الكالسيوم في الجسم الحي ^{2 +} -- التصوير من الخلايا العصبية بالجسم فطر خلال التعلم الشم في عسل النحل

يمكن أن يكون مشروطا النحل في نموذج التعلم الشمية مشهي (PER تكييف). استخدام الروائح والمحفزات ، أنشأنا طريقة السلوك التي يتم تسجيلها في حين يستخدم التصوير في وقت واحد لقياس النشاط الكالسيوم أثارت رائحة الجسم في الخلايا العصبية الفطر

يبدأ هذا الإجراء بتثبيت النحلة في غرفة التسجيل. تتم إزالة قطعة من بشرة من كبسولة الرأس لتلطيخ هياكل محددة في الدماغ. يتم تسجيل إشارات الكالسيوم في الخلايا العصبية الملطخة في الجسم الحي باستخدام إعداد تصوير واسع المجال.

أثناء التصوير ، يمكن تحفيز النحلة بالروائح أو توصيل السكروز إلى الهوائي. بهذه الطريقة ، قد يتم تكييف النحلة لتمديد خرطوم استجابة للرائحة. تتم مراقبة استجابة تمديد خرطوم باستخدام تسجيلات مخطط كهربية العضل من عضلة M 17.

بعد تجربة التصوير ، يتم تشريح الدماغ لإجراء فحص فاحص للهياكل الملطخة باستخدام مجهر متحد البؤر. مرحبا ، أنا ميلاني من مختبر rdo Mansel. مرحبا ، أنا أنيا أيضا من مختبر مانسيل.

سنعرض لك اليوم إجراء لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي وجسم فطر نحل العسل. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الترميز الشمي واللدونة المتعلقة بالتعلم في دماغ نحل العسل. لذلك دعونا نبدأ.

ابدأ باصطياد علف نحل العسل عند مدخل الخلية ، ثم قم بتثبيته عن طريق تبريده على الجليد. بعد ذلك ، قم بتركيب النحلة على غرفة تسجيل زجاج شبكي. استخدم شمع صلب منخفض نقطة الانصهار لتثبيت العينين والصدر على الحائط.

كلها تكسر الشعيرات الدموية الزجاجية عند الحافة للحصول على قطر 10 ميكرون. قم بتغطية طرف الشعيرات الدموية بعجينة d تتكون من خليط من 10 إلى واحد من URA اثنين من الدكسترين ودكسترين رودين القابل للإصلاح. سيتم استخدام الشعيرات الدموية المحضرة للتلطيخ.

لبدء إجراء التلوين ، قم أولا بتثبيت الهوائيات باستخدام koane. افتح كبسولة الرأس فوق الدماغ عن طريق إزالة قطعة من بشرة ودفع الغدد والقصبة الهوائية إلى الجانبين ، مما يسمح بالوصول إلى جسم الفطر. استخدم قطعة من الورق لامتصاص اللمف الدموي داخل كبسولة الرأس.

لتلطيخ الخلايا العصبية في جسم الفطر ، قم بحقن الشعيرات الدموية في المنطقة سوما أو المنطقة المتغصنة من الخلايا العصبية. ثم قم باستعادة قطعة بشرة على كبسولة الرأس وفك الهوائي. أخيرا ، قم بإطعام النحلة بمحلول سكروز بنسبة 30٪ وقم بتخزينها في صندوق من الستايروفوم مغطى بمنشفة مطبخ مبللة لمدة أربع ساعات على الأقل أو طوال الليل عند 20 درجة مئوية.

مع اكتمال التحضير B ، يمكننا أن نبدأ في التصوير في الجسم الحي. للبدء ، استخدم إسفنجة متصلة بغرفة التسجيل لمنع النحلة من التحرك ، والضغط عليها على البطن. الآن قم بإصلاح هوائيات النحلة باستخدام ioane لمنع الدماغ من الحركة بسبب ضخ المريء.

قم بقطع شق صغير في البشرة فوق الشفا واسحب المريء والهياكل الصلبة المحيطة به بعناية وقم بتغطيتها بمكونين من السيليكون. بعد ذلك ، استخدم إبرة لعمل ثقوب لإدخال أقطاب كهربائية سلكية تستخدم لتسجيل الكتراب من عضلة المنقلة في الشفرين. قم بإزالة قطعة البشرة والقصبة الهوائية والغدد فوق الدماغ.

استخدم قطعة من الورق لامتصاص الهيمو داخل كبسولة الرأس لتسجيل الآلات الكهربائية من M 17. حقن سلك نحاسي في العضلة بالقرب من أجزاء الفم. حقن قطب كهربائي أرضي في العين.

الآن املأ كبسولة الرأس باثنين من السيليكون المكون. تأكد من تغطية الدماغ بالكامل. ضع النحلة على مرحلة المجهر وضع قطرة ماء على سطح السيليكون.

اغمر هدف الغمس في المجهر في القطرة ، ثم ركز على الخلايا العصبية المرحلية. مع اكتمال التحضير للتصوير في الجسم الحي ، يمكننا الآن وصف تحفيز الرائحة وتسجيل الإشارة. لتوصيل محفزات الرائحة إلى النحلة ، نستخدم مقياس الرائحة المصمم خصيصا الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر لتخفيف الروائح الكريهة في تيار هواء ثابت.

يتكون تحفيز الرائحة الموجه إلى الهوائي من نبضة ثلاث ثوان من الهواء المشبع بالرائحة. بالنسبة لتصوير الكالسيوم ، نستخدم إعداد تصوير ضوئيات til مثبتا على مجهر فلوري zes لتسجيل الصور في درجة حرارة الغرفة بمعدل أخذ عينات يبلغ خمسة هرتز. يتم تسجيل إشارات الكالسيوم من خلال هدف تراجع أوليمبوس X 60 0.9 W مع كاميرا Ango CCD ، ويستمر كل قياس 10 ثوان.

يتم تضخيم إمكانات العضلات باستخدام مضخم عشب وتسجيلها ورقمنتها باستخدام محول رقمي تناظري. تستخدم التسجيلات من M 17 لمراقبة الاستجابات السلوكية المتعلقة بالتعلم مع اكتمال تسجيل الإشارة ، ويمكننا الآن الانتقال إلى التحليل المورفولوجي وإعادة البناء. لأن كلا الأصباغ المستخدمة أثناء الردم لهما نفس الوزن الجزيئي.

تقع في مواقع مشتركة في الخلايا العصبية. التصوير واسع المجال له دقة مكانية محدودة ، لذلك نستخدم الفحص المجهري الماسح متحد البؤر للتحقق من الهياكل الملطخة. بعد التجربة ، قم أولا بتشريح الدماغ وتثبيته طوال الليل في 4٪ فورمالديهايد عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي ، واشطفه في PBS ثم قم بتجفيفه في خطوات الإيثانول 10 دقائق في 50٪ 70٪ 90٪ 99٪ ومرتين 10 دقائق في 100٪ ضع الدماغ على شريحة كائن مخدد مع قطرة من غطاء الميثيل ساليسيلات ، انزلق ثم ضعه على مرحلة المجهر في مجهر المسح متحد البؤر.

امسح الدماغ بعدسة موضوعية هوائية وتكبير/تصغير رقمي من 1.1 إلى 1.2 بأربعة أقسام بصرية ميكرومترية. هنا نرى استجابة الخلايا العصبية الخارجية لجسم الفطر لتحفيز رائحة الهوائيات المسجلة من خلال هدف 60 × وتصورها بألوان زائفة. يمثل المربع الأحمر على اليسار استمرار محفز الرائحة.

بعد التجربة ، يتم تشريح الدماغ وفحص هياكل البقع بمزيد من التفصيل باستخدام مجهر متحد البؤر بتكبير 20 ×. لذلك أوضحنا لك للتو كيفية تصوير الخلايا العصبية لجسم الفطر في نحل العسل أثناء التعلم الشمي. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن التجارب التي تنطوي على أصباغ حساسة للضوء يجب إجراؤها في الظلام.

هذا كل شيء. شكرا للمشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك. رافقتك السلامة.