جعل Gynogenetic اسماك الزرد ضعفاني بواسطة الضغط المبكر

مرحباً، أنا شارلين ووكر من مختبر تشارلز كيميل في جامعة أوريغون، معهد علوم الأعصاب. وأنا غريغوري والش، أعمل في مختبر سيسيليا مونز في قسم العلوم الأساسية في مركز فريد هتشنسون لأبحاث السرطان.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لإنتاج أسماك الزيبرا ثنائية المجموعة الكروموسومية (diploid) عن طريق طريقة الضغط المبكر. تعتمد هذه الطريقة على استخدام الضغط الهيدروستاتيكي لإزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة في بويضة ملقحة بحيوانات منوية تعرضت للأشعة فوق البنفسجية، وذلك عند تطبيقها في التوقيت الصحيح.

يمنع هذا طرد الجسم القطبي الثاني، مما يؤدي إلى تكوين جنين ثنائي الصيغة الصبغية (diplo embryo) تكون كروموسوماته المتماثلة هي ناتجان من الانقسام الاختزالي الأول. تم تطوير هذه التقنية في أوائل السبعينيات عندما كنت أعمل في مختبر جورج ريسينجر في جامعة أوريغون. ونحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا في عمليات الفرز الجيني لجيلين.

يمكن فحص الأمشاج في أسماك F1 المطفرة مباشرةً للكشف عن الطفرات المتنحية التي تسبب أنماطاً ظاهرية تطورية في النسل الأنثوي ثنائي الصيغة الصبغية الجيني. ونظراً لأن أسماك الزيبرا تظهر تداخلاً جينياً عالياً، فإننا نستخدم هذه الطريقة أيضاً لتحديد مواقع الطفرات على الكروموسومات وتقدير مدى بُعد هذه الطفرات عن السنترومير. لذا، فلنبدأ؛ في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم السابق للتجربة، استعد لجمع الحيوانات المنوية عن طريق فصل الذكور والإناث التي سيتم عصرها، ويمكن استخدام الذكور المسنة لأنها لن تساهم بأي مادة وراثية.

يجب أن تبدو الإناث كبيرة الحجم وذات بطون ممتلئة، بينما يجب أن يبدو الذكور باللون الأصفر وبحالة نشطة. احتفظ بالذكور والإناث طوال الليل في خزانات حفظ منفصلة بحيث يمكن الوصول إليهم بسهولة في الصباح. في صباح يوم التجربة، قم بتحضير محلول Hank's وأضف بيكربونات الصوديوم.

انقل العينات إلى مرفق الأسماك في دلو ثلج. يتضمن محلول Hank's trica ومؤقتاً وأنابيب لجمع الحيوانات المنوية. وأخيراً، بمجرد الوصول إلى مرفق الأسماك، قم بتخفيف trica في مياه الأسماك.

سيُستخدم هذا لتخدير الأسماك في الخطوة التالية. لبدء عملية جمع الحيوانات المنوية، قم بتجهيز أنبولة شفافة تحتوي على محلول هانك (Hank's solution) على الثلج. جهز كمية كافية من محلول هانك المبرد، بمعدل 50 µL تقريبًا لكل ذكر، ثم قم بتخدير ذكر أو ذكرين في كل مرة.

عن طريق الغمر والتقطير، يمكن إخراج الأسماك من المخدر باستخدام ملعقة بلاستيكية. يتم شطف الذكور بماء نظيف وتجفيفهم برفق باستخدام مناشف ورقية. هذه الخطوة بالغة الأهمية لأن الماء يعمل على تنشيط الحيوانات المنوية.

بمجرد أن تجف، قم بتثبيت الأسماك في حامل رغوي تحت مجهر ستيريو بتكبير منخفض مع إضاءة علوية. افصل الزعانف الحوضية باستخدام الملقط، وضع أنبوباً شعرياً دقيقاً عند فتحة المذرق لبدء جمع الحيوانات المنوية. قم بمسح جانبي السمكة بلطف ولكن بحزم باستخدام ملقط ناعم، وبينما تخرج الحيوانات المنوية اللبنية من الفتحة التناسلية وتتجمع في الأنبوب الشعري الدقيق باستخدام شفط خفيف، اسحب الحيوانات المنوية من عدة ذكور وضعها في الثلج.

تعتبر الحيوانات المنوية في محلول هانكس الملحى البارد المستمدة من خمسة إلى 10 ذكور كافية لتخصيب بويضات من 20 إلى 30 أنثى. وستظل الحيوانات المنوية المحفوظة في محلول هانكس البارد قادرة على تخصيب البويضات بكفاءة لعدة ساعات.

اجمع كمية كافية من الحيوانات المنوية لتحضير معلق عكر لتعطيل الحيوانات المنوية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. ابدأ بملء قاع طبق بتري زجاجي بالثلج، ثم ضع زجاجة ساعة فوق الثلج في الطبق.

بعد ذلك، استخدم الماصة لنقل الحيوانات المنوية من أنبوب الاختبار إلى زجاجة الساعة. تأكد من سحب أكبر كمية ممكنة من الحيوانات المنوية في الماصة دون سحب أي فقاعات هواء. من الضروري تجنب تكوين فقاعات في الحيوانات المنوية، ثم قم بتفريغ الحيوانات المنوية في طبقة رقيقة ومنتظمة على زجاجة الساعة وتخلص من الماصة.

بعد نقل الحيوانات المنوية، ضع طبق بتري في جهاز الربط التشعبي بالأشعة فوق البنفسجية (UV crosslinker). قم بتشغيل جهاز الربط التشعبي مع ضبط الطاقة لتقديم 900 JUULs. بعد عملية الربط التشعبي، استخدم ماصة نظيفة لإزالة الحيوانات المنوية من الزجاجة الساعة ونقلها إلى أنبوب فندور (fendor tube) مُسمى "UV sperm" ثم ضعها على الثلج.

لبدء عملية جمع البيض، قم أولاً بتخدير أنثيين في كل مرة. في Trica، من الضروري عدم إبقاء الأسماك في trica لفترة طويلة لأن التخدير المطول قد يؤدي إلى موت الأسماك. بعد ذلك، اشطف الأسماك بماء الأسماك وجففها برفق باستخدام مناديل ورقية.

يعد هذا الأمر بالغ الأهمية لأن زيادة المياه ستؤدي إلى انتفاخ البيض ومنع عملية الإخصاب. ضع الأنثى في طبق بتري بلاستيكي بقطر 35 مليمتر باستخدام أصابع رطبة ولكن ليست مبللة. اضغط برفق ولكن بقوة على البطن.

إذا كانت الأنثى جاهزة لوضع البيض، فسوف يخرج بسهولة؛ اجمعي البيض باستخدام ملعقة مسطحة (spatula) وأعيدي الأنثى إلى الماء. يكون البيض السليم ذا لون مائل للاصفرار وشفاف، بينما يكون البيض الذي بقي داخل الأنثى لفترة طويلة أبيض اللون ومائياً. ولضمان الحصول على بيض سليم، اجمعي البيض خلال الساعتين الأوليين بعد إضاءة الأنوار في منشأة الأسماك، وحافظي على تغطية البيض لمنع جفافه.

بعد جمع البويضات، أضف من 30 إلى 50 µL من معلق النطاف المعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) إلى البويضات وحركها بلطف باستخدام طرف الماصة. أضف على الفور حوالي 1 mL من ماء الأسماك وابدأ المؤقت. ستكون البويضات التي تُترك لتنمو في هذه المرحلة أحادية المجموعة الكروموسومية (haploids).

يجب إتمام الخطوات التالية خلال 90 ثانية من عملية الإخصاب. ابدأ تشغيل المؤقت في اللحظة التي يتم فيها تنشيط البويضات عن طريق إضافة الماء.

يعتمد التوقيت الدقيق للطور الاستوائي من الانقسام الاختزالي الأول على درجة الحرارة. وقد تم تحسين توقيت تطبيق الضغط وإزالته ليكون مناسباً لدرجة حرارة 28.5 درجة مئوية. بعد بدء المؤقت، انتظر لبضع لحظات، ثم أضف المزيد من الماء وحرك البويضات إلى مركز الطبق.

باستخدام ماصة باستور مقصوصة ومصقولة، انقل البيض المخصب إلى أنابيب الضغط عند الحاجة، وأضف المزيد من ماء البيض إلى الأنبوب حتى يكاد يفيض، مع ترك قطرة من الماء عند حلقة الأنابيب. بعد ذلك، ضع سدادة مطاطية فوق قطرة الماء وثبّت الغطاء البلاستيكي فوق المطاط.

ضع الأنابيب مقلوبة في أسطوانة الضغط، مع إضافة المزيد من ماء البيض. لإعادة ملء الأسطوانة، ثبّت الغطاء على الأسطوانة بإحكام. وبمجرد إغلاقها، ضع الأسطوانة في المكبس بحيث يكون المكبس للأعلى، ثم طبق ضغطاً مقداره 8, 000 pounds per square inch.

اترك الأسطوانة في المكبس حتى تمر ست دقائق من وقت التنشيط، ليكون إجمالي وقت الضغط 4.5 دقائق. بعد مرور ست دقائق على التنشيط، أخرج الأسطوانة من المكبس. قم بإزالة القوارير من الأسطوانة وجففها بعناية لمنع تبريد الأجنة.

أعد ضبط الأسطوانة وأعد ملأها بماء البيض. جهّز القوارير التالية عن طريق ملئها جزئياً بماء البيض حسب الحاجة. كرر هذه الخطوات لجميع دفعات البيض.

تتسع الأسطوانة لما يصل إلى قارورتين في المرة الواحدة، لذا قد ترغب في تأخير إخصاب البويضات لمدة دقيقة إلى دقيقتين لمعرفة ما إذا كانت الإناث الأخريات الموجودات بالفعل في trica سيعطين بويضات. سيساعد ذلك في تسريع العملية من خلال معالجة دفعات أكثر في وقت واحد. كما أنه إذا قمت بعصر الأسماك أثناء استخدام المكبس، فقد تكون البويضات جافة جداً لدرجة تمنع قابليتها للحياة بحلول الوقت الذي يمكن فيه استخدام المكبس مرة أخرى، وبعد 24 ساعة من الإخصاب، سيكون لجنين zebrafish أحادي الصيغة الصبغية جسم قصير وممتلئ، وذيل قصير، ودماغ أقل وضوحاً في التكوين.

ومع ذلك، ستكون جميعها تمتلك نفس أجزاء الجسم مثل somites وno cord والعيون والآذان. وباعتبارها diploids، فإن كل من haplos وdiploids تظهر حركات انثناء غير مقيدة في غضون 24 ساعة. بعد الإخصاب، تمتلك الأشقاء الـ EP diploid ذيولاً طويلة، وأدمغة منحوتة بشكل جيد، ويُفترض أن تكون نسبة قابليتها للحياة حوالي 60 إلى 70%.

تبدو هذه مشابهة جداً للمجموعات الضابطة المنشورة غير المعالجة. عادةً ما تحتوي مجموعة من أجنة haplo على خليط من أجنة ذات مظهر جيد، وأجنة ميتة، وكل ما بينهما. وتعكس نسبة الأجنة ذات المظهر الجيد إلى الأجنة المعيبة الجينات الضارة الموجودة في الجينوم الأنثوي.

تعد الطفرات سهلة التحديد نسبياً حتى مع وجود هذه الخلفية، نظراً لوجود عدة أفراد بنسبة تصل إلى 50% يمتلكون نفس النمط الظاهري المميز. ومن المهم التأكد من أن الأجنة الناتجة عن هذه الطريقة هي أجنة OIDs حقيقية؛ حيث يتم توليد مجموعة من البيض الثنائي الصيغة الصبغية الطبيعي كضوابط عن طريق الاحتفاظ ببعض الحيوانات المنوية دون تعطيل بالأشعة فوق البنفسجية، ومجموعة من الأجنة أحادية الصيغة الصبغية عن طريق الاحتفاظ بمجموعة من البيض المخصب بحيوانات منوية معطلة بالأشعة فوق البنفسجية دون الخضوع لإجراء EP، علماً بأن الأجنة أحادية الصيغة الصبغية لا تبقى حية بعد يومين إلى ثلاثة أيام. كما يجب أن تبدو الأجنة الناتجة عن إجراء EP مثل الأجنة الطبيعية ثنائية الصيغة الصبغية.

على الرغم من احتمال ظهور بعض وحوش EP غير المنتظمة، إلا أن مجموعات EP ثنائية الصيغة الصبغية يجب أن تكون قابلة للحياة بنسبة تتراوح غالباً بين 70 إلى 90%. ويشير وجود أحاديات الصيغة الصبغية في المجموعة التي تم تطبيق EP عليها إلى فشل في عملية EP، مثل فشل المكبس في الحفاظ على الضغط. بينما يشير وجود ثنائيات الصيغة الصبغية في مجموعة أحاديات الصيغة الصبغية إلى عدم اكتمال تثبيط الحيوانات المنوية، على سبيل المثال، فشل عامل الربط التشابكي.

لقد عرضنا لكم للتو مدى سهولة إجراء الإخصاب في المختبر لأسماك zebrafish، وكيفية إنتاج أجنة zebrafish ثنائية الصيغة الصبغية مشتقة وراثياً من الإناث عن طريق تثبيط الانقسام الميوزي الثاني. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن توقيت الضغط المبكر دقيق، وأن المكبس يحافظ على ضغط قدره 8,000 pounds per square inch طوال فترة المعالجة. تأكد من معايرة المكبس الخاص بك.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.