إعداد موحدة وحيدة الخلية معلقات من أنسجة الرئة باستخدام الماوس Dissociator gentleMACS

في بروتوكول الفيديو هذا ، سترى كيفية فصل أنسجة رئة الفأر البالغ باستخدام ماكس لطيف بعد تفكك أنسجة الرئة. في وجود الكولاجيناز d و DNAS ، يتم ترشيح معلقات الخلية الواحدة باستخدام جهاز طرد مركزي مصفاة خلية 70 ميكرون ، ويتم تعليقها لمزيد من التطبيقات. مرحبا ، أنا ميلاني ملو من Mil Biotech في ألمانيا.

سأريكم اليوم إجراء قابل للتكرار وآلي لإعداد معلق خلية واحدة من أنسجة رئة الفأر باستخدام تفكك GenX. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لإعداد معلقات أحادية الخلية لتحضير الكريات البيض أو الخلايا البطانية. حسنا ، هيا بنا نبدأ.

قبل أن نبدأ البروتوكول ، يجب إعداد بعض الحلول القياسية وجاهزة. أولا ، سنحتاج إلى مخزن هيبس العازلة. ثانيا ، محلول الكولاجيناز D يحتوي على 100 ملليغرام لكل مليلتر إنزيم ومخزن هيبس.

ثالثا ، محلول واحد يحتوي على 20 ، 000 وحدة لكل مليلتر داسي واحد. أخيرا ، هناك حلان شائعان للتخزين المؤقت. مخزن مؤقت نموذجي لبرنامج تلفزيون عند درجة الحموضة 7.2 ومخزن مؤقت PEB مشتق من محلول شطف AutoMax ومحلول مخزون BSA.

نبدأ بروتوكولنا برئة تشريح مشتقة من فأر خزعة أنثى يبلغ من العمر ستة إلى سبعة أسابيع. تأكد من خلو الرئة من الأعضاء المجاورة مثل القلب والغدة الصعترية والأوعية الدموية الصادرة والواردة والقصبة الهوائية والأنسجة الضامة. اشطف المنديل في طبق بتري يحتوي على PBS لإزالة كريات الدم الحمراء.

عادة ما تزن رئة الفأر في هذا العمر ما بين 110 و 150 ملليغرام. إذا كنت تخطط لربط الرئتين من الأكبر سنا أو سلالات الفئران الأخرى ، فقم بوزن الأنسجة والمخزن المؤقت. يمكن فصل 450 ملليغرام كحد أقصى من الأنسجة لكل أنبوب واحد.

انقل أنسجة الرئة إلى أنبوب C بحد أقصى لطيف محمل ب 4.9 مل من عازلة heis. أضف 100 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز D إلى التركيز النهائي البالغ ملليغرامين لكل مليلتر إلى أنسجة الرئة والمخزن المؤقت. الآن 10 ميكرولتر داس.

حل واحد لأكثر من 150 ملليغرام من الأنسجة. أضف 20 ميكرولتر من محلول واحد. تأكد من إغلاق الأنبوب C بإحكام وضعه رأسا على عقب على الحد الأقصى اللطيف.

تأكد من وجود الأنسجة بين الدوار والجزء الثابت. حدد برنامج الرئة وقم بتشغيله بالضغط على زر البدء عند انتهاء البرنامج. قم بإزالة الأنبوب C من الجهاز واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة.

في حاضنة 37 درجة مئوية أثناء الحضانة ، يجب تدوير الأنبوب باستخدام محور دوار أنبوب المزيج الأقصى أو تدويره يدويا كل خمس دقائق. بعد الحضانة ، أعد الأنبوب C إلى المعاطر الأقصى اللطيف وقم بتشغيل برنامج الرئة الثاني أثناء تشغيل البرنامج ، قم بإعداد أنبوب سعة 50 مليلتر لجمع الخلايا المفلترة عن طريق استبدال الغطاء بمصفاة خلية شبكية 70 ميكرومتر. بمجرد انتهاء البرنامج المنفصل ، اعتمادا على توزيع عينة المواد في الأنبوب ، قد ترغب في الطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة لتركيز مادة العينة.

يمكن إزالة الخلايا المنفصلة من الأنبوب عن طريق سحب العينات من خلال غطاء الحاجز المغلق للأنبوب C. باستخدام طرف ماصة مناسب سعة 1000 ميكرولتر ، يتم تطبيق تعليق الخلية على مصفاة الخلية لإزالة الجسيمات أو الركام الأكبر. بمجرد تصريف المحلول ، اغسل مصفاة الخلية بإضافة خمسة ملليلتر إضافية من درجة حرارة الغرفة ومخزن مؤقت لتكسير الخلايا المفلترة.

جهاز الطرد المركزي أنبوب 50 مليلتر عند 300 GS لمدة 10 دقائق. الآن قم بشفط المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في الحجم الذي تريده من درجة حرارة الغرفة. عازلة PEB.

لا تصب المادة الطافية. يمكنك الآن المتابعة إلى تطبيق انتقال البيانات من الخادم. سيؤدي تفكك أنسجة رئة الفئران باستخدام هذا الإجراء إلى إنتاج نسبة عالية من الكريات البيض والخلايا البطانية القابلة للحياة.

تم تلطيخ المعلقات أحادية الخلية المشتقة ب CD 45 PE مثل CD 1 46 FITC ، أو CD 31 FITC ، وتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي. يوضح هذا المخطط إثراء الخلايا المتغصنة باستخدام microbeads CD 11 C ، وفاصل الحد الأدنى ، وعمودين MS. حسنًا. لقد أوضحت لك للتو كيفية تحضير معلقات خلية واحدة من أنسجة رئة الفأر بطريقة موحدة باستخدام تفكك المزيج اللطيف وأنابيب C.

تسمح هذه الطريقة بتفكك الأنسجة الفعالة والجنيسة. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم تشريح الرئة بشكل صحيح ومعالجة الأنسجة مباشرة بعد التشريح. يمكن بعد ذلك استخدام معلقات الخلية المفردة المحضرة لمزيد من التجارب.

على سبيل المثال ، وضع العلامات المغناطيسية للخلايا ، ثم فصل الكريات البيض أو الخلايا البطانية. حسنا ، هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.