المفرطة مع العينات تصبح ضعيفة وكسر بسهولة. مع التدفئة كافية ليس المعطل في expansin الذاتية وعينات الجدار لا تزال تحتفظ ببعض القدرة على الاستجابة للدرجة الحموضة الحمضية. </li></ol> الجزء 3 : إعداد التمدد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفرضت الآن عينات الجدار في قوة التمدد المستمر. هذا هو جهاز مخصص الصنع التي تتكون من كفيت زجاجي لعقد نهاية القاعدية من العينة الجدار والمشبك المنقولة تعلق على نهاية قمية من العينة. هي التي شنت المشبك المنقولة في نهاية قضيب الذي يمر عبر فتح ملفات من جهاز استشعار الموقف ، وهو LVDT أو &#39;التفاضلية الخطية محول متغير&quot; ، التي يكشف إلكترونيا الموقف من اسطوانة معدنية صغيرة ، أو &quot;الأساسية&quot; ، وهذا هو تعلق على قضيب. ويرتبط في نهاية العلوي من قضيب إلى ذراع مع موازن للتعديل. هذه الرافعة تمارس ضبط مبلغ القوة الصاعدة على عينة الجدار. يتم ضبط القوة عن طريق إضافة أو إزالة المعادن معايرة الأوزان إلى نهاية بكثير من ذراع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى نموذج الجدار -- يتم انتقاؤها نهاية القاعدية من العينة التحتفلقي مع ملقط غرامة ويوضع ~ 2-3 ملم من قمية في نهاية بين فكي المفتوحة للالمشبك المنقولة. هذا هو المشبك المشبك التمساح بنابض الذي المعدنية المغلفة بالبلاستيك الفكين لمنع الاتصال المباشر بين سطح المعدن وحل مؤقت أو العينة الجدار. في أيونات معدنية لدينا تجربة يمكن أن تتسرب من المشبك وتحول دون قدرة الجدار على أن تقدم ، وهكذا نحافظ على المعدن مغطاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد التجمع المشبك المنقولة في يد واحدة ، يتم الآن ناور نهاية القاعدية للعينة في الجدار بين القطع يتوقف اثنين من زجاجي كفيت وكفيت ويتم جلب القطع معا ومشدود ضيقة ، وبالتالي تأمين نهاية الجزء السفلي من الجدار في عينة كفيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن التجميع المشبك المنقولة صدر بلطف ، والسماح بنقل القوة الكاملة للثقل العينة الجدار. نستخدم عادة ثقلا موازنا ما مجموعه 20 غراما للحصول على عينات من جدار المعدة hypocotyls الخيار. قد الجدار مواد أخرى أو تجارب تتطلب أوزان مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تعبئة كفيت مع العازلة (200 UL) وموقف كفيت تحركت صعودا أو هبوطا مع المسمار التعديل ، بحيث يتم جلب المشبك المنقولة إلى انخفاض نهاية LVDT نطاق القياس. يرتبط LVDT لدينا إلى وحدة جمع البيانات من الحواسيب الصغيرة ، وهكذا نحن نراقب الموقف عن طريق الكمبيوتر LVDT. لدينا ثمانية مجالس LVDT متصلة بالتوازي مع جهاز كمبيوتر واحد ، مما يسمح لنا لتشغيل الجدار 8 عينات في وقت واحد. الكمبيوتر يسجل موقف كل من المجالس مرة واحدة كل ثانية. LVDT 30 </li></ol> الجزء 4 : قياس استجابة لتمديد حامضي أو expansin -- نتائج الممثل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف [التجربة الأولى] للحصول على قياس حمض بفعل التمديد ، ونحن نبدأ مع عينات الجدار الأصلي (الذي هو ، وليس المعطل مع الحرارة) ، وعازلة محايدة لكفيت. عينات الجدار تمتد لبضع دقائق ، وذلك استجابة للتوتر وأضاف ، ولكن التمديد يضمحل إلى انخفاض معدل بعد بضع دقائق. جهاز الكمبيوتر لدينا يتيح لنا مراقبة إما التغيير في طول العينة (أي تغيير في موقف الشبك المنقولة ، بعد بدء التجربة) أو يمكننا رصد المشتقة الوقت للموقف ، وبعبارة أخرى فإن معدل التمديد . معدل التمديد لتستقر قيمة منخفضة مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 20 دقيقة ~ ، تتم إزالة عازلة محايدة. نستخدم أنابيب معدنية رقيقة ، مصنوعة من إبرة الحقن قياس كبير ، متصلا مضخة فراغ لإزالة العازلة بسرعة ، مع الحد الأدنى من الإزعاج للجدار أو التجميع الميكانيكية. ثم يتم إضافة الحمضية العازلة ، وأحيانا مع 1-2 التبادل السريع لتأمين تبادل كاملة لالعازلة الحمضية. ثم علينا الجلوس ومشاهدة استجابة من الجدار. عادة لا يمكننا الكشف عن معدل أسرع من التمديد في بضع دقائق. بعد 60 دقيقة لدينا عادة ما يكفي من المعلومات لتقييم مدى استجابة التمديد ، رغم أنه في بعض الحالات القياسات قد تمتد إلى فترات أطول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف [التجربة الثانية] للحصول على قياس expansin التي يسببها جدار الخلية التمديد ، ونحن نبدأ مع عينات الجدار المعطل للحرارة وعازلة للكفيت الحمضية. كما في التجربة الأولى ، فإن معدل تمديد جدار الخلية يستقر تدريجيا إلى قيمة منخفضة بسبب عدم وجود expansin الوظيفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 20 دقيقة ~ ، إضافة إلى البروتين expansin كفيت ل &#39;التشويك&#39; مع العازلة في 10-20 ماي كفيت مع التوصل إلى حل expansin. وexpansin تخترق بسرعة العينة وجدار الخلية في غضون بضع دقائق ونحن نرى أن معدل التمديد قد ازداد. يمكن أن يتبع هذا الرد تمديد لمدة ساعة أو أكثر. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1263/fig1.png" alt="" width="600" height="469" /> الشكل 1 : مخطط لإعداد إجراءات لتقييم جدران الخلايا التي يسببها أو حمض expansin بفعل امتداد الجدار.

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+long-term+extension+of+isolated+cell+walls+from+growing+cucumber+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls.</a> Planta. 177, 121-130 (1989).</li>
<li>Rayle, D. L., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Acid+Growth+Theory+of+auxin-induced+cell+elongation+is+alive+and+well%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Acid Growth Theory of auxin-induced cell elongation is alive and well.</a> Plant Physiol. 99, 1271-1274 (1992).</li>
<li>Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin-induced+growth+of+Avena+coleoptiles+involves+two+mechanisms+with+different+pH+optima%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxin-induced growth of Avena coleoptiles involves two mechanisms with different pH optima.</a> Plant Physiol. 99, 1556-1561 (1992).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407, 321-326 (2000).</li>
<li>McQueen-Mason, S., Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+endogenous+proteins+that+induce+cell+wall+expansion+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants.</a> Plant Cell. 4, 1425-1433 (1992).</li>
</ol>

لهذه المظاهرة كنا جدران الخلايا من hypocotyls الخيار لأنها أثبتت أن تكون مصدرا موثوقا للعينات الجدار التي يسهل التعامل معها والتي تستجيب مع حساسية جيدة. كان لدينا أيضا نجاحا جيدا مع جدران من الشتلات الأخرى ، فضلا عن بعض المواد من السوبر ماركت ، مثل أوراق السبانخ الشباب وسيقان الكرفس. أساسا ، لينة الشباب ، والأنسجة النباتات التي تنمو بسرعة ومن المرجح أن يكون قياسه بسهولة مع هذه التقنية ، ولكن القديمة صعبة ، والأنسجة النباتية أو تتأكسد nongrowing من غير المرجح أن تكون متجاوبة نظرا ل...

قياس جدار الخلية النباتية ملحق (زحف) المستحثة بواسطة الرقم الهيدروجيني حمضي والفا expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

تزايد جدران الخلايا النباتية المعرض بشكل مميز خاصية تعرف باسم &quot;النمو حامض ، ونعني أنها أكثر الموسعة في انخفاض الرقم الهيدروجيني (&lt;5) 1. وأوكسين هرمون يحفز النبات بسرعة استطالة خلية في ينبع الشباب والأنسجة مماثلة على الأقل في جزء من آلية النمو حمض 2 ، 3. أوكسين ينشط H + مضخة في غشاء البلازما ، مما يسبب تحمض الخلية حل الجدار. الجدار تحمض ينشط expansins ، والتي هي الخلية الذاتية الجدار تخفيف البروتينات 4 ، مما تسبب في جدار الخلية الاستسلام لالتوترات الناجمة عن ضغوط الجدار تورم الخلية. ونتيجة لذلك ، تبدأ لتكبير الخلية بسرعة. يقاس بسهولة هذه الظاهرة &quot;النمو حمض&quot; في عزلة (غير الحية) العينات جدار الخلية. قدرة على الخضوع لجدران الخلايا الحمضية الناجمة عن تمديد ليست مجرد نتيجة لهذا الترتيب الهيكلي للجدار الخلية السكريات (مثل pectins) ، ولكنها تعتمد على نشاط expansins 5. Expansins لم يكن لديك أي نشاط معروف الأنزيمية والطريقة الوحيدة لفحص لنشاط expansin هو قياس الحث على تمديد جدار الخلية. هذا التقرير تفاصيل الفيديو مصادر وتقنيات التحضير للحصول على مواد الجدار مناسبة لفحوصات expansin ويمضي لتظهر حمض بفعل التمديد وexpansin بفعل التمديد لعينات من جدار المعدة من خيار hypocotyls المتنامية. للحصول على عينات مناسبة جدار الخلية ، وتزرع شتلات الخيار في الظلام ، وقطع hypocotyls والمجمدة في -80 درجة مئوية. ومتآكل hypocotyls المجمدة ، بالارض ، وفرضت بعد ذلك في توتر دائم في كفيت خاص لقياس التمدد. لقياس حمض بفعل التمديد ، يتم تخزينها في البداية على الجدران محايد الرقم الهيدروجيني ، مما أدى إلى انخفاض في النشاط expansins التي تشكل عناصر من جدران الخلايا الأصلية. عند تبادل عازلة لدرجة الحموضة الحمضية ، ويتم تنشيط expansins وجدران الخلايا تمتد بسرعة. نظهر أيضا نشاط expansin في إعادة فحص. لهذا الجزء ، ونحن استخدام المعالجة الحرارية قصيرة لتفسد expansins الأصلي في عينات من جدار الخلية. هذه الجدران الخلية المعطل لا تمتد حتى في المخزن الحمضية ، ولكن إضافة إلى expansins جدران الخلايا بسرعة استعادة قدرتها على توسيع نطاق.

ندلل على استخدام القوة التمدد المستمر لقياس المدى الطويل التمديد (الزحف) من العينات النباتية جدار الخلية الناجم عن مخازن الحمضية والبروتين expansin.

قياس جدار الخلية النباتية ملحق (زحف) المستحثة بواسطة الرقم الهيدروجيني حمضي والفا Expansin

تظهر جدران الخلايا النباتية النامية بشكل مميز خاصية تُعرف باسم "النمو الحمضي"، والتي نعني بها أنها تكون أكثر قابلية للتمدد عند الرقم الهيدروجيني المنخفض (أقل من 5) 1. إن...

نوضح هنا طرقاً لقياس التمدد والنشاط من خلال قياس هندسة استطالة الجدار الخلوي. يمكن تحضير عينات جدار مناسبة من السويقات تحت البشرية لبادرات بذور الخيار التي عولجت بـ E TAT لقياس التمدد المستحث بالحمض، والذي يتم تحفيزه بواسطة إنزيمات التمدد الداخلية المرتبطة بالجدران الخلوية الأصلية. نقوم بتثبيت الجدران في محلول منظم متعادل وجهاز قياس الاستطالة، وعند التحول إلى pH حمضي، يتم تنشيط إنزيمات التمدد وتتمدد الجدران الخلوية بسرعة.كما نوضح أيضاً اختبار إعادة تشكيل التمدد. وفي هذا الجزء، نستخدم معالجة حرارية قصيرة لتعطيل تمددات البروتينات الداخلية. ولا تتمدد الجدران الخلوية المعطلة حرارياً حتى في وجود محلول منظم حمضي، ولكن إضافة مادة التمدد تعيد بسرعة قدرة الجدار على التمدد.مرحباً، أنا دان دي روكو من مختبر الدكتور دانيال كوزجروف في قسم الأحياء بجامعة ولاية بنسلفانيا. سنعرض لكم اليوم إجراءً لقياس الاستطالة غير العكسية أو الزحف لجدران الخلايا النباتية المعزولة. لذا، فلنبدأ.بناءً على خبرتنا، تعمل بادرات الخيار الصغيرة والمستطيلة كمصدر ملائم لمواد الجدار الخلوي. وفي هذه التجارب، تُزرع بذور الخيار على ورق مبلل في صندوق عازل للضوء، يُحفظ في خزانة مظلمة وغرفة ذات درجة حرارة ثابتة مضبوطة عند 26 درجة مئوية. كما يمكن أن تنجح درجات الحرارة التي تتراوح بين 22 و 30 درجة مئوية، ولكن من المهم ملاحظة أن درجة الحرارة ستحدد معدل النمو.كلما ارتفعت درجة الحرارة، زادت سرعة نمو الشتلات. يعد الحفاظ على بيئة نمو مظلمة أمراً بالغ الأهمية، حيث إن الكميات الضئيلة من الضوء تؤثر على كل من معدل نمو الشتلات وخصائص الجدار الخلوي التي نقوم بقياسها باستخدام هذه التقنية. وفي اليوم الثالث، يمكنك إلقاء نظرة داخل الصندوق باستخدام ضوء أخضر خافت ومفلتر للتحقق من تطور الشتلات.عادةً عند تفقد الصندوق في اليوم الثالث أو الرابع، ستجد شتلات نمت ليصل طولها إلى حوالي 5 cm، وهو الطول الذي استخدمناه عادةً في تجاربنا. يمكن تجميد هذه الشتلات عند -80 °C قبل الاستخدام. لبدء تحضير عينات الجدار الخلوي، تُنقل مجموعات صغيرة مكونة من 8 إلى 10 شتلات مقطعة ومجمدة من المجمد إلى حاوية معزولة تحتوي على قالب تجميد بدرجة حرارة -80 °C. وباستخدام ملاط كثيف من مسحوق carbo run لتغطية الإبهام والسبابة، يتم إزالة الطبقة الشمعية التي تغطي السويقة تحت الفلقية عن طريق فرك السويقة تحت الفلقية بشكل متكرر بين الإبهام والسبابة.أثناء تنفيذ هذه التقنية، من الضروري استخدام مقدار الضغط الصحيح الذي يضمن نفاذية cuticle دون إتلاف الطبقة البشرية (epidermal layer). كما يجب العمل بسرعة لأنه مع ذوبان hypo coddle المجمد، يصبح مسطحاً ويصعب التعامل معه لإزالة معظم carum الملتصق. يتم غمس hypo coddle المبرود ثم تخزينه في ماء مثلج أثناء تحضير hypo coddles المتبقية.بعد إزالة البشرة من جميع الشتلات، يتم قصها إلى الطول المطلوب، والذي عادة ما يكون 1.2 سنتيمتر باستخدام شفرة حلاقة ذات حافة واحدة جديدة، ثم يتم رصّها على شريحة زجاجية بعد المحاذاة. توضع شريحة زجاجية ثانية فوق مجموعة العينات المكونة من 8 إلى 10 عينات، ثم يوضع ثقل يتراوح من 400 إلى 500 جرام فوق الشريحة الزجاجية لمدة خمس دقائق. ونحن نستخدم عادةً دورقاً مملوءاً بكمية مناسبة من الماء كثقل.سيعمل وزن الكأس على تسطيح جدران الخلايا لإزالة العصارة الخلوية وتسهيل عملية التثبيت. وبناءً على طبيعة التجربة، يمكن تثبيط نشاط الـ hypo coddles من خلال معالجة حرارية قصيرة في هذه المرحلة. وللقيام بذلك، نربط الشرائح الزجاجية معاً باستخدام زوج من الأربطة المطاطية، ونضع المجموعة في وعاء يحتوي على 100 mL من الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة، ثم نضعها في فرن ميكروويف على الطاقة القصوى.يبدأ الماء في الغليان عند حوالي 50 ثانية، ونوقف الميكروويف بعد 15 ثانية من بدء الغليان، ثم يُسكب الماء الساخن بسرعة ويُستبدل بماء بارد لإيقاف عملية المسخ. سيعني التسخين الأمثل أن العينات ستفتقر إلى أي استجابة للـ pH المنخفض، وفي الوقت نفسه لن تصبح ضعيفة وتنكسر بسهولة. يتم الآن تثبيت عينات الجدار في مقياس تمدد X ذو قوة ثابتة.هذا جهاز مصنع خصيصاً يتكون من مكعب من البلكسي جلاس لتثبيت الطرف القاعدي لعينة الجدار ومشبك متحرك متصل بالطرف القمي (APIC) للعينة. يتم تركيب المشبك المتحرك على نهاية قضيب يمر عبر الملفات المفتوحة لمستشعر موضعي من نوع LVDT أو محول تفاضلي متغير خطي، والذي يقوم إلكترونياً برصد موقع أسطوانة معدنية صغيرة أو قلب متصل بالقضيب.يتم ربط الطرف العلوي للقضيب برافعة ذات ثقل موازن قابل للتعديل. وتؤثر هذه الرافعة بقوة دفع للأعلى قابلة للتعديل على عينة الجدار. يتم ضبط هذه القوة عن طريق إضافة أو إزالة أوزان معدنية معايرة إلى الطرف البعيد من الرافعة لتحضير العينات لقياس تمدد جدار الخلية.يتم التقاط الطرف القاعدي لعينة السويقة تحت الفلقية باستخدام ملقط دقيق من الطرف القمي بنحو اثنين إلى ثلاثة مليمترات، ثم يوضع بين الفكين المفتوحين للمشبك المتحرك. هذا المشبك هو مشبك تمساح يعمل بنظام الزنبرك. الفكاكان المعدنيان مغلفان بالبلاستيك لمنع التلامس المباشر بين السطح المعدني ومحلول المنظم أو عينة الجدار.وفقًا لخبرتنا، يمكن أن تتسرب الأيونات المعدنية من المشبك وتثبط قدرة الجدار على التمدد، لذا نحافظ على تغطية المعدن. مع الإمساك بمجموعة المشبك المتحرك في إحدى اليدين، يتم الآن توجيه الطرف القاعدي لعينة الجدار بين قطعتي المفصل في جهاز الـ vete المصنوع من البليكسي جلاس، ثم يتم ضم قطعتي الـ vete معًا وربطهما بإحكام، مما يؤدي إلى تثبيت الطرف السفلي لعينة الجدار في الـ vete. يتم الآن تحرير مجموعة المشبك المتحرك برفق، مما يسمح بنقل القوة الكاملة للأوزان الموازنة إلى عينة الجدار. نستخدم بشكل روتيني وزنًا موازنًا إجماليًا قدره 20 grams لعينات الجدار المحضرة من الخيار، hypo coddles.قد تتطلب مواد الجدران الأخرى أو التجارب المختلفة أوزانًا مختلفة. يتم ملء qve بالمحلول المنظم، ثم يُحرك موضع QVE للأعلى أو للأسفل باستخدام برغي ضبط بحيث يتم نقل المشبك المتحرك إلى الطرف السفلي من نطاق قياس LVDT. يتصل LVDT الخاص بنا بوحدة الحصول على البيانات في الكمبيوتر.لدينا ثماني مجموعات من محولات التفاضل الخطية المتغيرة (LVDT) متصلة على التوازي بجهاز كمبيوتر واحد، مما يتيح لنا تشغيل ثماني عينات من الجدار في آن واحد. يقوم الكمبيوتر بتسجيل موضع كل مجموعة من مجموعات LVDT مرة كل 30 ثانية لقياس الاستطالة الناجمة عن الحمض. نبدأ بعينات جدار طبيعية غير معطلة حرارياً، ويُضاف محلول منظم متعادل إلى الوعاء.تتمدد عينات الجدار لبضع دقائق استجابةً للشد المضاف، ولكن يتضاءل هذا التمدد إلى معدل منخفض. وبعد بضع دقائق، يتيح لنا الحاسوب مراقبة إما التغير في طول العينة، وهو التغير في موضع المشبك المتحرك بعد بدء التجربة، أو يمكننا مراقبة المشتقة الزمنية للموضع، وبعبارة أخرى، معدل التمدد.يستقر معدل الاستطالة عند قيمة منخفضة بمرور الوقت. وبعد مرور 20 دقيقة تقريبًا، يتم إزالة المنظم المتعادل باستخدام أنبوب معدني رفيع مصنوع من إبرة تحت الجلد ذات عيار كبير، متصلة بمضخة تفريغ، وذلك لإزالة المنظم بسرعة.يسمح هذا الإعداد بإزالة المحلول المنظم مع تقليل الاضطراب الذي قد يلحق بالجدار أو بالتجميع الميكانيكي. ثم يُضاف محلول منظم حمضي، وأحيانًا مع إجراء عملية تبديل سريعة واحدة أو اثنتين لضمان التبديل الكامل إلى المحلول المنظم الحمضي. بعد ذلك، ننتظر ونراقب استجابة الجدار.عادةً، يمكننا اكتشاف المعدل الأسرع للاستطالة في غضون بضع دقائق. وبعد مرور 60 دقيقة، تتوفر لدينا عادةً معلومات كافية لتقييم استجابة الاستطالة، على الرغم من أن القياسات قد تمتد لفترات أطول في بعض الحالات. ولقياس استطالة الجدار الخلوي الناتجة عن التمدد، نبدأ بعينات جدار خلوية مثبطة حرارياً، ثم يُضاف المنظم الحمضي إلى qve.كما هو الحال في التجربة الأولى، يستقر معدل تمدد الجدار الخلوي تدريجياً عند قيمة منخفضة بسبب غياب التمدد الوظيفي. وبعد حوالي 20 دقيقة من التمدد، يتم إضافة البروتين إلى الـ Q vet عن طريق إضافة من 10 إلى 20 µL من محلول التمدد إلى المنظم الموجود في الـ Q vet. ونظراً لإزالة البشرة، يتغلغل محلول التمدد بسرعة في عينة الجدار الخلوي، ونلاحظ خلال بضع دقائق زيادة في معدل التمدد.يمكن متابعة استجابة التمدد هذه لمدة ساعة أو أكثر. لقد عرضنا لكم للتو كيفية قياس تمدد جدار الخلية الناتج عن البروتينات الممددة (expansins) الداخلية والناتج عن إضافة البروتينات الممددة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تقليل الاهتزازات الميكانيكية وتقلبات درجة الحرارة إلى أدنى حد، لأنها ستتسبب في حدوث ضوضاء في منحنيات التمدد.هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في مقايسات التمديد الخاصة بكم.

measuring-plant-cell-wall-extension-creep-induced-acidic-ph-alpha

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نصف طريقة لرسم خريطة للخصائص الميكانيكية للأنسجة النباتية باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM). نحن نركز على كيفية تسجيل التغييرات الميكانيكية التي تحدث في جدران الخلايا أثناء نمو النبات على نطاق واسع ، مما يتيح ربط هذه التغييرات بالنمو والتشكل الشكلي.

رسم الخرائط على أساس فؤاد للخصائص مطاطا جدران الخلايا: في الأنسجة، الخلوية، وقرارات التحت خلوية

كاليفورنيا 2+ إشارات تنظم العمليات البيولوجية المختلفة في النباتات. هنا نقدم النهج لرصد يسببها الإجهاد اللاحيوي الكالسيوم المكاني والزماني 2+ الإشارات في الخلايا والأنسجة باستخدام المشفرة وراثيا الكالسيوم 2+ مؤشرات Aequorin أو Case12 نبات الأرابيدوبسيس.

قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا 2+ إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

تم تطوير بروتوكول تصوير جديد باستخدام مشغل ميكانيكي مخصص يعمل بمحرك للسماح بقياس الاستجابات في الوقت الفعلي للإجهاد الميكانيكي في الخلايا الحية. فيما يتعلق بعلم الأحياء الميكانيكي ، يمكن للنظام تطبيق سلالات تصل إلى 20٪ مع السماح بالتصوير في الوقت الفعلي تقريبا باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر أو القوة الذرية.

يعيش التصوير خلية خلال الإمتداد الميكانيكية

السليلوز البلوري هو مكون مهم لجدار الخلية النباتية. ومع ذلك ، فإن القياس الكمي بدقة خلوية يمثل تحديا تقنيا.  هنا ، نبلغ عن استخدام تقنية الضوء المستقطب والمقاطع العرضية للجذور للحصول على معلومات عن تكوين جدار الخلية بدقة زمانية مكانية.

قرار الكمي عال من بلوري السليلوز تراكم في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; جذور لرصد الأنسجة محددة جدار الخلية تعديلات

&lt; p class = 'jove_content'&gt; تسهل البروتوكولات الموضحة هنا التحقيق المريح في استجابات الإيثيلين البكتيرية من خلال استخدام حمض 2-كلوروإيثيل فوسفونيك (CEPA).  يتم إنتاج الإيثيلين في الموقع من خلال تحلل CEPA في وسط نمو بكتيري مائي ، والتحايل على متطلبات غاز الإيثيلين النقي.

الاستفادة من مجمع بين الافراج عن الإثيلين، حمض 2-Chloroethylphosphonic، كأداة لدراسة استجابة الإثيلين في البكتيريا

هنا، نقدم مجهرية القوة الذرية (AFM)، تعمل كأداة المسافات البادئة نانو والدقيقة على الخلايا والأنسجة. تسمح الأداة بالحصول في وقت واحد على طوبوغرافيا سطح 3D للعينة وخصائصها الميكانيكية، بما في ذلك معامل جدار الخلية يونغ، فضلا عن ضغط التورغور.

استخدام مجهرية القوة الذرية لقياس الخصائص الميكانيكية وضغط التورغور للخلايا النباتية والأنسجة النباتية

هنا نحن وصف بروتوكول للتصوير الخلية الحية من القشرية المجهرية cytoskeleton في تبادل لاطلاق النار meristem apical ورصد استجابتها للتغيرات في القوات المادية.

حية الخلية التصوير من Microtubule Cytoskeleton والتلاعب micromechanical من عربيدوبسيس تبادل لاطلاق النار Apical Meristem

يوفر بروتوكول المسافة البادئة المجهرية للقوة الذرية إمكانية تشريح دور الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية لخلية معينة من نسيج أو عضو أثناء النمو الطبيعي أو المقيد (أي تحت عجز الماء).

مجهر القوة الذرية لدراسة الخواص الفيزيائية لخلايا البشرة لجذور الأرابيدوبسيس الحية

تعد دراسات الميكانيكا الحيوية لجدار الخلية ضرورية لفهم نمو النبات والتشكل. يقترح البروتوكول التالي لدراسة جدران الخلايا الأولية الرقيقة في الأنسجة الداخلية لأعضاء النبات الفتية باستخدام مجهر القوة الذرية.

توصيف الخواص الميكانيكية للجدار الخلوي الأولي في أعضاء النبات الحي باستخدام مجهر القوة الذرية

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتصوير ديناميكيات جدار الخلية 3-D لأنسجة الطحالب الحية ، مما يسمح بتصور انفصال جدران الخلايا في طفرات ggb وأنماط جدار الخلية السميكة في النوع البري أثناء التطور على مدى فترة طويلة.

تصوير الفاصل الزمني 3-D لديناميات جدار الخلية باستخدام Calcofluor في الطحالب Physcomitrium patens

يصف هذا التقرير الطرق الأساسية المستخدمة لزراعة الطحالب العقدية أحادية الخلية والتلاعب بها تجريبيا. كما يوفر بروتوكولات أساسية للتصوير القائم على الفحص المجهري ، بما في ذلك وضع العلامات على الخلايا الحية بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة ومجسات الفلورسنت الأخرى والفحص المجهري الإلكتروني الماسح.

بروتوكولات الفحص التجريبية والكيمياء المناعية وتقنيات التصوير القائمة على الفحص المجهري للبنيوم مارغريتاسيوم

تعلم قياس تمدد جدار الخلية النباتية المستحث بالرقم الهيدروجيني الحمضي والبروتينات Expansin باستخدام مقياس التمدد بقوة ثابتة. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات نمو النبات.

قياس جدار الخلية النباتية ملحق (زحف) المستحثة بواسطة الرقم الهيدروجيني حمضي والفا Expansin

استكشف المزيد من الفيديوهات