Immunostaining دفعي للكشف عن البروتين واسعة النطاق في الدماغ القرد الجامعة

تبدأ هذه الإجراءات عند استلام دماغ تم ترويته بـ 4%PFA، وإخراجه، وحمايته بالتجميد، والذي أُرسل إلى شركاء العلوم العصبية للتضمين باستخدام علامات محاذاة مدمجة في المصفوفة المحيطة. يمكن تقطيع الدماغ عند المستوى الإكليلي لإنتاج مقاطع متسلسلة بالسماكة المطلوبة، والتي ستمثل المدى الأمامي الخلفي للدماغ بالكامل باستخدام سلال وحاويات متخصصة. يمكن إجراء المعالجة المناعية للدفعات لتحديد نمط التعبير المكاني لبروتين معين في جميع أنحاء الدماغ.

مرحباً، أنا الدكتورة شاهين زور من مختبر العلوم العصبية البصرية في كلية البصريات بجامعة مونتريال. مرحباً، أنا الدكتور مارك بيرك، أيضاً من مختبر العلوم العصبية البصرية في كلية البصريات بجامعة مونتريال. مرحباً، أنا الدكتور مو بيتو، مدير مختبر العلوم العصبية البصرية في كلية البصريات بجامعة مونتريال.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للتصبيغ المناعي بنظام الدفعات للكشف عن البروتينات على نطاق واسع في دماغ قرد كامل. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة أنماط تعبير البروتينات المستهدفة عبر الدماغ بأكمله، ولمقارنة ومقابلة تعبير تلك البروتينات داخل الدماغ ذاته. لذا، لنبدأ الآن.

قبل المعالجة النسيجية، يتم الحصول على دماغ ربيس، يكون قد تم حفظه عن طريق التروية الجهازية والتثبيت اللاحق، وحمايته بالتجميد باستخدام محاليل سكروز متدرجة التركيز. في هذه المرحلة، يُرسل الدماغ إلى "neuroscience associates" ليتم تضمينه وتقطيعه إلى مقاطع حرة باستخدام تقنيتهم المملوكة. وعند استلامه، سيلاحظ المرء وضع سبع علامات استدلالية للمحاذاة في مصفوفة التضمين، وذلك لضمان توجيه المقاطع بشكل صحيح وإعادة محاذاتها بعد اكتمال المعالجة النسيجية.

أثناء إجراء عملية التقطيع، يتم التقاط صور رقمية يمكن استخدامها لاحقاً لإعادة بناء خرائط تشريحية ثلاثية الأبعاد. يقوم اختصاصي العلوم العصبية بمعالجة أنسجتنا للحصول على مقاطع إكليلية متسلسلة حرة الطفو بسماكة 50 micrometer تشمل الدماغ بأكمله. وبمجرد اكتمال هذه العملية، يمكننا البدء في المعالجة النسيجية للمقاطع.

عندما نبدأ في المعالجة النسيجية، يكون لدينا عادةً حوالي 140 مقطعاً للتعامل معها لكل جسم مضاد أو صبغة. سنقوم هنا بتوضيح التقنية باستخدام عينة أصغر من المقاطع المعالجة بالجسم المضاد SMI 32، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة ضد بروتينات الخيوط العصبية غير المفسفرة. يتم استخدام أطباق وسلال تلوين متخصصة طوال الإجراء، مما يسمح بمعالجة عدد كبير من المقاطع الطافية بحرية في وقت واحد وبكفاءة.

يضمن ذلك اتساق الصبغة الناتجة في جميع المقاطع. تتمثل الخطوة الأولى في تحضين المقاطع في محلول يعتمد على PBS يحتوي على TRITTON X 100 ومصل حصان طبيعي لمدة 60 دقيقة. سيقلل ذلك من الارتباط غير النوعي لجزيئات الأجسام المضادة الذي يؤدي إلى ظهور صبغ خلفية.

بعد ذلك، يتم تحضين المقاطع طوال الليل. وفي اليوم التالي، تُغسل المقاطع لمدة ثلاث فترات، مدة كل منها 10 دقائق، في محلول غسيل، ثم تُحضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في محلول جسيمات مضادة SMI 32 يعتمد على PBS، ومُدعم بـ tritton X 100 ومصل حصان طبيعي. وفي محلول جسيمات مضادة ثانوية Muse مبيوتينية يعتمد على PBS ويحتوي على Triton X 100 ومصل حصان طبيعي.

بعد إجراء ثلاث غسلات إضافية لمدة 10 دقائق لكل منها، توضع المقاطع في محلول من معقد avadon biotin conjugated horse radish peroxidase لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وأخيرًا، وبعد مجموعة أخرى من الغسلات، توضع المقاطع في تفاعل D amino benzine لمدة 10 دقائق، مما ينتج عنه صبغة بنية داخل العصبونات ذات التفاعل المناعي. ثم يتم إيقاف التفاعل بإزالة سلة التصبغ وغمر المقاطع في PBS.

بعد غسل المقاطع من مرتين إلى ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في محلول PBS، تصبح جاهزة للتثبيت بشكل فردي على شرائح زجاجية لبدء عملية التثبيت باستخدام طبق بتري كبير وفرش طلاء ناعمة جداً. تُرفع المقاطع من وعاء محلول PBS وتُثبّت بشكل فردي على شرائح زجاجية مطلية بالجيلاتين. ثم تُترك العينات لتجف في الهواء طوال الليل داخل خزانة استخلاص الأدخنة حتى اليوم التالي.

يتم شطف المقاطع بغمرها في الماء منزوع الأيونات لغسل أي بلورات ملحية قد تكون متبقية من عملية التثبيت. بعد ذلك، يتم تجفيف الشرائح في خطوات متدرجة من الإيثانول، ثم تنظيفها في الزيلين، وتغطيتها باستخدام وسط التثبيت PerMount. في هذه المرحلة، يجب تخزين الشرائح لمدة تتراوح بين أسبوع إلى 10 أيام تقريبًا في وضع أفقي للسماح لوسط التثبيت بالتصلب.

بعد ذلك، يمكن تخزين الشرائح في صندوق شرائح أو إخضاعها للتصوير عبر المجهر. وتنتج هذه الطريقة ملف تعبير كاملاً لبروتين مستهدف معين عبر دماغ القرد بالكامل. نعرض هنا مقاطع إكليلية تمثيلية توفر لقطة لتعبير FMRP و new n و SMI 32.

في دماغ القرد نفسه. لقد أوضحنا للتو كيفية إتمام عملية التلوين المناعي للدفعات لبروتين مستهدف معين في الدماغ بأكمله. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التأكد من خضوع جميع المقاطع لرج خفيف أثناء تحضينها في المحاليل المختلفة، وبقائها مغمورة تماماً في جميع الأوقات.

بالإضافة إلى ذلك، تمهل أثناء تثبيت التشريحات على الشرائح الزجاجية، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من التجاعيد والطيّات دون المساس بسلامة الأنسجة. هذا كل شيء. شكرًا للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.