مكتبة كبيرة إدراج الجينوم البيئية الإنتاج

مرحبا ، أنا ماركوس من مختبر ستيفن هيلم في قسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة في جامعة كولومبيا البريطانية. سنعرض لك اليوم إجراء لبناء مكتبة بيئية كبيرة المدمجة. يساعدني في إجراء اليوم سان لي ، الذي سيقوم بتعبئة العاثيات وعدوى مضيف المكتبة e coli ، بالإضافة إلى إليز هاولي وتشين يانغ اللذين سيؤديان قطف المستعمرة.

لدينا هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة بنية المجتمع الميكروبيولوجي والتمثيل الغذائي في البيئات البحرية والبرية. لذلك دعونا نبدأ. يبدأ هذا البروتوكول لإنشاء مكتبة الحمض النووي fo smid بعد عزل وقص الحمض النووي الجيني من إجراءات عينات الكتلة الحيوية التي قمنا بتفصيلها في Jo المصاحبة للمقالات.

تقوم الخطوات القليلة التالية بإعداد الحمض النووي SHE للربط في ناقل SMID PCC واحد. تتمثل الخطوة الأولى في إصلاح نهايات قطع SHE من الحمض النووي والفوسفوريت. يتم تضمين النهايات الأولية الخمسة ، وجميع الكواشف اللازمة لهذه الخطوة في مجموعة إنتاج مكتبة PCC واحدة SMID من مركز الزلزال لإعداد تفاعل الإصلاح النهائي ، وإذابة جميع الكواشف على الجليد ، ثم الجمع بين المخزن المؤقت للإصلاح النهائي DNTP ، وخلط TP حتى 20 ميكروغراما من إدخال الحمض النووي عند 0.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر من مزيج الإنزيم والماء للوصول إلى 80 ميكرولتر لفترة وجيزة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب للحصول على كل السائل إلى قاع.

احتضان تفاعل الإصلاح النهائي في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة إلى ساعة. ثم يسخن ، يقوم بتعطيل الإنزيمات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أثناء حضانة الإصلاح النهائي ، يمكنك تحضير الجل للخطوة التالية.

الرحلان الكهربائي للهلام النبضي أو PFGE ، هدفك هو عزل جزيئات الحمض النووي التي تتراوح من 30 إلى 60. Kilobases PFGE هي طريقة كهربائية لحل هذه الأجزاء الكبيرة التي تعمل معا أثناء الرحلان الكهربائي القياسي. للبدء ، قم بإعداد هلام بنسبة 1٪ باستخدام قشور منخفضة الذوبان في 150 مل من مخزن مؤقت واحد يعمل XTAE.

اختر أمشاط تسمح لك بتحميل عينة 80 ميكرولتر بالكامل من الحمض النووي للإصلاح النهائي بالإضافة إلى عازلة التحميل في بئر واحد أو بئرين. كن حذرا بشكل خاص في التعامل مع الجل كمواد هلامية منخفضة الذوبان. كسر بسهولة شديدة أثناء تصلب الجل.

تحضير غرفة الرحلان الكهربائي. أضف 2.2 لتر من XTAE واحد إلى الغرفة وقم بتشغيل الجهاز لتدوير المخزن المؤقت قيد التشغيل. اضبط جهاز التبريد على 14 درجة مئوية واضبط المضخة على 70 دورة في الدقيقة.

قم بتضمين علامة PFG متوسطة المدى أيضا من NEB. لتجنب قطع الجل الخاص بك بشكل كبير جدا ، يخرج البثق من حقنة الجل وقم بتقطيع سدادة صغيرة من النهاية باستخدام المشرط. ضع القابس في مقدمة البئر وأغلقه بالصخور المنصهرة.

تأكد من أن المخزن المؤقت للتشغيل قد برد إلى 14 درجة مئوية قبل تحميل الجل الخاص بك. في أول بئر تحميل خمسة ميكرولترات من نيو إنجلاند Biolabs لامدا الهندية ثلاثة هضم. في البئر الثاني ، قم بتحميل ميكرولتر واحد من علامة حجم التحكم Smid المخففة في 10 ميكرولتر من الماء المعقم بالإضافة إلى عازلة التحميل.

ثم قم بتحميل المزيج المعطل للطرف الذي تم إصلاحه وتسخينه بالإضافة إلى مخزن التحميل. أغلق الغطاء وقم ببرمجة الجهاز. سيعمل الجل طوال الليل أو 12 ساعة.

عند الانتهاء من تشغيل الجل ، استخدم بقعة ذهبية إلكترونية لتصور الحمض النووي يخفف الذهب السيبراني. في 250 مل من XTAE واحد ، ضع الجل في المحلول وصمة عار لمدة ساعة واحدة في الظلام ، يكون cyberg gold حساسا للضوء أثناء تلطيخ الجل. قم بإعداد حمام مائي عند 70 درجة مئوية وواحد فهرنهايت 45 درجة مئوية لخطوة استخراج الجل التالية.

الخطوة التالية هي المكوس والهلام. قم بتنقية الحمض النووي ضمن نطاق الحجم المطلوب من 30 إلى 60 كيلو قاعدة. خذ الجل الملون مع أنبوب حيلة دقيقة فارغ وممزق ومصنف ومشرط معقم إلى جهاز المصباح الأزرق.

قم بتبطين جهاز المصباح بغلاف بلاستيكي لتجنب تلويث الهلام. فجر نظارات المشاهدة وقم بتشغيل الضوء الأزرق. يمكنك الآن رؤية الحمض النووي الجيني الذي تم إصلاحه وعلامة حجم التحكم FO smid باستخدام المشرط ، قم باستئصال شريحة هلامية بعرض خمسة إلى سبعة ملليمترات هاجرت مع علامة حجم التحكم في smid وفوقها قليلا.

استخدم علامة PFG كحد علوي للشريحة. انقل الشريحة إلى الأنبوب الممزق. يمكنك تخزين الشرائح عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى عام واحد قبل المتابعة.

حان الوقت الآن للهلام. قم بتنقية الحمض النووي من شريحتك. قم بوزن الأنبوب الذي يحتوي على شريحة الجل واحسب وزن الشريحة عن طريق طرح وزن المسيل للدموع.

بعد ذلك ، قم بإذابة الشريحة في حمام مائي 70 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. بعد ذوبان شريحة الجل تماما ، انقل الأنبوب بسرعة إلى حمام مائي 45 درجة مئوية. مع الأخذ في الاعتبار أن ملليغرام واحد من الجل الصلب يحتوي على حجم ميكرولتر واحد بعد الذوبان.

أضف وحدة واحدة أو ميكرولتر واحد من مستحضر إنزيم Jase لكل 100 ميكرولتر من الأروس المذاب. احتضان عند 45 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم أضف اثنين إلى أربعة ميكرولتر لتر إضافي واحتضن عند 45 درجة مئوية لمدة ساعة أخرى من الحرارة.

قم بتعطيل الجل عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد التسخين. تعطيل الإنزيم ، وضع الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق من جهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة. 13 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة لتكبيل أي جزيئات غير قابلة للذوبان.

الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. قم بإزالة المادة الطافية العلوية التي تحتوي على الحمض النووي المنقى وانقله إلى أنبوب صقر سعة 15 مل. ثم قم بتسخينه بثلاثة ملليلتر من الماء المعقم بجانب غسل الحمض النووي وتركيزه.

انقل المحلول من أنبوب فالكون سعة 15 مليلتر إلى وحدة مرشح الطرد المركزي Ancon Ultra ذات الأربعة مع غشاء فائق الخلية 10. ضع وحدة المرشح في دوار دلو متأرجح باستخدام أنبوب صقر سعة 50 مليلتر كمحول وقم بالدوران عند 4,000 GS لمدة ست إلى ثماني دقائق. جهاز طرد مركزي حتى حوالي 100 إلى 500 ميكرولتر من المحلول.

ابق على الفلتر وتخلص من التدفق من خلاله. ثم أضف ثلاثة ملليلتر أخرى من الماء المعقم إلى أنبوب الصقر الفارغ. انقل المحلول إلى أنبوب آمون وكرر خطوة الطرد المركزي.

اغسل أنبوب الصقر للمرة الثالثة وقلل الحجم النهائي الذي تم جمعه على الفلتر إلى 50 إلى 100 ميكرولتر. لا داعي للقلق بشأن فقدان العينة. سيحتفظ الفلتر ب 50 ميكرولترا من السائل حتى بعد الطرد المركزي الممتد.

انقل محلول الحمض النووي المتبقي من أنبوب AmCon إلى وحدة مرشح الطرد المركزي MicroCon YM 50 المغسولة مسبقا واشطف أنبوب Amon ب 50 ميكرولترا إضافيا من الماء المعقم لاستعادة جميع أجهزة الطرد المركزي للحمض النووي. وحدة مرشح الطرد المركزي MicroCon YM 50 في جهاز طرد مركزي صغير عند 10 ، 000 GS حتى لا يزال المرشح مغطى قليلا بالسائل. تحقق كل دقيقة.

إذا تركت كمية صغيرة فقط من السائل على الفلتر. اقلب الفلتر رأسا على عقب واسترجع محلول الحمض النووي الخاص بك بخطوة طرد مركزي ثانية عند 1000 GS لمدة ثلاث دقائق في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. يجب ألا يتجاوز الحجم الناتج من 10 إلى 15 ميكرولتر في المجموع.

خلاف ذلك ، قد يكون الحمض النووي الخاص بك مخففا جدا للربط. تحقق من تركيز محلول الحمض النووي الناتج عن طريق NanoDrop أو Pico Green Assay. تم استردادها وإصلاحها.

الحمض النووي جاهز الآن للربط بناقل استنساخ FO SMID واحد من أجل إذابة جميع الكواشف على الجليد من خلال ربط الربط. ثم يتم دمجها بالترتيب المذكور هنا ، وخلطها بعد كل إضافة. أولا ، أضف الماء المعقم للوصول إلى حجم تفاعل 10 ميكرولتر.

ثم 10 × مخزن مؤقت ربط سريع الارتباط ، 10 مللي مولار A-T-P-P-C-C ناقل SMID واحد وإدخاله بنسبة 10 إلى مولية واحدة. وأخيرا ارتباط سريع DNA Ligase. قم بالطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة للحصول على كل السائل إلى الأسفل.

اضغط على الأنبوب وقم بالتدوير مرة أخرى. احتضان تفاعل الربط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين وقم بتعطيل الإنزيم لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية. في هذه المرحلة ، يمكنك إما تخزين تفاعل الربط عند 20 درجة مئوية تحت الصفر أو المتابعة إلى خطوة تغليف العاثية.

تتمثل الخطوة التالية في توليد العاثيات البكتيرية التي ستعمل على إدخال مكتبة FO SMID الخاصة بك في الإشريكية القولونية قبل يومين أو ثلاثة أيام من التخطيط للقيام بخطوة تغليف العاثيات ، وإخراج سلالة الطلاء المقاومة المتوفرة EPI 300 T على لوحة LB عادية واحتضانها طوال الليل عند 37 إلى درجة مئوية للحصول على مستعمرات مفردة. يمكنك إغلاق هذه اللوحة وتخزينها عند أربع درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل. في اليوم السابق لتفاعلات العبوة ، قم بتلقيح 50 مل من مرق ألبي بالإضافة إلى 10 مللي مولار من كبريتات المغنيسيوم مع مستعمرة واحدة من لوحة Epi 300 ، رج عند 225 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

في يوم تفاعلات التعبئة ، قم بتلقيح مرق رطل طازج سعة 50 مليلترا بالإضافة إلى 10 مللي مولار من كبريتات المغنيسيوم مع خمسة ملليلتر من الثقافة الليلية. ثقافة ، البكتيريا عند 37 درجة مئوية إلى OD 600 من 0.8 إلى 1.0. لا تتجاوز OD 600 من 1.0.

بتخفيف عينتك قبل القياس على مقياس الطيف الضوئي حتى تحصل على نتيجة دقيقة. يحفظ على الثلج أو على درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزا للمتابعة أو حتى 72 ساعة. الآن بعد أن أصبحت البكتيريا جاهزة للعدوى ، حان الوقت لتحضير ذوبان العاثية.

اللوحات القصوى مستخلصات تغليف لامدا على الجليد. باستخدام أنبوب واحد لكل تفاعل ربط ، سيستغرق الذوبان حوالي 10 إلى 15 دقيقة. في هذه الأثناء ، قم بتبريد أنبوب فارغ سعة 1.5 ملليلتر على الجليد مرة أخرى باستخدام أنبوب واحد لكل تفاعل.

بمجرد ذوبان مستخلصات عبوات Lambda ، انقلها على الفور إلى 25 ميكرولترا من كل مستخلص عبوة إلى أنبوب fuge الدقيق المبرد مسبقا سعة 1.5 مل وضعها على الثلج. أعد مستخلص العبوة المتبقي إلى 80 درجة مئوية تحت الصفر. سيؤدي ترك مستخلصات العبوات المذابة على الجليد لفترة طويلة إلى تقليل كفاءة العدوى.

بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من تفاعل الربط إلى كل 25 ميكرولترا من المستخلصات المذابة على الجليد الممزوجة عن طريق سحب المحلول عدة مرات دون إدخال فقاعات الهواء. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لتوحيد كل السائل في الجزء السفلي من الأنابيب واحتضان تفاعلات التعبئة في حمام مائي 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد 80 دقيقة من الحضانة ، قم بإذابة مستخلص العبوة المتبقي على الثلج.

بعد اكتمال تفاعل العبوة لمدة 90 دقيقة ، أضف 25 ميكرولترا المتبقية من مستخلص العبوة إلى كل أنبوب تفاعل. احتضان التفاعلات لمدة 90 دقيقة إضافية عند 30 درجة مئوية. بعد الحضانة الثانية ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتخفيف العاثية المحضر في كل أنبوب تغليف واخلطه برفق وأضف خمسة ميكرولترات من الكلوروفورم إلى كل أنبوب.

الآن يجب أن يكون لديك حجم إجمالي يبلغ 165 ميكرولتر في الأنبوب. قد يتشكل راسب لزج بعد إصدار الكلوروفورم. تجنب هذا الراسب وكذلك مرحلة الكلوروفورم العضوي عند سحب جزيئات العاثيات.

في هذه المرحلة ، يمكنك تخزين جزيئات العاثيات المعبأة عند أربع درجات لعدة أيام إذا لزم الأمر ، ولكن استخدم العاثية المعدة حديثا للحصول على أفضل النتائج. أنت الآن جاهز لإصابة الخلايا المضيفة ، التي نشأت خلال خطوات التعبئة والتغليف مع العاثية المعبأة. أضف العاثية المعبأة إلى EPI 300 T خلية مضيفة مقاومة واحدة OD 600.8 إلى 1.0 بنسبة 400 ميكرولتر من epi 300 T خلايا مقاومة واحدة لكل 10 ميكرولتر من جزيئات العاثية.

لتجنب سحب أي كلوروفورم من قاع أنبوب العاثية المعبأة ، نستخدم 125 ميكرولترا من جزيئات العاثيات المعبأة وخمسة ملليلتر من الخلايا المضيفة المقاومة epi 300 T المحضرة المحضرة بلطف ثم تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الخطوة التالية هي تحديد عيار العاثية المعبأة. يمكنك القيام بذلك عن طريق طلاء البكتيريا المصابة على وسط لتحديد الخلايا المصابة.

ثم عد المستعمرات الناتجة والقسمة على حجم العاثية المضافة إلى البكتيريا التي قمت بطلائها. يحتوي C one SMID على جين مقاومة الكلورامفينيكول. لذلك لاختيار المستنسخة المصابة ، قم بإخراج البكتيريا على ألواح الكلورامفينيكول التي تحتوي على ألواح LB.

انتشر مرتين 50 ميكرولتر ومرتين 10 ميكرولتر من الخلايا المقاومة للعاثية المصابة EPI 300 T على أربع لوحات منفصلة وضع الألواح رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة ، لا تزيد عن 48 ساعة حتى تتشكل المستعمرات. وفي الوقت نفسه ، قم بحصاد الخلايا المقاومة المتبقية EPI 300 T من عدوى خمسة ملليلتر عن طريق الطرد المركزي عند 3 ، 500 GS لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.

أضف ملليلتر واحد من LB مع 20٪ جلسرين إلى أنبوب resus. قم بتعليق حبيبات الخلية وقم بتقطيعها إلى 100 ميكرولتر لكل منهما في أنبوبين من قارورة التبريد مليلتر ، وقم بتجميد فور تخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. لمزيد من الاستخدام في خطوة قطف المستعمرة في اليوم التالي ، احسب عدد المستنسخة على الألواح الأربعة في حاضنة 37 درجة مئوية وحدد عيار العاثية المعبأة ، والتي تستخدمها في الخطوة التالية.

يحتوي مخزون الجلسرين المقاوم للإي بي آي 300 طن المجمد على خلايا منقولة مع جميع البلازميدات المختلفة في مكتبتك. بعد ذلك ، انشر كمية مناسبة بناء على العيار الفيروسي وحجم اللوحة لكل سميد. استنساخ على 2 45 × 2 45 ملم مربع.

لوحات المقايسة الحيوية من LB مع الكلورامفينيكول باستخدام الخرز الزجاجي. أضف أيضا كمية صغيرة من مرق LB إلى الطبق لنشر خلاياك بالتساوي. ضع في اعتبارك أن تحضير مخزون الجلسرين يركز خلاياك بشكل إضافي بمقدار خمسة أضعاف.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في أيام قطف المستعمرة ، وقم بإعداد 96 أو 3 84 لوحا جيدا مملوءا ب 200 ميكرولتر أو 70 ميكرولتر لكل بئر من مرق LB. مكمل ب 12.5 ميكروغرام من الكلورامفينيكول لكل مليلتر من المرق لاختيار المضادات الحيوية و 10٪ جلسرين للتجميد. نحن نستخدم نظام تعبئة الألواح الثلاث الآلي qfi لهذه الخطوة.

الخطوة التالية هي اختيار المستعمرات من ألواح LB CHLORAMPHENICOL المعدة إلى 96 أو 3 84 لوحا جيدا للتجميد. في هذه الخطوة ، نستخدم روبوت التقاط الاستنساخ qix two ، وفقا لدليل المستخدم ، لإنشاء بيئة معقمة حول منطقة التقاط الاستنساخ. قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة أثناء تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

تحضير 500 مل من 1٪ مبيض ، 500 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات و 500 مل من 80٪ الإيثانول. عندما ينطفئ ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، املأ الصواني كما هو موضح من الخلف إلى الأمام. املأ 1٪ مبيض ، ثم ماء منزوع الأيونات بالأوتوكلاف ، و 80٪ إيثانول في الدرج الأمامي.

تأكد من امتلائها حيث لا يمكن غسل إبر الانتقاء بشكل صحيح بدون محلول غسيل كاف. بعد إعداد المعلمات للانتقاء الأمثل ، قم بإزالة الأغطية عن الألواح البكتيرية الخاصة بك ومملأ LB 96 أو 3 84 لوحة بئر وضعها بين الأعمدة في اختيارات Q. يجب أن تكون ألواح منطقة العمل ضيقة مقابل الزاوية اليمنى الأمامية حتى لا تتمكن من التحرك أثناء الانتقاء.

ثم أغلق اللوحة الأمامية. بمجرد تعيين جميع المعلمات ، يمكن أن يبدأ إجراء الانتقاء. عند اكتمال الانتقاء بالكامل ، اشطف الفرش والصواني بالماء منزوع الأيونات وضعه على المقعد حتى يجف.

قم بتنظيف أي انسكابات قد تكون حدثت وامسح الجزء الداخلي من CICS بنسبة 80٪ من الإيثانول. تأكد من وضع ملصقات على جميع ألواح مخزون الجلسرين ووضعها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لزراعة ثقافة من كل مستعمرة منتقاة. اترك ملاحظة على الحاضنة تحتوي على تاريخ عدد اللوحات المحتضنة ووقت الحضانة ووقت الإزالة والأحرف الأولى من اسمك.

بعد الحضانة ، لديك مكتبتك. يحتوي كل بئر على ثقافة استنساخ بكتيري واحد يحتوي على PCC واحد fo smid مرتبط بقطعة واحدة من الحمض النووي المطلق من عينة البداية الخاصة بك. قم بتجميد الأطباق عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين طويل الأجل وتهنئة نفسك على العمل الجيد.

يصف البروتوكول المقدم إجراء كيفية إنشاء مكتبة smid بيئية لالتقاط المحتوى الجيني لمجتمع ميكروبي في موطن معين. يجب أن ينشئ هذا البروتوكول مكتبة SMID ، والتي تمثل المحتوى الجيني للبيئة التي تم أخذ عينات منها ، ويجب أن تمكن القارئ من تحسين الخطوات الحرجة. إذا كانت كمية استنساخ FO smid التي تم الحصول عليها في نهاية الإجراء بأكمله منخفضة جدا.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية إنشاء مكتبة FO SMID من الحمض النووي الجيني المشتق من عينة المياه البحرية. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تبدأ بالحمض النووي الجيني عالي الجودة. جهز جميع الألواح والكواشف قبل البدء وخطط لوقت كاف لهذه العملية متعددة الخطوات.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.