جيل من الخلايا البشرية باء تنشيط CD40

مرحباً، اسمي ألكسندر شيكو فان هاجن. أنا عضو في مختبر المناعة الثاني ومناعة النقل في مستشفى جامعة كولونيا. سنوضح لكم في هذا الفيديو كيفية توليد خلايا B البشرية المنشطة بواسطة CD 40 من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي.

أحد الاهتمامات الرئيسية لمختبرنا هو دراسة الوظائف غير المعتمدة على الأجسام المضادة للخلايا B. فبالإضافة إلى دورها كمنتجة للأجسام المضادة، تلعب الخلايا B دوراً هاماً كخلايا عارضة للمستضدات سواء في الظروف الفسيولوجية أو في أمراض المناعة الذاتية. وبعد التنشيط، يمكن للخلايا B أن تكتسب قدرات قوية على عرض المستضدات وتحفيز المناعة، خاصة عند تنشيطها عبر CD 40.

CD 40. تتمتع الخلايا البائية المنشطة بعدة مزايا عند مقارنتها بالخلايا التغصنية؛ حيث يمكن توسيعها بسهولة وبتكلفة منخفضة نسبيًا من كميات صغيرة من الدم المحيطي، حتى من مرضى السرطان.

ستقدم لكم الآن طالبة الدكتوراه تانيا ليف وفني المختبر LER مقدمة خطوة بخطوة حول كيفية توليد خلايا B البشرية المنشطة بواسطة CD 40 من الدم المحيطي. مرحباً، اسمي تانيا ليفي، وأنا طالبة دكتوراه، وأود أن أوضح لكم كيفية توليد خلايا B البشرية المنشطة بواسطة CD 40.

تم تحسين هذا الإجراء في مختبرنا. تتمثل الخطوات الرئيسية، أولاً، في تحضير الخلايا المغذية. ولذلك، نستخدم خلايا N IH 33 المنقولة جينياً لبروتين CD 40 ligand البشري، والتي يتم تعريضها لإشعاع بجرعة 78 gray ثم زرعها في أطباق ذات ستة آبار.

ثانياً، نبدأ باستزراع خلايا B البشرية المنشطة بـ CD 40 من خلايا PBMC منقاة، والتي تُعالج بإنترلوكين 4 البشري وسيكلوسبورين A، ثم تُزرع هذه الخلايا في أطباق ذات ستة آبار. تُكرر هذه الإجراءات في اليوم السابع، ثم كل ثلاثة إلى أربعة أيام حتى اليوم 14 من استزراع الخلايا. وللحصول على خلايا B بشرية منشطة بـ CD 40 عالية النقاء، نبدأ عملية توليد خلايا B المنشطة بـ CD 40 باستخدام خلايا PBMC بشرية منقاة حديثاً أو مجمدة بشكل مناسب.

أولاً، نقوم بغسل خلايا pbmc لمرتين، حيث يتم إعادة تعليق الخلايا في 50 milliliter من PBS. يتم تدوير PBMC بالطرد المركزي لمدة سبع دقائق بسرعة 1300 RPM ما يعادل 260 5G. بعد ذلك، يتم التخلص من السائل الطافي وإعادة تعليق الخلايا مرة أخرى في 50 milliliter من PBS، ثم تدويرها مجدداً لمدة سبع دقائق بسرعة 1100 RPM ما يعادل 190 G. يتم التخلص من السائل الطافي مرة أخرى من أجل تحديد عدد الخلايا.

قم بتعليق خلايا PBMC في 20 milliliter من PBS، وامزج الخلايا جيداً باستخدام جهاز الـ vortex، ثم حدد عدد الخلايا. قم بطرد كمية PBMC المطلوبة لزراعة CD 40 B مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 1200 RPM ما يعادل 220 5G. باستخدام طبق سداسي الفجوات، ستحتاج إلى 4 × 10⁶ خلية لكل فجوة، أي ما مجموعه 24 × 10⁶ خلية لكل طبق.

بعد ذلك، أعِد تعليق خلايا PBMC بتركيز 1×10⁶ خلية/مل في وسط استنبات CD 40 B. أضف إلى معلق الخلايا IL-4 بشرياً طازجاً بتركيز 50 unit/ml للتحفيز، وcyclosporine A بتركيز 0.63 µg/ml لتثبيط نمو الخلايا التائية. الآن أصبح معلق PBMC جاهزاً للتحفيز باستخدام CD 40 ligand.

على حد علمنا، لا يتوفر حالياً ربيطة SOMAL CD 40 ذات درجة تصنيع صيدلاني جيدة (GMP). وبناءً على ذلك، نستخدم خلايا NIH three T three المنقولة جينياً لإنتاج ربيطة CD 40 البشرية لتحفيز بقاء الخلايا وتمايزها وتكاثرها، نظراً لقدرة خط خلايا NIH three T three على البقاء في المزرعة لعدة أشهر. ويجب استبعاد فقدان تعبير ربيطة CD 40 عن طريق الفحص الدوري.

تعد سلالة خلايا NIH 3T3 المنقول إليها CD 40 ligand سلالة خلوية ملتصقة، وتُزرع عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% CO2 في وسط انتقائي مُدعّم بـ G 4 1 8 بتركيز 0.7 mg/mL. يجب ألا تصل هذه السلالة من الخلايا الليفية الملتصقة إلى مرحلة التلاقي الكامل، ويجب تقسيمها مرتين أسبوعياً. لتقسيم الخلايا الملتصقة، يتم سحب الوسط وغسلها مرة واحدة باستخدام 10 mL من PBS مع التدوير برفق. ثم يُسحب الوسط مرة أخرى ويُضاف 4 mL من trypsin EDTA في دورق مساحته 75 cm².

يتم تحضين الدورق لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق عند درجة حرارة 37 °C في المحضنة. ثم يتم إخراج الدورق مرة أخرى، واستخدام النقر الخفيف لفصل الخلايا عن البلاستيك.

ثم أضف 10 milliliter من الوسط الغذائي للنمط البري، وقم بالتدوير برفق، وانقل الخلايا إلى أنبوب سعة 50 milliliter. قم بطرد خلايا NA eight three T three مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 1200 RPM ما يعادل 125G. أعد تعليق الخلايا المترسبة بعناية في 10 millimeter من الوسط الغذائي للنمط البري.

قم بتحديد عدد الخلايا للمزرعة الفرعية الثالثة من NIH 3T3، ثم أعد تعليق 1.5 × 10⁶ من الخلايا المغذية في 10 ملليلتر من الوسط البري. انقلها إلى قارورة بمساحة 75 سنتيمتر مربع وأضف G 418 بتركيز 0.7 ملجم/ملل لاختيار الخلايا المنقولة التي تحمل جينات مقاومة النيوميسين. أخيراً، قم بحضن الخلايا المغذية عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 من أجل تحفيز CD 40 B.

خذ بقية خلايا NI 8 3 3 وقم بتعريضها لإشعاع قاتل بجرعة 78 غراي لوقف تكاثرها. قم بتخفيف الخلايا المغذية المشععة في وسط من نوع wire بحيث تكون الكثافة الخلوية 0.1 × 10⁶ خلية/مل، ثم وزع 2 مل لكل بئر في طبق مكون من ستة آبار. اترك الخلايا في أطباق الآبار الستة لتلتصق مرة أخرى قبل استخدامها كخلايا مغذية، وذلك بتحضينها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و5% CO2 لتحفيز الخلايا اللمفاوية البائية باستخدام ربيطة CD 40.

تحقق باستخدام المجهر مما إذا كانت الخلايا المغذية التي تم استزراعها قبل يوم واحد ملتصقة. إذا كانت الخلايا المغذية ملتصقة، قم بإزالة SUP natin من كل بئر واغسلها بسرعة مرتين. أولاً، اغسل كل بئر باستخدام 2 mL من PBS، وثانياً باستخدام 2 mL.

وسط غسيل CD 40 B لتحفيز معلق PBMC. يتم تحضيره قبل فترة وجيزة بكثافة خلوية تبلغ 1×10⁶ خلية/مل للخلايا المغذية. وللقيام بذلك، انقل بلطف 4 ml من معلق الخلايا إلى كل منها.

يتم تحضين الطبق عند 37 درجة مئوية في 5%CO2 في اليوم السابع. يمكن استزراع خلايا CD 40 B فرعياً في المرة الأولى لخلايا CD 40 من خلايا B المنشطة في اليوم السابع، ثم إجراء عمليات استزراع فرعي لاحقة كل ثلاثة إلى أربعة أيام.

قم بحصاد الخلايا المتجمعة برفق من طبق الـ six 12 عن طريق إعادة التعليق (Resus)، مع تعليقها باستخدام ماصة 10 milliliter. انقل خلايا CD 40 B إلى أنبوب 50 milliliter. قم بطرد خلايا CD 40 B مركزياً لمدة سبع دقائق عند 1200 RPM بما يعادل 220 5G تماماً.

استبدل الوسط بوسط غسيل CD 40 B وقم بتحديد عدد الخلايا لـ CD 40. الخلايا البائية المنشطة. أعد تعليق خلايا CD 40 B بتركيز 1 × 10⁶ خلية/مل في وسط استنبات CD 40 B.

بعد ذلك، يتم تدعيم معلق الخلايا بـ human IL-4 طازج بتركيز 50 units/mL و cyclosporine A بتركيز 0.63 µg/mL للتحفيز. تُستخدم خلايا مغذية مشععة تم تحضيرها قبل يوم واحد. وبالطبع، يجب فحص التصاق الخلايا المغذية المشععة مرة أخرى تحت المجهر مباشرة قبل الاستخدام.

إذا كانت الخلايا ملتصقة، يتم غسل الخلايا المغذية سريعاً لمرتين؛ المرة الأولى باستخدام PBS، والمرة الثانية باستخدام وسط غسيل CD 40 B، ثم يتم سكب 4 mL بعناية من معلق CD 40 B المعدل بتركيز 1×10⁶ خلية/mL في كل بئر من أطباق الزرع ذات الستة آبار. يتم تكرار استزراع الخلايا بشكل متماثل بعد ثلاثة إلى أربعة أيام، مرتين أسبوعياً، وصولاً إلى تكوين تجمعات خلوية من خلايا B البشرية النشطة بواسطة CD 40 وعالية النقاء في اليوم 14 من الزرع.

في هذه المرحلة، تعبر خلايا B CD 40 عن جزيئات تحفيز مشترك مثل CD 80 وCD 86 وCD 83 وجزيئات MHC، وما يسمى بالثلاثية الموجهة للعقد اللمفاوية المكونة من ربيطة CD 62 وCCR seven وLFA one، والتي يمكن التحقق منها بواسطة Fox أثناء التوليد. لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، يرجى الرجوع إلى النسخة النصية من هذا البروتوكول. نأمل أن تعمل خلايا B المنشطة بواسطة CD 40 في المستقبل كأداة مهمة للعلاج المناعي للسرطان.

بالتوفيق في تجاربكم.