Immunostaining دفعي للكشف عن البروتين واسعة النطاق في الدماغ القرد الجامعة
يوليو 27, 2009
على نطاق واسع مناعي للبروتينات المستهدفة في جميع أنحاء الدماغ الرئيسيات كله هو ممكن من خلال استخدام نسيج الرواية أساليب التضمين وsectioning جنبا إلى جنب مع استخدام أجهزة مبتكرة لتلوين مجموعة من المقاطع التعويم الحر متعددة في وقت معين.
يبدأ هذا الإجراء عند استلام دماغ PFA مرفوق بنسبة 4٪ ، وخارجي ، ومحمي بالتبريد ، والذي تم إرساله إلى زملاء علم الأعصاب لتضمينه باستخدام معالم المحاذاة المضمنة في المصفوفة المحيطة. يمكن تقسيم الدماغ في المستوى الإكليلي لإنتاج أقسام تسلسلية بالسمك المطلوب ، والتي ستمثل المدى الخلفي الأمامي بالكامل للدماغ باستخدام سلال وحاويات متخصصة. يمكن إجراء المعالجة المناعية الدفعية من أجل تحديد نمط التعبير المكاني للبروتين في جميع أنحاء الدماغ.
مرحبا ، أنا الدكتورة شاهين زور من مختبر علوم الأعصاب البصرية في كلية البصريات بجامعة مونتريال. مرحبا ، أنا الدكتور مارك بيرك ، أيضا من مختبر علوم الأعصاب البصرية في كلية البصريات بجامعة مونتريال. مرحبا ، أنا Dr.Mo بيتو ، مدير مختبر علم الأعصاب البصري في كلية البصريات ، جامعة مونتريال.
سنعرض لك اليوم إجراء لتلوين المناعة دفعة واحدة للكشف عن البروتين على نطاق واسع في دماغ كامل. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة أنماط التعبير عن البروتينات المستهدفة عبر الدماغ بأكمله ومقارنة ومقارنة تعبير تلك البروتينات داخل نفس الدماغ. لذلك دعونا نبدأ.
قبل المعالجة النسيجية ، احصل على دماغ الرئيسيات ، والذي تم الحفاظ عليه عن طريق التروية الجهازية والتثبيت اللاحق والحماية بالتبريد باستخدام محاليل السكروز المتدرجة. في هذه المرحلة ، يتم إرسال الدماغ إلى زملاء علم الأعصاب ليتم تضمينه وتقسيمها مجانا باستخدام تقنيتهم الخاصة. عند العودة ، سيلاحظ المرء أنه يتم وضع سبعة معالم محاذاة في مصفوفة التضمين بحيث يمكن توجيه الأقسام بشكل صحيح وإعادة تنظيمها بعد اكتمال المعالجة النسيجية.
أثناء إجراء التقسيم ، يتم التقاط صور رقمية يمكن استخدامها لاحقا لإعادة بناء الخرائط التشريحية ثلاثية الأبعاد. يعالج Neuroscientist Associates أنسجتنا لإنتاج أقسام إكليلية عائمة حرة بسمك 50 ميكرومتر على الدماغ بأكمله. بمجرد الانتهاء ، يمكننا البدء في المعالجة النسيجية للأقسام.
عندما نبدأ المعالجة النسيجية ، يكون لدينا عادة حوالي 140 قسما للتعامل مع كل جسم مضاد أو بقعة. سنوضح هنا هذه التقنية مع عينة أصغر من الأقسام المعالجة بالجسم المضاد SMI 32 ، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة ضد بروتينات الخيوط العصبية غير الفسفرية. طوال الإجراء ، يتم استخدام أطباق وسلال تلطيخ متخصصة ، مما يسمح بمعالجة عدد كبير من الأقسام العائمة الحرة في وقت واحد وكفاءة.
هذا يضمن أن البقعة الناتجة متسقة في جميع الأقسام. تتمثل الخطوة الأولى في احتضان الأقسام في محلول قائم على PBS يحتوي على TRITTON X 100 ومصل الحصان العادي لمدة 60 دقيقة. سيؤدي ذلك إلى تقليل الارتباط غير المحدد لجزيئات الأجسام المضادة مما يؤدي إلى تلطيخ الخلفية.
بعد ذلك ، يتم احتضان الأقسام بين عشية وضحاها. في محلول الأجسام المضادة SMI 32 القائم على PBS ، المكمل ب tritton X 100 ومصل الحصان العادي في اليوم التالي ، يتم غسل الأقسام لمدة ثلاث فترات مدتها 10 دقائق في محلول الغسيل ثم يتم احتضانها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. في محلول الأجسام المضادة الثانوية القائم على PBS يحتوي على Triton X 100 ومصل الحصان العادي.
بعد مجموعة من ثلاث غسلات إضافية لمدة 10 دقائق ، توضع الأقسام في محلول من مركب بيروكسيداز فجل الحصان المترافق أفادون البيوتين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، بعد مجموعة أخرى من الغسالات ، يتم وضع الأقسام في تفاعل أمينو بنزين D لمدة 10 دقائق ، مما ينتج عنه بقعة بنية داخل الخلايا العصبية المناعية. ثم يتم إيقاف التفاعل عن طريق إزالة سلة التلوين وغمر الأقسام في PBS.
بعد دقيقتين إلى ثلاث مرات ، تكون عمليات الشطف في أقسام PBS جاهزة للتركيب بشكل فردي على شرائح زجاجية لبدء عملية التركيب باستخدام طبق بتري كبير وفرش طلاء ناعمة جدا. يتم رفع الأقسام من حاوية PBS العازلة وتركيبها بشكل فردي على شرائح زجاجية مطلية بالجيلاتين. ثم يسمح للعينات بالجفاف في الهواء طوال الليل في غطاء الدخان في اليوم التالي.
يتم شطف الأقسام عن طريق غمسها في ماء منزوع الأيونات لغسل أي بلورات ملح قد تكون متبقية من عملية التركيب. ثم يتم تجفيف الشرائح في خطوات الإيثانول المتدرجة التي يتم تنظيفها في الزيلين والغطاء المنزلق مع كل وسط تركيب تركيب. في هذه المرحلة ، يجب تخزين الشرائح لمدة أسبوع إلى 10 أيام في وضع أفقي للسماح لوسط التثبيت بالتصلب.
بعد ذلك ، يمكن تخزين الشرائح في صندوق شرائح أو إخضاعها للتصوير عبر الفحص المجهري. تنتج هذه الطريقة ملف تعريف تعبير كامل عن البروتين المستهدف ذي الأهمية عبر دماغ بأكمله. نعرض هنا الأقسام الإكليلية التمثيلية التي توفر لمحة سريعة عن تعبير FMRP و n و SMI 32 الجديد.
في نفس دماغ. لقد أوضحنا لك للتو كيفية إكمال التلوين المناعي الدفعي لبروتين مستهدف محل اهتمام الدماغ كله. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم التأكد من أن جميع الأقسام تخضع لتحريض خفيف أثناء احتضانها في محاليل مختلفة ، وأنها تظل مغمورة تماما في جميع الأوقات.
بالإضافة إلى ذلك ، خذ وقتك أثناء تركيب الزجاج للتشريح وإزالة أكبر عدد ممكن من التجاعيد والطي دون الإضرار بسلامة الأنسجة. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة نهجًا جديدًا للكشف المناعي واسع النطاق للبروتينات المستهدفة عبر دماغ الرئيسيات. تسلط الضوء على أساليب جديدة لتضمين الأنسجة وتقطيعها، إلى جانب تقنيات التلطيخ الجماعي للأقسام الحرة العائمة المتعددة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكشف المناعي
- تصوير الدماغ
الخلفية
- الكشف المناعي مهم لدراسة تعبير البروتين في الدماغ.
- قد تكون الطرق التقليدية محدودة في النطاق والكفاءة.
- التقدم في تقنيات معالجة الأنسجة يمكن أن يعزز قدرات البحث.
- يسمح المعالجة الجماعية بالتحليل الشامل لتوزيع البروتين.
هدف الدراسة
- لتطوير طرق للكشف المناعي واسع النطاق في أدمغة الرئيسيات.
- لتحسين كفاءة تحليل تعبير البروتين.
- لتسهيل دراسة أنماط التعبير المكاني عبر الدماغ.
الطرق المستخدمة
- تعقيم 4% PFA لحفظ الدماغ.
- التضمين باستخدام علامات المحاذاة في مصفوفة محيطة.
- التقطيع في المستوى الإكليلي للأقسام المتسلسلة.
- المعالجة المناعية الجماعية لتحليل تعبير البروتين المكاني.
النتائج الرئيسية
- النجاح في تضمين وتقطيع أنسجة دماغ الرئيسيات.
- القدرة المثبتة على تحليل أنماط تعبير البروتين.
- تقنيات مبتكرة تعزز كفاءة الكشف المناعي.
- إمكانية لتطبيقات أوسع في أبحاث علم الأعصاب.
الاستنتاجات
- تحسن الطرق المتقدمة بشكل كبير في الكشف المناعي واسع النطاق.
- يمكن لهذه التقنيات تعزيز فهمنا لتعبير البروتين في الدماغ.
- يمكن للأبحاث المستقبلية البناء على هذه الطرق لمختلف التطبيقات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Large-scale protein expression mapping in primate brains supports target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery. Batch immunostaining enables reproducible, quantitative assessment of spatial protein distribution across the whole brain, improving predictive confidence in target engagement and pathway modulation. This approach addresses a critical gap in translational research by providing disease-relevant system data for lead identification and preclinical model alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping target protein expression across the entire primate brain.
- Operational Value: Supports biological de-risking through uniform staining of serial sections for consistent target engagement assessment.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing spatially resolved protein expression data for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via batch processing of free-floating sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through synchronized immunostaining of large section sets.
- Strategic Value: Highlights screening readiness and platform reuse for reliable compound evaluation in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through alignment of protein expression patterns with neurological disorder models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation using standardized immunostaining protocols.
- Predictive Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling quantitative measurement of protein levels and neuronal populations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation to preclinical research by enabling spatially resolved protein expression analysis in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through whole-brain protein mapping.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility via batch immunostaining of serial sections.
- Analytics: Highlights quantitative readouts such as protein levels and neuron population counts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via alignment of expression patterns with biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for large-scale protein detection across multiple targets and studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein expression studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of immunostaining workflows for large section sets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early target de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on whole-brain expression profiles.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, immunohistochemistry, and neuroanatomy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including specialized staining dishes, baskets, and microscopy systems.
- Cross-team standardization requirements for section alignment, staining consistency, and data interpretation.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for primate versus rodent brain processing.
- Practical limitations including section handling complexity and mounting precision for large-scale serial sections.
