أسلوب الإنتاجية العالية للحصول على الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد واسماك الزرد في المختبر التسميد

مرحبا ، أنا بروس دريبر من جامعة كاليفورنيا ديفيس ، قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية ، وأنا سيسيليا أنين من قسم العلوم الأساسية في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان في سياتل. اليوم ، سنقوم أنا وسيسيليا بعرض بروتوكول الحفاظ على بكاء المنوية لسمك الزرد ، وهو تعديل لبروتوكول بريان هارفي الأصلي. سنوضح لك أنه من خلال العمل في فرق مكونة من شخصين ، من الممكن حفظ المنوية بالتبريد من 100 ذكر فردي في أقل من ساعتين.

في حين أن هناك مجموعة واسعة من الخصوبة عند الذوبان ، في المتوسط ، نحصل على 25٪ من الخصوبة ، وهذا من مكتبة تم حفظها بالتبريد لأكثر من سبع سنوات. لذلك دعونا نبدأ. قبل إجراء هذا الإجراء ، قم أولا بعمل محاليل تجميد المنوية.

يتم تحضير محلول Ginsburg Fish Ringer طازجا كل ثلاثة أيام ، ويتم تحضير وسط التجميد طازجا يوميا مع الميثانول وبدونه. يمكن العثور على تركيبة هذه الحلول في المعلومات التكميلية المصاحبة لهذا البروتوكول عبر الإنترنت. يمكن أن تؤثر المواد المستخدمة في هذا الإجراء على معدل التجميد والذوبان ، مما قد يؤثر بدوره على خصوبة المنوية المجمدة.

لهذا السبب ، يتم أيضا توفير قائمة بالمواد الموصى بها كمعلومات تكميلية عبر الإنترنت. من الأفضل تجميد المنوية على الثلج الجاف المطحون جيدا بدلا من كريات الثلج الجاف. إحدى الطرق البسيطة لسحق الثلج الجاف هي لفه بمنشفة وسحقه بمطرقة.

الطريقة الأكثر فاعلية هي استخدام مطحنة ثلج جافة مثل المخالب ونموذج RE اثنين لتجميد المنوية لسمك الزرد. ضع علامة أولا على 10 أنابيب شعرية ميكرولتر بقلم مختبر على مستوى 3.33 ميكرولتر أو حوالي 16.7 ملم من الأسفل لتخدير الذكور وضع اثنين إلى أربعة ذكور في دورق يحتوي على تريكا مخفف وماء السمك. يمكن العثور على الوصفة في كتاب سمك الزرد.

بمجرد التخدير ، ارفع السمكة من مخدر باستخدام ملعقة بلاستيكية وامسحها برفق على منشفة ورقية. إيلاء اهتمام خاص لرسم الجانب البطني. ينشط الماء المنوية ، لذا من الضروري أن تجف تماما حول الإيكا.

ضع السمكة على الجانب البطني لحامل الإسفنج لأعلى. إذا كانت المنطقة المحيطة بزعانف الحوض لا تزال رطبة ، فجففها برفق باستخدام منديل كيم. ضع الأنبوب الشعري المميز في محول ماصة الفم المطاطي المرفق مع الأنابيب الشعرية.

المحول عبارة عن خرطوم مطاطي يحتوي على لسان حال في أحد طرفيه وحامل شعري من جهة أخرى. بدلا من ذلك ، يمكن توصيل الأنبوب الشعري بحقنة هاميلتون سعة 50 ميكرولتر. باستخدام قطعة قصيرة من أنبوب تيجون بالقطر المناسب ، ضع الذكر تحت المنظار وكشف الفتحة البولية التناسلية عن طريق نشر زعانف الحوض بعناية.

باستخدام نهاية الأنبوب الشعري ، عبر عن المنوية عن طريق التمسيد برفق على جوانب السمكة باستخدام ملقط ناعم أو عن طريق الضغط برفق على جوانب السمكة بإصبع السبابة والإبهام ، واجمع المنوية في أنبوب شعري حيث يتم طردها باستخدام شفط لطيف. تجنب البراز الذي قد يطرد مع المنوية. الحجم المستهدف للحيوانات المنوية هو 3.3 ميكرولتر.

الحد الأدنى من المنوية المقبولة حسب جودة المنوية. المنوية الجيدة بيضاء وغير شفافة بينما تبدو المنوية المسامية مائية. بشكل عام ، الحد الأدنى من الكمية المقبولة من المنوية هو ميكرولتر واحد من المنوية الجيدة أو ثلث الهدف ، وميكرولترين من المنوية المسامية أو ثلثي الهدف.

إذا لم يصل حجم المنوية إلى الحجم المستهدف البالغ 3.3 ميكرولتر ، فمن الضروري تطبيع الحجم إلى علامة القلم باستخدام وسط التجميد بدون الميثانول. إذا وصل حجم المنوية بالفعل إلى علامة القلم الموجودة على الأنبوب الشعري أو يتجاوزها ، فانتقل إلى الخطوة التالية. أضف الآن مادة الواقي من الفراغ بالتبريد إلى المنوية.

امتصاص وسط التجميد مع الميثانول إلى العلامة البرتقالية. الحجم الإجمالي التقريبي هو الآن 20 ميكرولترا. طرد خليط المنوية والمواد الواقية من الفراغ بالتبريد إلى منطقة نظيفة من زجاج الساعة الممزوج برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل حوالي أربع مرات وتجنب إدخال الفقاعات.

بتقسيم المنوية إلى قارورتين بالتبريد عن طريق سحب 10 ميكرولترات من محلول الحنوي بالتبريد في قاع كل قارورة مصنفة. التحرك بسرعة ، قم بتغطية القوارير وإسقاط كل قارورة تبريد في أنبوب صقر منفصل سعة 15 مل. في درجة حرارة الغرفة ، قم بتغطية أنابيب الصقر وأدخلها في مسحوق الثلج الجاف الناعم.

يجب إدخال الأنابيب بعمق كاف بحيث تظهر الأغطية فقط لتتبع أنابيب الصقر. قم بترقيمها وسجل الوقت الذي يدخل فيه كل أنبوب في الجليد الجاف. اترك المنوية تتجمد في الثلج الجاف لمدة 20 دقيقة.

بعد تجميد المنوية ، انقل قارورتي التبريد إلى قارورة نيتروجين سائلة تحتوي على قارورة فاعل. للتخزين المؤقت. ضع صندوق الفريزر في حمام من النيتروجين السائل حتى لا تسخن العينات.

استخدم ملقطا معدنيا طويلا لاستعادة القوارير من قارورة الفاعل والتعامل معها بقفازات التبريد. بدلا من ذلك ، يمكن نقل قوارير التبريد مباشرة من الثلج الجاف إلى الفريزر. إذا تم الاحتفاظ بصندوق الفريزر مغمورا في النيتروجين السائل في وعاء من الستايروفوم للتخزين طويل الأجل ، فضع قوارير التبريد في فريزر النيتروجين السائل المبرد.

للحفاظ على بقاء المنوية ، من الأهمية بمكان تخزين القوارير مغمورة في قوارير النيتروجين السائل المخزنة في مرحلة البخار قد تفقد قابليتها للحياة بمرور الوقت. السرعة ضرورية أيضا في الحفاظ على بقاء المنوية. يجب ألا يزيد الوقت بين إضافة مادة الكريات البردية ووضع قوارير المنوية على الثلج الجاف عن 30 ثانية من الإخصاب في المختبر.

يعمل استخدام المنوية المحفوظة بالتبريد بشكل أفضل مع شخصين. يقوم شخص واحد بعصر البويضات من الإناث بينما يقوم الشخص الآخر بإذابة المنوية. اضبط حمام مائي على 33 درجة مئوية.

قم بإزالة قارورة التبريد من فريزر النيتروجين السائل وانقلها إلى نيتروجين سائل يحتوي على D أو قارورة حتى تصبح جاهزة للذوبان. اعصر البيض من الإناث المخدرات في طبق بتري بلاستيكي مقاس 35 ملم. تم وصف ذلك بالتفصيل في بروتوكول JoVE بعنوان Making Gyno Genetic تم نشر أسماك الزرد بالضغط المبكر ، والذي يوفر وصفا مفصلا لأسماك الزرد.

الإخصاب في المختبر ، يحتوي القابض الجيد على أكثر من 150 بيضة موحدة ومصفرة. أي حطام أبيض يدل على التدهور. إذا أمكن ، حاول الحصول على ثلاث براثن من البيض ودمجها في طبق واحد.

إذا لم يتم الحصول على ثلاثة قوابض جيدة في غضون دقيقة واحدة من القابض الأول ، فانتقل إلى الخطوة التالية. احتفظ بالطبق مغطى أثناء إذابة المنوية. في هذه الأثناء ، قم بإزالة القارورة من النيتروجين السائل وإزالة الغطاء.

اغمر القارورة بسرعة في منتصف الطريق في حمام مائي بدرجة حرارة 33 درجة لمدة ثماني إلى 10 ثوان. أضف بسرعة 70 ميكرولترا من درجة حرارة الغرفة ، ومحلول الملح المخزن مؤقتا من هانك إلى القارورة واخلطه عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل على الفور ، أضف إلى البيض في طبق بتري واخلطه برفق مع طرف الماصة. ثم قم بتنشيط المنوية والبويضات على الفور عن طريق إضافة 750 ميكرولتر من دوامة ماء السمك للخلط والتحتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد خمس دقائق ، املأ الطبق بالسمك والماء واحتضنه على حرارة 28 درجة مئوية. بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات ، قم بحساب ونقل الأجنة القابلة للحياة إلى أطباق 100 ملم بمعدل 50 جنينا لكل طبق. اعتمد أيضا على البويضات المخصبة حتى يمكن تحديد خصوبة عينة المنوية.

خصوبة المنوية هي نسبة الأجنة القابلة للحياة إلى العدد الإجمالي للبويضات التي تم استخدامها للتخصيب في المختبر. يمكن فرز البويضات في أي وقت من ساعتين إلى ست ساعات بعد الإخصاب في المختبر. عندما يتم تمييز البويضات العقيمة بسهولة عن الأجنة القابلة للحياة ، يكون البويضات العقيمة صافية وغير مقسمة.

عند النظر إليها بإضاءة متحولة على مجهر استريو ، يختلف متوسط خصوبة المنوية المحفوظة بالتبريد بشكل كبير. ومع ذلك ، يجب أن يكون من الممكن الحصول على متوسط 25٪ خصوبة مستقرة لعدة سنوات. يوضح هذا الرسم البياني متوسط النسبة المئوية لخصوبة المنوية المجمدة بين عامي 2001 و 2003 والتي تم التفكير فيها مؤخرا في عام 2008.

لقد أظهرنا للتو طريقة إنتاجية عالية للبكاء للحفاظ على صفر منوية من الأسماك. عند القيام بهذا البروتوكول ، من المهم استخدام جميع التآكل والمعدات البلاستيكية الموصى بها بالإضافة إلى استخدام الثلج الجاف المسحوق المسحوق بدلا من كريات الثلج الجاف. من الأهمية بمكان استخدام منوية وبويضات عالية الجودة حقا ، وفي حالة البويضات عند إجراء الإخصاب في المختبر ، عند تقطيع المنوية ، من المهم استخدام أكبر عدد ممكن من البويضات لتحسين عدد الأجنة الخصبة التي تحصل عليها في الطرف الآخر ، والتي قد تستغرق من ثلاث إلى أربع إناث ، يمين؟

عنصر رئيسي آخر للبروتوكول هو السرعة. يجب ألا يستغرق الأمر أكثر من دقيقة تقريبا للانتقال من شفط المنوية من الذكر إلى وضعها في الجليد الجاف. حسنا ، أعتقد أن هذا كل شيء.

حظا سعيدا في تجاربك.