باستخدام كراب حدوة الحصان ، الليمول Polyphemus ، في أبحاث الرؤية

مرحباً، أنا كريس باغليا، مدير مختبر معالجة المعلومات البصرية هنا في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة بوسطن. مرحباً، أنا جاك ليو، طالب دكتوراه في مختبر الدكتور باغليا. تتوجه الجهود البحثية في مختبرنا نحو فهم الحوسبة العصبية التي تمكن الحيوانات من الرؤية.

نستخدم في هذا البحث أحد أقدم الكائنات على وجه الأرض، وهو سلطعون حدوة الحصان الأمريكي. قد تُعتبر هذه الحيوانات أحافير حية، ولا تزال تؤدي دوراً لا غنى عنه في الأبحاث الطبية الحيوية.

لا يحتوي دم هذه الكائنات على خلايا خاصة يستخدمها العلماء للكشف عن السموم البكتيرية في أدويتنا فحسب، بل تحتوي عيونها أيضاً على شبكة عصبية قدمت رؤى عميقة حول كيفية عمل نظامنا البصري. وقد كُشف لأول مرة عن الأساس الخلوي لعمليات مثل التكيف الضوئي والتثبيط الجانبي في دراسات أجريت على العيون الجانبية المركبة لهذا الحيوان، وبفضل هذا العمل الرائد، حصل الدكتور Keffer Hartline على جائزة نوبل في عام 1967. ولا يزال سلطعون حدوة الحصان نموذجاً جذاباً لأبحاث الرؤية لأن الحيوان كبير وقوي بالنسبة للافقاريات، كما أن عصبوناته الشبكية كبيرة ويسهل الوصول إليها.

يتميز جهازها البصري بكونه مدمجاً ومدروساً بشكل مكثف، كما أن سلوكها البصري محدد بدقة. علاوة على ذلك، تخضع بنية العين ووظيفتها لتعديلات يومية بواسطة ساعة بيولوجية في دماغ الحيوان. وباختصار، فإن الجهاز البصري لسلاطين البحر (horseshoe crabs) بسيط بما يكفي لفهمه، ومع ذلك فهو معقد بما يكفي ليكون مثيراً للاهتمام.

سنوضح في هذا الفيديو ثلاثة نماذج تجريبية لاستقصاء الأساس العصبي للرؤية يمكن إجراؤها داخل الجسم الحي باستخدام هذا النموذج الحيواني الكلاسيكي. وبالنسبة لأبحاث الرؤية، تشمل هذه النماذج تسجيل تخطيط كهربائية الشبكية، وتسجيل العصب البصري، والتسجيل داخل الشبكية. يتم الاحتفاظ بسلاطات حدوة الحصان في خزان مياه مالحة مهواة في غرفة معرضة لدورة ضوء وظلام منظمة.

قبل البدء في أي من تقنيات التسجيل هذه، يتم تبريد الحيوانات في وعاء ثلجي لمدة 10 دقائق تقريبًا، ثم تُثبت على منصة خشبية عن طريق وضع مسمارين من الفولاذ المقاوم للصدأ في الـ pro soma ومسمارين في الـ EPIs soma. يتم تثبيت المنصة من الأسفل باستخدام الجرانيت لضمان غمرها في الماء. ويُستخدم تخطيط كهربائية الشبكية أو ERG لمراقبة حساسية العين بمرور الوقت.

يقيس هذا الاختبار الاستجابة الكهربائية الإجمالية لجميع خلايا العين. ولإجراء ومضات ضوئية، تشمل الأدوات المطلوبة لهذا الإجراء مفك براغي، وفازلين، ومحلول رينجر، وماصة، ومصباح LED، وغرفة تسجيل، وبراغي من الفولاذ المقاوم للصدأ، ومسحة قطنية. ونستخدم غرفة تسجيل مصنعة ذاتياً لقياس ERG.

تم تصميم الجسم ليحتوي على خزان محلول ملحي يكون على تلامس مع العين. ويحتوي الغطاء على سلك من كلوريد الفضة لربط المحلول الموصل بمضخم، بالإضافة إلى ثقب صغير بحجم يتناسب مع تثبيت LED قبل عملية التجميع. كما يتم طلاء الجانب السفلي من الغرفة بالفازلين.

يتم بعد ذلك تثبيت الغرف فوق عين سلطعون حدوة الحصان باستخدام مسمارين، ثم تُملأ بمحلول ملحي وتُغطى. يوضع الحيوان في قفص محكم الإغلاق ضد الضوء داخل خزان مملوء بمياه البحر بحيث تغمر المياه الخياشيم. ثم يتم إدخال كابل LED في غطاء الغرفة.

يتم تثبيت سلك الإشارة بسلك الغرفة، وسلك المرجع بأحد البراغي المزروعة، ثم يتم توصيل كلا السلكين بمرحلة الرأس لمضخم تفاضلي عالي المقاومة من أجل تضخيم الإشارة وترشيح الضوضاء. بعد ذلك، يتم إغلاق القفص لمنع ضوء الغرفة من الوصول إلى الحيوان. يتم توصيل مرحلة تحويل الإشارة (ad stage) بالمضخم، وتُضبط مرشحات المضخم لتمرير الترددات التي تقل عن 10 hertz تقريبًا.

من هناك، تنتقل الإشارة صعوداً إلى راسم الإشارة (oscilloscope) للعرض وإلى لوحة الحصول على البيانات للتحليل والتخزين بواسطة الحاسوب؛ حيث نستخدم برنامجاً مُصمماً خصيصاً ومكتوباً بلغة lab view لإرسال المحفزات الضوئية من الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) وتسجيل إشارة تخطيط كهربائية الشبكية (ERG). يتم تحفيز الـ LED بنبضة مدتها 100 millisecond وبجهد خمس vols كل 10 دقائق. يظهر على اليسار شكل موجة الـ ERG لكل ومضة ضوئية، بينما يتم رسم سعة الذروة إلى الذروة لموجات الومضات المتتالية على اليمين لتتبع التغيرات في حساسية العين بمرور الوقت.

من خلال تسجيلات تخطيط كهربائية الشبكية (ERG)، يمكن دراسة تأثيرات التكيف الضوئي والتعديل العصبي اليوماوي. حيث تنقل العين الرسائل البصرية إلى الدماغ عبر استجابات النبضات في ألياف العصب البصري. ويمكن دراسة هذه الرسائل المشفرة عن طريق التسجيل خارج الخلية من ألياف عصبية مفردة.

يمكن أيضاً دراسة رسائل الساعة البيولوجية التي تعود تغذيتها الراجعة إلى العين باستخدام هذه الطريقة. تشمل الأدوات اللازمة لهذا الإجراء مفك براغي، ومحلول رينجر، ومقصات، وغرفة تسجيل، وملاقط منحنية، ومسبار إبرة دقيقة، ومشرط غير حاد، ومقصات جراحية، وقطباً كهربائياً مقطعياً. صُممت غرف التسجيل بلسان لاستيعاب العصب، ويمكن سحب 20 milliliters من الدم من الحصان عن طريق إدخال إبرة قياس 16 gauge بين العضلات المفصلية وصولاً إلى القلب.

إفراغ الدم ليس ضرورياً، ولكنه يجعل تشريح العصب البصري أسهل مع تثبيت الحيوان على المنصة. يتم تقدير موقع العصب البصري عن طريق رسم خط منحني قليلاً على غشاء الكاربس (carpus) بين العينين الجانبية والوسطى. ثم يتم عمل ثقب دائري في غشاء الكاربس باستخدام مسبار دقيق.

يكون قطر الثقب مساوياً لقطر قاع الحجرة. ويقع مركز الثقب على بُعد حوالي سنتيمترين أمام العين الجانبية، وبشكل ظهري قليلاً بالنسبة للخط بحيث يمتد العصب على طول الجزء البطني من الحجرة. يتم إزالة الأنسجة الضامة التي تغطي العصب حتى يظهر طول العصب بالكامل، ثم يتم تحرير العصب المكشوف من الأنسجة المحيطة والواقعة تحته. يتم لف خيط حول العصب وسحبه إلى داخل الحجرة من خلال الفتحة نصف الدائرية الموجودة في القاع.

من خلال هذه الفتحة نفسها، يتم توجيه العصب برفق إلى داخل الغرفة عن طريق سحب الخيط. وعندما يدخل العصب إلى الغرفة، يتم دفع قاعها داخل الفتحة لتقليل الشد الواقع على العصب. ثم يتم تثبيت الغرفة باستخدام مسمارين وملؤها بمحلول رينجر.

بعد تثبيت الغرفة، يوضع الحيوان في قفص خفيف مربوط في حوض مملوء بمياه البحر تغمر الخياشيم. يتم فحص الجزء الداخلي من الغرفة باستخدام المجهر المجسم، ويُوضع القطن حول الفتحة السفلية لمنع تسرب الدم إلى داخل الغرفة وتسرب محلول رينجر إلى خارجها. ثم تُملأ الغرفة مجدداً بمحلول رينجر طازج.

تتم إزالة الأنسجة المتبقية باستخدام مقصات دقيقة وملاقط. يتم إجراء قطع صغير في الغمد الذي يحيط بالعصب، ثم يُفصل العصب عن الغمد باستخدام مسبار إبري دقيق. يُفك الغمد تدريجياً ويُزال عن طريق القطع على طول العصب.

يتم بعد ذلك فصل حزمة ليفية صغيرة من العصب باستخدام المسبار، وتُقطع من الطرف الأبعد عن العين في حالة تسجيل الألياف الواردة، ومن الطرف الأقرب إلى العين في حالة تسجيل الألياف الصادرة. ولعملية التسجيل، نستخدم قطباً كهربائياً مقطعياً من نظام AM مملوءاً بمحلول Springer، ويكون متصلاً عبر أنابيب بمحقنة Gilman لعملية الشفط. يتم تصنيع طرف القطب الكهربائي عن طريق صقل نهاية شعيرة زجاجية من بوروسيليكات بقطر 1 mm باستخدام اللهب، ويقوم التوصيل B و C بتوفير سلك الإشارة، بينما يكون سلك المرجع عبارة عن سلك من كلوريد الفضة الملفوف حول القطب لتقليل الضجيج.

يتم وضع طرف القطب الكهربائي داخل غرفة التسجيل، ويُسحب الطرف المقطوع من الحزمة العصبية إلى داخل الطرف الزجاجي عن طريق الشفط. يتم توصيل أسلاك الإشارة والمرجع بالمرحلة الرأسية لمضخم تفاضلي لتضخيم الإشارة وترشيح الضوضاء. ثم تُمرر مخرجات المضخم إلى راسم الإشارة (oscilloscope) للعرض، وإلى بطاقة الحصول على البيانات لتحليلها وتخزينها بواسطة الكمبيوتر.

نستخدم برنامجاً مُصمماً خصيصاً ومكتوباً بلغة LabVIEW للتحكم في المحفزات الضوئية، ومميزاً رقمياً للنبضات (digital spike discriminator) لتسجيل سلاسل النبضات. ويُستخدم أنبوب ضوئي من الألياف البصرية لإضاءة خلية واحدة، بينما تُستخدم شاشة عرض فيديو يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر لتحفيز الأنماط مع تسجيلات العصب البصري؛ حيث يمكن دراسة نقل الإشارات بين العين والدماغ داخل الشبكية. يتضمن التسجيل إدخال قطب كهربائي دقيق (micro electrode) مباشرة في خلايا العين وتسجيل تقلبات الجهد داخل الخلوية الناتجة عن الضوء.

تشمل الأدوات المطلوبة لهذا الإجراء مفك براغي، ومنصة شفافة على شكل حرف L. وتتضمن ثقوب البراغي اللولبية قطبًا كهربائيًا دقيقًا فوق القطب الزجاجي، وبراغي من الفولاذ المقاوم للصدأ، وملاقط، ومشرطًا دقيقًا. بعد تثبيت السلطعون، يتم تثبيت شجرة محكمة، ومنصة خشبية، ولوح شفاف يحتوي على ثقوب براغي محددة مسبقًا في الرصغ باستخدام برغيين على الجانب وبرغي واحد في الأعلى.

يوضع الحيوان في قفص محكم الإغلاق ضد الضوء داخل خزان مملوء بمياه البحر تغمر الخياشيم. يتم تثبيت جهاز تحديد مواقع دقيق بمحرك في الشفرة باستخدام براغي، ويتم محاذاة ذراع جهاز تحديد المواقع فوق العين. تُسحب مجموعة من الماصات الزجاجية الدقيقة من زجاج السيليكات بقطر خارجي يبلغ 1 mm، ثم تُملأ الأطراف عكسياً عن طريق الخاصية الشعرية.

من خلال وضع الماصات في قارورة تحتوي على محلول كلوريد البوتاسيوم بتركيز 3 molar لبضع دقائق، يتم ملء بقية الماصة يدويًا بمحلول الملح ثم تُدخل في حامل أقطاب دقيقة مملوء مسبقًا بالمحلول لمنع تكون الفقاعات. بعد ذلك، يُدخل حامل القطب في المرحلة الرأسية لمضخم داخل خلوي مثبت في جهاز تحديد المواقع الدقيقة. ويتم كشف جزء من الشبكية عن طريق القطع الدقيق لمقطع مربع صغير من القرنية الظهرية.

باستخدام المشرط، توضع قطرة من محلول Ringer على النسيج المكشوف لمنع جفافه، ثم يتم دفع الماصة الدقيقة باتجاه الشبكية. وعندما يلامس طرف الماصة المحلول، يتم تفعيل وضع الحقن الحالي لمضخم الإشارات داخل الخلوية وقياس ممانعة القطب الكهربائي؛ حيث يتم استبعاد الماصات الدقيقة التي تقع ممانعتها خارج نطاق 20 إلى 70 mega ohms. أما الماصات التي تقع ضمن هذا النطاق، فيتم دفعها داخل الشبكية بخطوات ذات أحجام ميكروية، ويتم غرسها في الخلايا عن طريق هز الطرف إلكترونياً، كما تُقدم محفزات ضوئية لغرس الخلايا باستخدام أنبوب ألياف ضوئية أو شاشة فيديو.

يمكن العثور على ثلاثة أنواع من الخلايا في عين سلطعون الحدو، وهي الخلايا العلار (ular cells)، والخلايا اللامركزية (eccentric cells)، والخلايا الصبغية (pigment cells)؛ حيث تُظهر الخلايا العلار استجابة مزيلة للاستقطاب تكون كبيرة تجاه الضوء، بينما تُظهر الخلايا اللامركزية سلسلة من جهود الفعل التي تتركز فوق استجابة مزيلة للاستقطاب، أما الخلايا الصبغية فلا تُظهر أي استجابات ضوئية على الإطلاق. يتم رصد الاستجابة باستخدام راسم الإشارات (oscilloscope) وتسجيلها بواسطة جهاز كمبيوتر عبر تسجيلات داخل الشبكية. وبذلك يمكن دراسة الأساس الخلوي للرؤية.

وختاماً، فقد أوضحنا كيفية إجراء تسجيلات تخطيط كهربية الشبكية، وتسجيلات العصب البصري، والتسجيلات داخل الشبكية على سرطان حذاء الفرص في الجسم الحي. وتنتشر هذه الطرق على نطاق واسع في الاستخدام وتوفر رؤى فريدة حول الآليات العصبية لمعالجة المعلومات البصرية لدى سرطان حذاء الفرص. وهي ليست سهلة التطبيق في مختبر الأبحاث فحسب، بل يمكن دمجها بسهولة في مختبر تعليمي حول الفسيولوجيا العصبية البصرية.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.