JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة

Full Text

19,149 Views

10:15 min

September 28, 2009

DOI: 10.3791/1425-v

Georg Vogler¹, Karen Ocorr¹

¹Development and Aging Program,The Sanford Burnham Institute for Medical Research

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

التقنية اللازمة لوضع الرؤية والقلب النابض في اليرقات وتعليم الكبار

Transcript

سيتم تقديم تقنيتين هنا لتصور قلب نابض في ذبابة الفاكهة لتشريح قلب البالغين. أولا ، تتم إزالة الرأس والصدر بقطع واحد على طول الخط المشار إليه. بعد ذلك ، تتم إزالة الأعضاء التناسلية وفتح تجويف جسم البطن باستخدام ملقط في الأمعاء ، وفي حالة الذبابة الأنثوية ، تتم إزالة المبايض.

يتم امتصاص الجسم الدهني في البطن في الأجزاء الثالثة والرابعة بعناية لتعريض القلب البالغ لتثبيت قلب اليرقات. يتم إصلاح يرقة واحدة موضوعة في محلول عازل عن طريق تطبيق غراء الهربة أولا حول منطقة رأس اليرقة. يتم شد اليرقات برفق ويتم تطبيق المزيد من الغراء على الطرف الخلفي ، ثم على جوانب جدار جسم اليرقة.

مرحبا ، أنا GI Fler. مرحبا ، أنا كارين إيه. كلانا أعضاء في برنامج التنمية والشيخوخة في معهد بورنهام للبحوث الطبية.

سنعرض لك اليوم الإجراءات التي طورناها لتصور القلب النابض للافال وذبابة الفاكهة البالغة. نستخدم كلا من هذين المستحضرين كطريقة لتصور وفحص وقياس معلمات نبضات القلب في ذبابة الفاكهة. ذبابة الفاكهة. قبل البدء ، نقوم أولا بإعداد محلول هيموليمف اصطناعي.

يحتوي هذا المحلول على مدخل السكروز ، هيلو ، والذي يجب إضافته إلى الهيموليمف الاصطناعي من محاليل المخزون المبردة قبل الاستخدام مباشرة. من أجل منع التلوث البكتيري ، قم بإحضار الهيموليمف الاصطناعي إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتزويد المحلول بالأكسجين عن طريق فقاعات الهواء لمدة 15 دقيقة على الأقل. بعد ذلك ، اسحب العديد من الشعيرات الدموية الدقيقة باستخدام مجتذب ماصة قياسي ، والذي سيكون ضروريا لإزالة الأجسام الدهنية في الذبابة.

بمجرد تحضير كل شيء ، يجب تخدير الذباب البالغ. يمكن القيام بذلك باستخدام التعرض القصير لقيلولة الطيران لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق ، ولكن احرص على عدم ترك الذباب في قيلولة الذباب لمدة تزيد عن خمس دقائق. يمكن أيضا استخدام التعرض قصير المدى للبرد لتخدير الذباب ، ولكن لا ينصح بثاني أكسيد الكربون لأن له تأثيرات طويلة الأمد على معدل ضربات القلب وقدرته.

بعد ذلك ، يتم وضع الذباب المخدر على الجانب الظهري لأسفل في طبق بتري مغطى بطبقة رقيقة من الفازلين. يجب أن تلتصق البشرة الكارهة للماء في الأجنحة والجسم بالهلام بشكل عكسي ، ولكن يمكن إعادة وضع الذبابة إذا لزم الأمر. يتم إجراء القطع الأولي باستخدام زوج منحني من مقص الزنبرك.

يتم ذلك عن طريق وضع شفرات المقص تحت أرجل الذبابة وبزاوية لأسفل باتجاه السطح الظهري بالقرب من الرقبة. تتم إزالة الرأس والحبل العصبي البطني والساقين بقطع واحد بمجرد قطعه. ثم يتم غمر المستحضر في محلول ليمفاوي hemo الاصطناعي المؤكسج باستخدام مقص زنبركي.

تتم إزالة الطرف الخلفي للبطن ، والذي يتكون من الجزء البطني السابع والثامن ، بقطع واحد. يوفر هذا الوصول لعمل جروح جانبية على طول طرفي البطن ويعمل على قطع الاتصال بين الأمعاء الخلفية وبشرة البطن. أدخل شفرات المقص في الفتحة الصغيرة في طرف البطن وقطع البشرة بشكل جانبي.

هذا يحرر حافة واحدة من البشرة البطنية. أمسك السديلة بالملقط وقم بعمل قطع مماثل على طول الحافة الجانبية المقابلة للبطن. يمكن الآن إزالة السديلة المحررة لبشرة البطن البطنية.

يمكن عادة إزالة الأمعاء وأعضاء البطن الأخرى ككتلة واحدة باستخدام ملقط الصائغ والشد اللطيف. تكشف إزالة الأعضاء الداخلية عن أنبوب القلب النابض ، والذي لا يزال متصلا بالبشرة الظهرية بواسطة عضلات صغيرة وتحيط به أجسام دهنية. يتم إدخال الشعيرات الدموية المسحوبة في البلاستيك ، وأنبوب واحد مقاس 16 بوصة متصل بمصدر فراغ.

تتناسب قوة الشفط مع قطر الطرف، لذلك لا ينبغي استخدام الماصات ذات الأطراف التي يزيد قطرها عن 40 ميكرون بمجرد تركيبها. يستخدم نظام الشفط هذا لامتصاص الدهون الزائدة من حول أنبوب القلب. يمكن استخدامه أيضا لإزالة فقاعات الهواء التي تتراكم حول البشرة وأي حطام.

يجب توخي الحذر الشديد لتجنب لمس القلب نفسه ، ولأن الجزء الخلفي من القلب هش للغاية ، يجب تجنب هذه المنطقة معا. يتعرض أنبوب قلب ذبابة الفاكهة البالغة الآن ويجب أن ينبض إذا لزم الأمر. يمكن إعادة وضع البشرة والقلب المرفق عن طريق رفع البشرة برفق من الفازلين ودكها بعناية مرة أخرى.

تجنب أي ملامسة لأنسجة القلب. في هذه المرحلة ، يجب استبدال المحلول الذي يستحم المستحضر بالهيموليمف الاصطناعي الطازج. يجب السماح لهذا المستحضر بالتوازن لمدة 20 إلى 30 دقيقة مع الأكسجين قبل أي تلاعب.

إذا كان سيتم الحفاظ على المستحضر لمدة تزيد عن 60 دقيقة ، فيجب إعادة إدخاله بالهيموليمف الاصطناعي الطازج. هذا المستحضر جاهز الآن للاستخدام في التسجيل البصري ويمكن استخدامه أيضا للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي أو للتلاعب النسيجي. مطلوب تقنية مختلفة لتصور القلب النابض داخل اليرقات.

أولا ، قم بإعداد زلات الغطاء في اليوم السابق للإجراء. يتم ذلك باستخدام عود أسنان لنقل حوالي 50 إلى 70 ميكرولترا من محلول Sard إلى زلة غطاء 22 × 22 ملم. دع واقي السيل يتصلب عند 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

بعد ذلك ، قم بعمل المخزن المؤقت Brody and Bates بمجرد تحضيره ، ويمكن تخزين الحصص عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر وإذابتها عند الحاجة. أخيرا ، قم بإعداد الأدوات المطلوبة لتطبيق الغراء الهيستو أكرال. أولا ، اسحب العديد من الشعيرات الدموية الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بتوصيل طرف ماصة سعة 1.5 مليلتر بأنبوب بلاستيكي صغير يبلغ قطره حوالي 32 بوصة. عن طريق إدخال الطرف الأصغر في الأنبوب ، أدخل الشعيرات الدموية بفتحتها الواسعة إلى الطرف الآخر. بمجرد الإعداد ، قم بتحميل الشعيرات الدموية بغراء histo عن طريق غمس الشعيرات الدموية في قطرة من الغراء وشفط لطيف في الطرف البلاستيكي.

عند العمل مع الغراء ، يجب أن يكون لدى المرء شعرية زجاجية ثانية في متناول اليد لإزالة الغراء الزائد من طرف الشعيرات الدموية الغراء. يصبح الغراء سائلا حتى يتلامس مع محلول ملحي مخزن حيث يتصلب في غضون ثوان. ومع ذلك ، فإنه عادة ما يظل بلاستيكيا لفترة كافية لإزالته من طرف الشعيرات الدموية للغراء أو أثناء وضعه على العينة.

الآن لبدء تثبيت اليرقات ، ضع قطرة من الغراء الهيستو بالقرب من كل ركن من أركان واقي السيل. تضيف زلات الغطاء 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت B و B إلى قطرات الغراء ، والتي ستتصلب على الفور وتملأ الفراغ بين البقع الملصقة ب b و b. سيحافظ الغراء على المخزن المؤقت على الشريحة.

خذ ثلاث يرقات متجولة وضعها على قطعة من المناديل الورقية المبللة على الجليد لمدة دقيقتين. سيؤدي ذلك إلى إبطاء حركتها. بعد ذلك ، انقل اليرقات إلى المخزن المؤقت ووجهها مع الجانب الظهري لأعلى.

هذا هو جانب اليرقات الذي يفتقر إلى الأحزمة المتطابقة. ضع بعض الغراء بسرعة بين منطقة الرأس وواقي العتبة. سوف يتصلب الغراء بسرعة كبيرة ويمنع رأس اليرقات من الحركة.

باستخدام ملقط ، أمسك بعناية من البريق الخلفي وقم بتمديده برفق. ثبت اليرقات في هذا الوضع عن طريق وضع الغراء على جانبي اليرقات في النصف الخلفي. لتقليل المزيد من حركة بشرة بواسطة عضلات جدار الجسم ، أضف المزيد من الغراء إلى جوانب.

تم إصلاح اليرقة الآن في هذا الموضع. يمكن الآن وضع زلة الغطاء في طبق بتري صغير مليء بالهيموليمف الاصطناعي أو نبضات القلب PBS دون تدخل من حركات جدار الجسم. سوف ينبض قلب ذبابة الفاكهة البالغ شبه السليم بشكل إيقاعي لساعات بعد التشريح عند الحفاظ عليه في الهيموليمفا الاصطناعي المؤكسج الطازج.

يظهر مثال تمثيلي هنا وفي الفيلم التكميلي قلوب واحدة من الثالثة في يرقات النجوم الموضحة هنا ، والذباب الصغير الذي يبعد من أسبوع إلى ثلاثة أسابيع يظهر عموما ضربات قلب منتظمة بمعدلات تتراوح بين واحد إلى ثلاثة هرتز ، والذباب الذي يزيد عمره عن ثلاثة أسابيع بشكل عام يكون أكثر عدم انتظام ضربات القلب. ومع ذلك ، لا تزال هذه القلوب قادرة على النبض تلقائيا لساعات في قلوب الهيموليمف الاصطناعية المؤكسجة والذباب البالغ الذي تضرر نتيجة لإجراء التشريح عادة ما يظهر مناطق موضعية من الانقباض الشديد غير قادرة على الاسترخاء وغالبا ما تكون لا يمكن السيطرة عليها. نادرا ما يتم ملاحظة معدلات ضربات القلب أبطأ من هرتز واحد في الذباب الذي يقل عمره عن ثلاثة أسابيع.

وبالتالي ، تعتبر هذه المستحضرات تالفة ويتم التخلص منها. لقد أوضحنا للتو كيفية تحضير قلوب ذبابة الفاكهة البالغة للتصوير البصري. تذكر أنه عند إجراء التحضير شبه السليم ، لا تلمس القلب نفسه أبدا.

هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.

Explore More Videos

علم وظائف الأعضاء العدد 31 ذبابة الفاكهة والكبار وشبه سليمة إعداد وعدم انتظام ضربات القلب عضلي يرقة الغراء