مكتبة كبيرة إدراج الجينوم البيئية الإنتاج

مرحباً، أنا ماركوس من مختبر ستيفن هيلم في قسم الميكروبيولوجيا والمناعة بجامعة كولومبيا البريطانية. سنعرض لكم اليوم إجراءً لبناء مكتبة بيئية ذات إدراجات كبيرة. وتساعدني في إجراء اليوم سان لي، التي ستقوم بتغليف العاثيات وإصابة المضيف من بكتيريا e coli الخاصة بالمكتبة، بالإضافة إلى إليز هوللي وتشين يانغ اللذين سيقومان بعملية اختيار المستعمرات.

نعتمد هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة بنية المجتمع الميكروبي وعمليات الأيض في البيئات البحرية والبرية. لذا، لنبدأ العمل. يبدأ هذا البروتوكول لإنشاء مكتبة DNA من نوع fosmid بعد عمليات عزل وتقطيع الـ DNA الجينومي من عينات الكتلة الحيوية، وهي الإجراءات التي فصلناها في مقالات JoVE المرافقة.

تُجهز الخطوات القليلة التالية حمض SHE DNA للربط في ناقل SMID PCC one. تتمثل الخطوة الأولى في إصلاح نهايات قطع SHE DNA وفسفرتها. تتوفر جميع الكواشف اللازمة لهذه الخطوة، بما في ذلك النهايات الخماسية (5')، في مجموعة إنتاج مكتبة PCC one SMID من شركة epicenter. لإعداد تفاعل إصلاح النهايات، قم بإذابة جميع الكواشف على الثلج، ثم اخلط منظم إصلاح النهايات وDNTP، ومزيج TP، وما يصل إلى 20 micrograms من SHE insert DNA بتركيز 0.5 micrograms لكل microliter، ومزيج الإنزيم والماء للوصول إلى حجم 80 microliters. قم بطرد مركزي قصير للأنبوب لضمان تجمع كل السائل في القاع.

قم بتحضين تفاعل إصلاح النهايات في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 45 دقيقة إلى ساعة واحدة. بعد ذلك، قم بالتسخين لتعطيل الإنزيمات حرارياً عند 70 °C لمدة 10 دقائق. وأثناء فترة تحضين إصلاح النهايات، يمكنك تحضير الهلام (الجل) للخطوة التالية.

في الرحلان الكهربائي بهلام المجال النبضي أو PFGE، يكمن هدفك في عزل جزيئات DNA تتراوح أحجامها من 30 إلى 60 Kilobases. يُعد PFGE طريقة رحلان كهربائي لفصل هذه الشظايا الكبيرة التي تندمج معاً أثناء الرحلان الكهربائي القياسي. للبدء، قم بتحضير هلام بتركيز 1% باستخدام low melting agarose في 150 milliliters من محلول running buffer من نوع one XTAE.

اختر الأمشاط التي تسمح لك بتحميل كامل العينة البالغ حجمها 80 µL من الـ DNA الذي تم إصلاح نهاياته بالإضافة إلى منظم التحميل في بئر واحد أو بئرين. كن حذرًا للغاية عند التعامل مع الهلام، حيث أن هلامات الأجاروز منخفضة درجة الانصهار تنكسر بسهولة شديدة أثناء تجمده.

قم بتجهيز غرفة الرحلان الكهربائي. أضف 2.2 liters من محلول one XTAE إلى الغرفة، وقم بتشغيل الجهاز لتدوير محلول التشغيل المنظم. اضبط جهاز التبريد على 14 °C واضبط المضخة على 70 RPM.

أضف أيضاً علامة PFG ذات نطاق متوسط من شركة NEB. ولتجنب قطع الهلام من مستوى مرتفع جداً، قم بدفع مادة aros من حقنة الهلام واقطع سدادة صغيرة من الطرف باستخدام المشرط. ضع السدادة عند مقدمة البئر ثم أحكم إغلاقها باستخدام مادة aros المصهورة.

تأكد من أن منظم التشغيل (running buffer) قد برد ليصل إلى 14 °C قبل تحميل الهلام. في البئر الأولى، قم بتحميل 5 µL من ناتج هضم Lambda Hindi III من شركة New England Biolabs. وفي البئر الثانية، قم بتحميل 1 µL من مؤشر الحجم الضابط Smid المخفف في 10 µL من الماء المعقم بالإضافة إلى منظم التحميل (loading buffer).

بعد ذلك، قم بتحميل المزيج الذي تمت معالجة أطرافه وتعطيله حرارياً مع إضافة منظم التحميل. أغلق الغطاء ثم قم ببرمجة الجهاز. سيستمر تشغيل الهلام طوال الليل أو لمدة 12 ساعة.

عندما ينتهي تشغيل الهلام، استخدم صبغة cyber gold لتصور الـ DNA؛ قم بتخفيف الـ cyber gold في 250 milliliters من 1XTAE، ثم ضع الهلام في المحلول واتركه يُصبغ لمدة ساعة واحدة في الظلام لأن الـ cyber gold حساس للضوء. وأثناء صبغ الهلام، قم بتجهيز حمام مائي عند 70 °C وآخر عند 45 °C لخطوة استخلاص الهلام التي تلي ذلك.

الخطوة التالية هي الاستئصال من الهلام. قم بتنقية الـ DNA ضمن نطاق الحجم المطلوب والذي يتراوح من 30 إلى 60 kilobases. خذ الهلام المصبوغ مع أنبوب دقيق فارغ ومميز ومشرط معقماً إلى جهاز التصوير الضوئي (transluminator) ذو الضوء الأزرق.

قم بتغطية جهاز التصوير فوق البنفسجي (transluminator) بغلاف بلاستيكي لتجنب التلوث الخلطي للهلام (gel). ارتدِ نظارات الحماية وقم بتشغيل الضوء الأزرق. يمكنك الآن رؤية الحمض النووي الجينومي المصلح عند النهايات وعلامة حجم التحكم FO smid. باستخدام المشرط، استأصل شريحة من الهلام بعرض 5 إلى 7 mm تكون قد هاجرت بمحاذاة وعلو بسيط من علامة حجم التحكم smid.

استخدم علامة PFG كحد علوي للشريحة. انقل الشريحة إلى أنبوب التدوير. يمكنك تخزين الشرائح عند درجة حرارة 20- °C لمدة تصل إلى عام واحد قبل المتابعة.

حان الوقت الآن لإجراء الفصل الكهربائي للهلام. قم بتنقية الـ DNA من الشريحة التي استخلصتها. زن الأنبوب الذي يحتوي على شريحة الهلام واحسب وزن الشريحة عن طريق طرح وزن الأنبوب فارغاً.

بعد ذلك، قم بإذابة الشريحة في حمام مائي درجة حرارته 70 °C لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. وبمجرد ذوبان شريحة الهلام تماماً، انقل الأنبوب بسرعة إلى حمام مائي درجة حرارته 45 °C. مع مراعاة أن 1 mg من الهلام الصلب يكون حجمه 1 µL بعد الإذابة.

أضف وحدة واحدة أو 1 µL من مستحضر إنزيم Jase لكل 100 µL من الـ aros المذاب. يتم التحضين عند 45 °C لمدة ساعة واحدة. ثم أضف من 2 إلى 4 µL إضافية من les والحضن عند 45 °C لمدة ساعة أخرى من التسخين.

قم بإيقاف نشاط الجل عند 70 درجة Celsius لمدة 10 دقائق بعد التسخين. ولإيقاف نشاط الإنزيم، ضع الأنبوب على الثلج لمدة 10 دقائق، ثم قم بالطرد المركزي بأقصى سرعة، 13,000 RPM لمدة 15 دقيقة لترسيب أي جسيمات غير قابلة للذوبان.

مع الحرص على عدم تحريك الراسب. قم بإزالة الطافي العلوي الذي يحتوي على الـ DNA المُنقى وانقله إلى أنبوب فالكون سعة 15 milliliter. بعد ذلك، قم بتخفيفه باستخدام ثلاثة milliliters من الماء المعقم لغسل الـ DNA وتركيزه.

انقل المحلول من أنبوب Falcon سعة 15 milliliter إلى وحدة ترشيح طرد مركزي Ancon Ultra four مزودة بغشاء ultra cell 10. ضع وحدة الترشيح في دوار ذو دلاء متأرجحة باستخدام أنبوب falcon سعة 50 milliliter كمحول، ثم قم بالتدوير بسرعة 4,000 GS لمدة ست إلى ثماني دقائق. استمر في عملية الطرد المركزي حتى يتبقى ما يقرب من 100 إلى 500 microliters من المحلول.

اترك الراسب على المرشح وتخلص من السائل الرشاح. ثم أضف ثلاثة ملليلترات أخرى من الماء المعقم إلى أنبوب فالكون الفارغ. انقل المحلول إلى أنبوب Amon وكرر خطوة الطرد المركزي.

اغسل أنبوب فالكون للمرة الثالثة، ثم قلل الحجم النهائي المجموع على المرشح إلى 50 إلى 100 µL. لا داعي للقلق بشأن فقدان العينة، إذ سيحتفظ المرشح بـ 50 µL من السائل حتى بعد عملية الطرد المركزي الممتدة.

انقل محلول الـ DNA المتبقي من أنبوب AmCon إلى وحدة ترشيح طرد مركزي MicroCon YM 50 مغسولة مسبقاً، واشطف أنبوب AmCon بـ 50 microliters إضافية من الماء المعقم لاستعادة جميع كميات الـ DNA. ضع وحدة ترشيح MicroCon YM 50 في جهاز طرد مركزي دقيق عند 10, 000 GS حتى يظل المرشح مغطى قليلاً بالسائل. تحقق من ذلك كل دقيقة.

إذا تبقت كمية صغيرة فقط من السائل على المرشح، اقلب المرشح رأساً على عقب واستعد محلول DNA الخاص بك من خلال خطوة طرد مركزي ثانية عند 1000 GS لمدة ثلاث دقائق في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. يجب ألا يتجاوز الحجم الناتج 10 إلى 15 microliters في المجمل.

وبخلاف ذلك، قد يكون الحمض النووي DNA مخففاً للغاية بحيث لا يصلح لعملية الربط. تحقق من تركيز محلول DNA الناتج باستخدام NanoDrop أو مقايسة Pico Green. تم استرجاعه وإصلاحه.

أصبح الـ DNA الآن جاهزاً للربط بمتجه الاستنساخ PCC one FO SMID؛ ولإجراء عملية الربط، يتم إذابة جميع الكواشف على الثلج. ثم تُجمع بالترتيب المذكور هنا، مع الخلط بعد كل إضافة. أولاً، يتم إضافة الماء المعقم للوصول إلى حجم تفاعل قدره 10 µL.

ثم أضف منظم الربط السريع بتركيز 10x، وATP بتركيز 10 millimolar، وناقل pSMID والقطعة المدرجة بنسبة مولية 10 إلى 1. وأخيراً، أضف إنزيم FastLink DNA Ligase. قم بطرد مركزي وجيز للأنبوب لتركيز كل السائل في القاع.

انقر على الأنبوب ثم قم بتدويره مرة أخرى. حضن تفاعل الربط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، ثم قم بتعطيل الإنزيم حرارياً لمدة 10 دقائق عند 70 °C. في هذه المرحلة، يمكنك إما تخزين تفاعل الربط عند -20 °C أو الانتقال إلى خطوة تعبئة العاثيات.

تتمثل الخطوة التالية في إنتاج عاثيات بكتيرية تعمل على إدخال مكتبة FO SMID الخاصة بك إلى بكتيريا e coli. قبل يومين أو ثلاثة أيام من الموعد المقرر لخطوة تعبئة العاثيات، قم بتخطيط سلالة التغطية المقاومة EPI 300 T1 الموفرة على طبق LB عادي، ثم حضنها طوال الليل عند 37 °C للحصول على مستعمرات منفردة. يمكنك إغلاق هذا الطبق بإحكام وتخزينه عند 4 °C للاستخدام المستقبلي. وفي اليوم السابق لتفاعلات التعبئة، قم بتلقيح 50 mL من مرق LB مضافاً إليه 10 mM من كبريتات المغنيسيوم باستخدام مستعمرة واحدة من طبق Epi 300، ثم رجّ المزيج عند 225 RPM و37 °C طوال الليل.

في يوم تفاعلات التغليف، قم بتلقيح 50 milliliter من مرق LB الطازج المضاف إليه 10 millimolar من كبريتات المغنيسيوم باستخدام خمسة milliliters من المزرعة التي نمت طوال الليل. قم باستزراع البكتيريا عند 37 degrees Celsius حتى تصل قيمة OD 600 إلى 0.8 إلى 1.0. يجب ألا تتجاوز قيمة OD 600 مقدار 1.0.

قم بتخفيف عينتك قبل قياسها باستخدام جهاز spectrophotometer لضمان الحصول على نتيجة دقيقة. تُحفظ العينة على الثلج أو عند درجة حرارة 4 °C حتى يحين وقت المتابعة أو لمدة تصل إلى 72 ساعة. والآن، بعد أن أصبحت البكتيريا جاهزة للعدوى، حان الوقت لتحضير إذابة العاثيات (phage thaw).

يتم استخراج max plaques Lambda Packaging على الثلج. وباستخدام أنبوب واحد لكل تفاعل ربط، ستستغرق عملية الإذابة حوالي 10 إلى 15 دقيقة. وفي هذه الأثناء، قم بتبريد أنبوب فارغ سعة 1.5 milliliter مسبقاً على الثلج مرة أخرى، باستخدام أنبوب واحد لكل تفاعل.

بمجرد ذوبان مستخلصات تغليف Lambda، انقل فوراً 25 µL من كل مستخلص تغليف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL مبرد مسبقاً وضعه على الثلج. أعد ما تبقى من مستخلص التغليف إلى درجة حرارة -80 °C. إن ترك مستخلصات التغليف المذابة على الثلج لفترة طويلة سيقلل من كفاءة العدوى.

بعد ذلك، أضف 10 µL من تفاعل الربط إلى كل 25 µL من المستخلصات المذابة على الثلج، مع خلط المحلول عن طريق السحب والضخ بالماصة عدة مرات دون إدخال فقاعات هوائية. قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لتجميع كل السائل في قاع الأنابيب، ثم حضّن تفاعلات التعبئة في حمام مائي بدرجة حرارة 30 °C لمدة 90 دقيقة. وبعد 80 دقيقة من التحضين، قم بإذابة مستخلص التعبئة المتبقي على الثلج.

بعد اكتمال تفاعل التعبئة الذي استغرق 90 دقيقة، أضف الـ 25 µL المتبقية من مستخلص التعبئة إلى كل أنبوب تفاعل. حضّن التفاعلات لمدة 90 دقيقة إضافية عند 30 °C. وبعد فترة التحضين الثانية، أضف 100 µL من محلول تخفيف العاثيات المُحضّر في كل أنبوب تعبئة وامزجه بلطف، ثم أضف خمسة µL من الكلوروفورم إلى كل أنبوب.

يجب أن يكون لديك الآن حجم إجمالي قدره 165 µL في الأنبوب. قد يتكون راسب لزج بعد إضافة الكلوروفورم. تجنب هذا الراسب بالإضافة إلى طور الكلوروفورم العضوي عند سحب جزيئات الفاج باستخدام الماصة.

في هذه المرحلة، يمكنك تخزين جزيئات العاثية المُغلفة عند درجة حرارة 4 °C لعدة أيام إذا لزم الأمر، ولكن يُفضل استخدام العاثية المُحضرة حديثاً للحصول على أفضل النتائج. أنت الآن مستعد لإصابة الخلايا المضيفة، التي كنت تقوم بتنميتها طوال خطوات تغليف العاثية، باستخدام العاثية المُغلفة. أضف العاثية المُغلفة إلى خلايا المضيف EPI 300 T one resistant ذات الكثافة الضوئية OD 600.8 إلى 1.0 بنسبة 400 µL من خلايا epi 300 T one resistant لكل 10 µL من جزيئات العاثية.

لتجنب سحب أي كمية من الكلوروفورم من قاع أنبوب العاثيات المعبأة، نستخدم 125 µL من جزيئات العاثيات المعبأة وخمسة mL من خلايا المضيف المقاومة epi 300 T one المُحضرة، حيث يتم خلطهما بلطف ثم التحضين عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. الخطوة التالية هي تحديد عيار العاثيات المعبأة، ويتم ذلك عن طريق زراعة البكتيريا المصابة على وسط غذائي لانتخاب الخلايا المصابة.

بعد ذلك، يتم عد المستعمرات الناتجة والقسمة على حجم العاثية (phage) الذي تمت إضافته إلى البكتيريا التي تم نشرها في الطبق. يحتوي C one SMID على جين مقاومة للكلورامفينيكول. لذا، لاختيار المستنسخات المصابة، يتم نشر البكتيريا في أطباق LB تحتوي على الكلورامفينيكول.

قم بتوزيع كميتين بحجم 50 µL وكميتين بحجم 10 µL من خلايا EPI 300 T one المقاومة والمصابة بالعاثيات على أربعة أطباق منفصلة، ثم ضع الأطباق مقلوبة في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة، وبحد أقصى 48 ساعة حتى تتشكل المستعمرات. وفي هذه الأثناء، قم بحصد خلايا EPI 300 T one المقاومة المتبقية من عملية العدوى بحجم 5 mL عن طريق الطرد المركزي عند 3,500 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. تخلص من السائل الطافي.

أضف 1 mL من وسط LB مع 20% glycerol إلى أنبوب إعادة التعليق. قم بتعليق كتل الخلايا وتوزيعها بمقدار 100 µL لكل منها في أنابيب حفظ تجميد سعة 2 mL، ثم جمدها فوراً وخزنها عند -80 °C. وللاستخدام اللاحق في خطوة اختيار المستعمرات في اليوم التالي، قم بعدد المستعمرات على الأطباق الأربعة في الحاضنة عند 37 °C وتحديد عيار الفاج المعبأ، والذي ستستخدمه في الخطوة التالية.

يحتوي المخزون الغليسيرولي المجمد من سلالة EPI 300 T one المقاومة على خلايا تم نقل جميع البلازميدات المختلفة في مكتبتك إليها. بعد ذلك، قم بنشر كمية مناسبة بناءً على العيار الفيروسي وحجم الطبق لكل عينة. قم بإجراء الاستنساخ على مربع بمقاس 2 45 في 2 45 ملم.

أطباق المقايسة الحيوية من وسط LB مع الكلورامفينيكول باستخدام خرزات زجاجية. أضف أيضاً كمية صغيرة من مرق LB إلى الطبق لنشر الخلايا بشكل متساوٍ. ضع في اعتبارك أن تحضير مخزون الجلسرين يزيد من تركيز خلاياك بمقدار خمسة أضعاف تقريباً.

يتم التحضين عند 37 درجة Celsius لمدة 24 ساعة في أيام التقاط المستعمرات، ثم يتم تحضير أطباق ذات 96 أو 384 بئراً مملوءة بـ 200 microliters أو 70 microliters لكل بئر من مرق LB. يتم تدعيم المرق بـ 12.5 micrograms من chloramphenicol لكل milliliter من المرق من أجل الانتقاء بالمضادات الحيوية، وبـ 10% glycerol من أجل التجميد. نستخدم نظام qfi three الآلي لملء الأطباق في هذه الخطوة.

تتمثل الخطوة التالية في التقاط المستعمرات من أطباق LB CHLORAMPHENICOL المُحضرة ونقلها إلى أطباق 96 أو 384 بئراً المُحضرة للتجميد. وفي هذه الخطوة، نستخدم روبوت التقاط المستعمرات qix two، وفقاً لدليل المستخدم، لإنشاء بيئة معقمة حول منطقة التقاط المستعمرات. قم بتشغيل الضوء فوق البنفسجي (UV) لمدة 30 دقيقة أثناء عمل الضوء فوق البنفسجي.

قم بتحضير 500 milliliters من 1%bleach، و500 milliliters من الماء منزوع الأيونات المعقم، و500 milliliters من 80%ethanol. عند انطفاء ضوء UV، املأ الأحواض حسب الملصقات من الخلف إلى الأمام. املأ الحوض الأول بـ 1%bleach، ثم الماء منزوع الأيونات المعقم بجهاز autoclave، و80%ethanol في الحوض الأمامي.

تأكد من أنها ممتلئة، حيث لا يمكن غسل إبر الالتقاط بشكل صحيح دون وجود محلول غسيل كافٍ. بعد ضبط المعلمات لتحقيق الالتقاط الأمثل، قم بإزالة الأغطية عن أطباق البكتيريا وأطباق الـ 96 أو 384 بئراً المملوءة بوسط LB، وضعها بين القوائم في جهاز Q picks. يجب أن تكون الأطباق في منطقة العمل محكمة الإغلاق مقابل الزاوية الأمامية اليمنى لضمان عدم تحركها أثناء عملية الالتقاط.

أغلق بعد ذلك اللوحة الأمامية. وبمجرد ضبط جميع المعلمات، يمكن بدء إجراء الالتقاط. وعند اكتمال جميع عمليات الالتقاط، اشطف الفرش والصواني بالماء منزوع الأيونات وضعها على المنضدة لتجف.

نظّف أي انسكابات قد تكون حدثت وامسح الجزء الداخلي من نظام CICS باستخدام ethanol بتركيز 80%. تأكد من وضع ملصقات تعريفية على جميع أطباق مخزون الجلسرين، ثم ضعها في الحاضنة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة 24 ساعة لتنمية مستنبت من كل مستعمرة تم اختيارها. اترك ملاحظة على الحاضنة تتضمن التاريخ، وعدد الأطباق التي تم تحضينها، ووقت التحضين، ووقت الإخراج، والأحرف الأولى من اسمك.

بعد فترة الحضن، ستحصل على مكتبتك. تحتوي كل بئر على مزرعة من مستنسخ بكتيري واحد يحتوي على PCC one fo smid مرتبط بقطعة واحدة من DNA المقطوع من عينتك الأصلية. جمد الأطباق عند درجة حرارة -80 °C للتخزين طويل الأمد وهنئ نفسك على إتمام العمل بنجاح.

يصف البروتوكول المقدم إجراءات كيفية إنشاء مكتبة smid بيئية لالتقاط المحتوى الجيني لمجتمع ميكروبي في موطن معين. ومن المفترض أن يؤدي هذا البروتوكول إلى إنشاء مكتبة SMID ممثلة للمحتوى الجيني للبيئة التي تم أخذ العينات منها، كما ينبغي أن يمكن القارئ من تحسين الخطوات الحرجة في حال كانت كمية مستنسخات FO smid التي تم الحصول عليها في نهاية الإجراء بأكمله منخفضة للغاية.

لقد قدمنا لكم للتو كيفية بناء مكتبة FO SMID من الحمض النووي الجينومي المستخلص من عينة مياه بحرية. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم البدء بحمض نووي جينومي عالي الجودة. تأكد من تجهيز جميع الأطباق والكواشف قبل البدء، وخصص وقتاً كافياً لهذه العملية متعددة الخطوات.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.