Name: حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية /em (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: تعلم طريقة فوسفوبروتوميكس كمية لدراسة آليات الإشارة الخلوية في خميرة السكيراء الجعوية. تستخدم هذه التقنية مطيافية الكتلة لتحليل الببتيدات الفوسفوريلية المُستخرجة بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر الدكتور ريتش روجرز للحصول على المساعدة الفنية مع تحليلات ومناقشات مطياف الكتلة مفيدة ، والدكاترة. سرقة موريتز ، Ranish جيف ، وحميد Mirzai لإجراء مناقشات مفيدة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومراكز للتميز.

نمو الخلايا وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستعمرة واحدة من خلايا BY4742Δarg4Δlys1 بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام 100 مل الغنية إلى OD 600 من البذور ثم 1.0 في الثقافات 1 ثنائية لتر من الخميرة المتوسطة الحد الأدنى (0.17 ٪ النيتروجين الخميرة قاعدة دون سلفات الأمونيوم أو الأحماض الأمينية ، و 0.5 ٪ كبريتات الامونيوم) تحتوي على كاملة مكملة من الأحماض الأمينية ، وتستكمل مع L / 20mg من أرجينين isotopically العادي أو الثقيل (13 C N 4 6 15 ؛ Isotec) ويسين (13 6 15 C N 2 ؛ Isotec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونمت الخلايا لمدة 18 ساعة ، إلى 600 من OD 1.8. فمن الأهمية بمكان أن تذهب من خلال خلايا لا يقل عن 9 الأجيال لتحقيق الإدماج الكامل للنظائر المسمى. كانت العينة ضوء مكعبات ، وغسلها بالماء المعقم ، reseeded الى أوليئات تحتوي على المتوسط ​​(أرجينين العادي isotopically ويسين ، أوليئات 0.2 ٪ (كيماويات سيغما) و 0.5 ٪ توين 40 (سيغما كيماويات)) ، وحفز لمدة دقيقة 85. غلة هذا الضوء isotopically ، فيما يتعلق أرجينين ويسين ، أوليئات - حفز عينة والثقيلة isotopically عينة مرجعية الغلوكوز نمت. </li></ol> تحلل الخلية ، وعزل والتقطير من الببتيدات <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن زجاجة الطرد المركزي. عينات الحصاد بواسطة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق. إزالة وسائل الإعلام ونضح السوائل الزائدة. وزن بيليه وزجاجة (لن تسفر عادة بين 1-2 جرام) ثم تجميد فلاش في النيتروجين السائل. إضافة إلى ما يعادل حجم الوزن من بيليه العازلة &quot;طحن&quot; في كريات مجمدة في النيتروجين السائل (الفوسفات التخزين المؤقت المالحة (PBS ، Gibco) ، و 10 ٪ الجلسرين ، مثبطات الأنزيم البروتيني (أقراص SigmaFAST المانع البروتياز ، سيجما) ووقف مثبطات الفوسفاتيز (الحرارية العلمية )). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد السفينة طاحنة في النيتروجين السائل. انتظر حتى يتوقف غليان النيتروجين السائل. بيليه نقل إلى وعاء الطحن ، مع الكرات المجمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن في 600 دورة في الدقيقة مع حلقة 20 دقيقة 1 ثانية مع عكس الاتجاه لمدة 3 دقائق. اعادة تجميد السفينة طاحنة في النيتروجين السائل. كرر 4 مرات أكثر لمدة 15 دقيقة مجموع الوقت طحن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع grindate مجمدة في الجليد فالكون 50ml أنبوب مكان جاف. المحل في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الحل 10ML من اليوريا 8M ، 0.1M بيكربونات الأمونيوم ، ودرجة الحموضة 8.6 0.1M تريس. إضافة 3 مجلدات من اليوريا إلى 1 العازلة حجم grindate المجمدة (على سبيل المثال من 3mls العازلة اليوريا واضاف بيليه إلى 1 غرام مع 1 مل من العازلة PBS). يصوتن الخليط على الفور مع لجنة التحقيق sonicator غيض (2-10 البقول الثانية). الحفاظ على الحافة بالقرب من الجزء السفلي من أنبوب لمنع الرغوة من الحل. يجب أن تذهب فورا إلى grindate الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح lysate بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف لأنابيب نقل جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل قسامة جديدة من تريس 0.5M [2 - carboxyethyl] الفوسفين (TCEP). إضافة إلى نموذج 1:100 في لتركيز نهائي 5mM. احتضان في 37 ساعة : 1 درجة مئوية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ألكلة من cysteines مخفضة. السماح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. جعل قسامة جديدة من iodoacetamide 1M. نضع في الظلام (ونحن التفاف أنبوب في احباط). إضافة إلى التركيز النهائي لل20mM. احتضان في الظلام لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخماد iodoacetamide مع DTT 20mM من الأسهم 1M في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كمية البروتين مع برادفورد القياسية أو مقايسة BCA (لا توصف). أخذ عينة لتحليلها بواسطة SDS PAGE أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من صحة إدراج النظائر الثقيلة ، واستخدام 100 ميكرولتر من lysate مخفضة والألكيلية. 01:04 تمييع مع DH 2 O ، وإضافة التربسين يصوتن في 50:1 البروتين لالتربسين. هضم لمدة لا تقل عن 4 ساعات ، العينة الجافة بانخفاض في السرعة وبطالة desalt ثم مع الأعمدة Ultramicrospin C18 (الفريق عش). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات العمود مع 100 ميكرولتر من الأسيتونيتريل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن مع TFA ميكرولتر 200 بنسبة 0.1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend العينة الجافة في TFA ميكرولتر 200 بنسبة 0.1 ٪. تحميل على العمود. الطرد المركزي في XG 200 ~ أو أدنى من سرعة المطلوبة للتدفق من خلال العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل مرتين مع TFA ميكرولتر 200 بنسبة 0.1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل مع مرتين مع الأسيتونيتريل ميكرولتر 50 60 ٪ ، TFA 0.1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العينة الجافة في سرعة بطالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend في 20 عينة حمض الفورميك ميكرولتر 0.1 ٪. تشغيل 2 ميكرولتر على مطياف الكتلة. الاختيار إدراج أرجينين الثقيلة وisotopically يسين بتحول دالتون 10 و 8 في أطياف م / ض منهما. وينبغي إدراج كل من الأحماض الأمينية تكون بين 96 -- 98 ٪. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج المبالغ المعادلة (ملغ من البروتين) من عينات isotopically الثقيلة والخفيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 01:04 العينة مع الميثانول 20 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة التربسين في 1:200. يحضن بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن عملية الهضم قد ذهب إلى إنجاز SDS PAGE. تشغيل 2 و 4 ميكرولتر من العينة التهضيم و 8 anد 16 ميكرولتر للهضم التربسين آخر. تصور من قبل تلطيخ Coomassie أن اكتمال عملية الهضم. إذا لم تكن كاملة ، يصوتن العينة لفترة وجيزة مع sonicator غيض التحقيق مرة أخرى مع وهضم التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف عينة عليها في سرعة بطالة. عند إضافة الجافة 200 ميكرولتر من تصفيتها O 2 درهم ودوامة حتى بيليه يذهب الى حل. عينة أسفل الجافة في سرعة بطالة. Resuspend مرة أخرى مع DH 2 O. جفاف العينة مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بيليه في حمض Trifluoracetic 0.1 ٪ (TFA ؛ سيغما). تأكد من أن الرقم الهيدروجيني حوالي 3 باستخدام شرائح الأس الهيدروجيني. إذا لزم الأمر مع يحمض TFA 10 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه خارج أي راسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desalt العينات على مياه سبتمبر الباكستانية بطالة العمود C18 500 ملغ. لا الزائد هذه الأعمدة. المبلغ الأقصى هو 5 مغ لكنه أفضل قليلا لتحميل أقل. تقسيم العينة بين عدة أعمدة إذا لزم الأمر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات العمود مع أسيتونتريل 5 مل 100 ٪. الطرد المركزي في XG 200 ~ أو أدنى من سرعة المطلوبة للتدفق من خلال العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن العمود مع 5ml TFA 0.1 ٪. تحميل العينة. تدفق جمع وتحميل مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع TFA 5 مل 0.1 ٪. تكرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل مع 2ml الأسيتونيتريل 60 ٪ ، TFA 0.1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة أسفل الجافة في سرعة بطالة. </li></ol></li></ol> الببتيد التقطير وعزل Phosphopeptides <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الببتيدات هي مجزأة على عمود HILIC. نستخدم TOSOH TSK - جل الأميد 4.6 - 80 مم × 25 سم عمود التحليلية مع عمود الحراسة. خذ وقتك مع هذه الخطوة ، تشغيل العمود لمدة 2 ساعة على 90 ٪ وتشغيل ثم اثنين التدرجات فارغة قبل التحميل عينتك. الحمل الأقصى على عمود ويعتقد أن هذا الحجم إلى حوالي العشرين ، ونحن عادة لا يتم تحميلها أكثر من 5 ملغ في التشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مذيب أ -- 98 ٪ ACN/0.1 ٪ TFA المذيب ب -- 2 ٪ ACN/0.1 ٪ TFA تحميل في 90 ٪ أكثر من 20 ألف ، 90 ٪ إلى 85 ٪ وهناك ما يزيد على 5 ، 85 ٪ إلى 60 ٪ وأكثر من 40 ألف ، 60 ٪ من ألف إلى 0 ٪ وأكثر من 5 ، 0 ٪ إلى 90 ٪ وأكثر من ألف 5 &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معدل التدفق 1ml/min وجمعت الكسور في فترات دقيقة 2 ابتداء من 85 ٪ إلى 60 ٪ والتدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الكسور للحد من عدد من الكسور إلى 10. وسيؤدي على الارجح الى زيادة كسور أكبر تغطية phosphoproteome. </li></ol> إثراء phosphopeptides <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إثراء Phosphopeptides به مؤسسات الصحة الأولية لاختيار جل تقارب الحديدي. نحن لدينا راتنج قسامة IMAC لتجنب تكرار تجميد الذوبان. جعل 50 ملل من حمض الخليك 250 ملم ، و 30 ٪ الحل تحميل ACN. إحضار الرقم الهيدروجيني إلى 2.7 مع حمض الهيدروكلوريك. Resuspend الكريات في 500 ميكرو لتر من محلول يتم تحميلها. فحص الحموضة ، وضبط مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم أو حسب الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewash 200 ميكرولتر من الخرز IMAC في العمود المناسب. علينا استخدام الأعمدة تدور Molbiotec. إضافة 15 ميكروليتر من الطين 50 ٪ (هلام لتحميل الحل) إلى كل جزء ، واحتضان نماذج لمدة 30 &quot;مع نهاية التناوب على النهاية. الحفاظ على تدفق للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات 3 مرات مع الحل تحميل ومرة واحدة مع 500 ميكرولتر تصفيتها درهم 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل الببتيدات مع 2 -- 3 دقائق مع 400 ميكرولتر من 50 ملي نا 2 هبو 4 (8.4 درجة الحموضة) العازلة. نقل إلى قارورة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحمض إلى درجة الحموضة 3 مع 5 ميكرولتر حمض الفورميك بنسبة 100 ٪ ، ومضة التجميد في النيتروجين السائل والمجفف عينة عليها في سرعة بطالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend phosphopeptides في 200 ميكرولتر من TFA 0.1 ٪ و C18 نظيفة كما هو موضح أعلاه. أسفل عينات eluted الجافة في سرعة بطالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الببتيدات في 20 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪. 2 ميكرولتر استخدام مطياف الكتلة في التحليل أو حسب الحاجة. </li></ol> تلاحظ لجزء كبير من هذا البروتوكول سوف تعمل &#39;الأعمى&#39;. ويمكن رصد تحلل الخلية النشاف الغربية والمقايسات برادفورد أو BCA ، ويمكن أيضا أن تكون عملية الهضم التربسين المقررة بسهولة. سوف العمود HILIC أعطى تتبع مشابهة لهذه واحدة ، أو كما يراها الآخرون [1 ، 2] اعتمادا على آلة اللوني السائل الذي يتم استخدامه. ويتم رصد العينات بواسطة مطياف الكتلة ، واختبار العينات الخاصة بك على الأجهزة غير مكلفة مثل LCQs MALDIs أو قبل الذهاب إلى تحليلات التكلفة العالية على دقة عالية الشامل ، وارتفاع آلة القرار. أخيرا إذا كان لك وتجفيف بانخفاض عينة مع حمض فيه ، واستخدام الزجاج.

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

وهذه الطريقة تؤدي الى تخصيب phosphopeptides التي يمكن تحليلها كميا. ويمكن تغيير عدد من المعلمات في هذا البروتوكول ، ولكن الجانب الأكثر أهمية هو أن نتذكر للحفاظ على الفسفرة الخاص. لا يمكن أن يتحقق إعداد الخلايا لالكمي في عدد من طرق مختلفة ، على سبيل المثال اذا كنت لا تستطيع تسمية الخلايا الخاصة بك في العلامات ، فيفو مثل ICAT [3] أو ITRAC [4] ويمكن استخدام استخراج آخر لتسمية تفاضليا ثقافتين لالكمي الأغراض. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direct...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Arginine-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Lysine-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>محلول GIBCO&amp;#8482; الفوسفاتي المنظم (PBS) 7.4 (10X) سائل</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>أقراص SigmaFAST المثبطة للبروتياز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>مزيج Pierce Halt المثبط للفوسفاتاز</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>مطحنة الكرات Retsch PM100</td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>وعاء طحن من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 125 ml من Retsch</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>عمود Ultramicrospin C18</td><td>The Nest Group</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>عمود تحليل TSK-Gel Amide-80 بمقاس 4.6 mm x 25 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>هذا هو عمود الكروماتوغرافيا HILIC.</td></tr><tr><td>عمود حماية بمقاس 4.6 mm ID x1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>نوصي باستخدام عمود الحماية هذا لإطالة عمر عمود HILIC الخاص بك.</td></tr><tr><td>هلام ألفية الحديد PHOS-Select&amp;#8482;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>هذا هو راتنج IMAC. قم بتقسيمه إلى حصص وتخزينه.</td></tr></tbody></table>

حفز phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

يصف هذا البروتوكول في نمو والتحفيز ، مع أوليئات الأحماض الدهنية ، الثقيلة والخفيفة isotopically خلايا خميرة س. هي الأرض الخلايا باستخدام إجراء cryolysis في كرة مطحنة مطحنة وgrindate الناتجة جلبت الى حل عن طريق solubilization اليوريا. هذا الإجراء يسمح للتحلل الخلايا في دولة غير نشطة عملية الأيض ، والحفاظ على الفسفرة ومنع إعادة توجيه phosphoproteome أثناء تحلل الخلية. بعد التخفيض ، ألكلة ، تربسين هضم البروتينات ، والمحلاة العينات على أعمدة C18 وتعقيد العينة بنسبة تجزئة باستخدام ماء التفاعل اللوني (HILIC). أعمدة HILIC الاحتفاظ تفضيلي الجزيئات المائية التي هي مناسبة تماما لphosphoproteomics. الببتيدات فسفرته تميل إلى أزل في وقت لاحق ملف الكروماتوغرافي من نظرائهم من غير فسفرته. بعد التجزيء ، وأثرى به phosphopeptides يجمد اللوني المعادن ، الذي يعتمد على المسؤول القائم على الانتماءات لتخصيب phosphopeptide. في نهاية هذا الإجراء العينات مستعدون ليتم تحليلها كميا بواسطة مطياف الكتلة.

وصف إجراء الفسفرة باستخدام كمية cryolysis ، solubilziation اليوريا ، وتجزيء HILIC تخصيب IMAC من الببتيدات فسفرته.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

يصف هذا البروتوكول طريقة نمو وتحفيز خلايا خميرة *S. cerevisiae* الثقيلة والخفيفة نظيرياً، وذلك باستخدام الحمض الدهني أوليات (oleate). يتم طحن الخلايا...

تعد الفسفرة آلية إشارة خلوية رئيسية تحكم عمليات تتراوح من تموضع البروتينات إلى نسخ DNA، وتمثل دراسة الفسفو بمفرده عن طريق مطيافية الكتلة تقدماً جديداً ومثيراً في دراسة كل من الإشارات والبروتيوميات. يتم تحليل الخلايا ذات الوسوم المختلفة عن طريق التحلل في مطحنة كرات، ثم تُختزل وتُؤلكل وتُخلط وتُهضم. تُجزأ الببتيدات المهضومة عن طريق كروماتوغرافيا التفاعل المحب للماء، ثم تُثري الببتيدات المفسفرة من الأجزاء عن طريق إثراء iMac.يتم بعد ذلك تحديد الكسور المخصبة بالببتيدات المفسفرة بواسطة msm. مرحباً، أنا رامزي سيلين من مجموعة E في معهد Persistence Biology. سنعرض لكم اليوم إجراءً لاستخلاص الببتيدات المفسفرة الموّسمة أيضياً.نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة بروتيوم fossa كمياً. لذا دعونا نبدأ. يبدأ هذا الإجراء بزراعة خلايا خميرة خفيفة وثقيلة نظيرياً.أولاً، يتم تلقيح 100 ملليلتر من وسط غذائي غني بمستعمرة واحدة من خلايا الخميرة. تُنمى هذه المزرعة طوال الليل حتى تصل الكثافة الضوئية OD 600 إلى 1.0. بعد ذلك، تُستخدم هذه المزرعة لتلقيح مزرعتين بحجم لتر واحد من وسط غذائي أدنى يحتوي على مجموعة كاملة من الأحماض الأمينية ومُدعم بـ 20 مليغرام لكل لتر من النظائر المشعة.قم بتنمية مزارع سعة لتر واحد لكل من الأرجينين واللايسين العاديين أو الثقيلين نظائرياً لمدة 18 ساعة حتى تصل الكثافة الضوئية OD 600 إلى 1.8. من الضروري أن تمر الخلايا عبر تسعة أجيال على الأقل لتحقيق الدمج الكامل للنظائر المسمى. عندما تدمج الخلايا النظائر المسمى بالكامل، قم بطرد مركزي للخلايا التي نمت في الوسط الذي يحتوي على أرجينين ولايسين عاديين نظائرياً.للحصول على كرة خلوية، اغسل الكرة بالماء المعقم ثم استزرعها في وسط يحتوي على الأوليات مع الأرجنين واللايسين الطبيعيين نظائرياً، ثم قم بالتحفيز لمدة 85 دقيقة. ينتج عن ذلك عينة محفزة بالأوليات خفيفة نظائرياً. أما المزرعة الأخرى التي نمت في أوساط تحتوي على الأرجنين واللايسين الثقيلين نظائرياً فلا يتم تحفيزها بالأوليات، وستعمل كعينة مرجعية نمت على الجلوكوز وثقيلة نظائرياً.لجمع لتر واحد، يتم توزيع المزرعة على أربع زجاجات طرد مركزي سعة 250 ملليلتر. بعد الطرد المركزي، تُجمع الخلايا في أنبوب واحد عن طريق إزالة جميع سوائل الوسط باستثناء 100 ملليلتر، ثم إعادة تعليق الخلايا ونقلها إلى الأنبوب التالي. في النهاية، يتم جمع كتلة واحدة كبيرة في أنبوب واحد ثم يتم إجراء الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق بسرعة 4,000 RPM.بعد إزالة الوسط، تتم مقارنة وزن زجاجة جهاز الطرد المركزي والرواسب بوزن زجاجة طرد مركزي فارغة. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الوسط وشفط السوائل الزائدة من الزجاجات، ثم زن الرواسب؛ حيث يتراوح المحصول النموذجي عادةً بين جرام واحد إلى جرامين. بعد ذلك، قم بالتجميد السريع للرواسب في النيتروجين السائل، ثم أضف إلى الرواسب محلول التخزين (grinding buffer) الذي يحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتاز.يجب أن يكون حجم محلول التخزين المضاف مكافئاً لوزن الراسب. قم بتجميد وعاء الطحن في النيتروجين السائل. عندما يتوقف النيتروجين السائل عن الغليان.استخدم ملوقاً (scapula) لتفتيت القرص ونقله إلى وعاء الطحن الذي يحتوي على كرات محمل مجمدة. اطحن الأقراص بسرعة 600 RPM بدورة مدتها دقيقة واحدة وثانيتان مع عكس الاتجاه لمدة ثلاث دقائق. أعد تجميد وعاء الطحن في النيتروجين السائل.كرر عملية الطحن أربع مرات إضافية لمدة إجمالية تصل إلى 15 دقيقة. يتم تحديد وقت الطحن عند اكتمال العملية لكلا العينتين. اجمع المواد المطحونة والمجمدة في أنابيب فالكون سعة 50 مللتر واحفظها مجمدة إما في النيتروجين السائل أو في الثلج الجاف.تُحفظ العينة المطحونة عند درجة حرارة 80- °C حتى يحين وقت استخدامها. تبدأ عملية عزل وتجزئة الببتيدات بعملية الألكلة، وتتمثل الخطوة الأولى في إذابة العينة في محلول اليوريا.قم بإذابة كل عينة من العينات المطحونة عن طريق إضافة ثلاثة أحجام من منظم اليوريا إلى حجم واحد من العينة المطحونة المجمدة. على سبيل المثال، يتم إضافة ثلاثة ملليلترات من منظم RIA إلى كريّة بوزن جرام واحد. مع ملليلتر واحد من منظم PBS.قم بمعالجة الخليط فوراً باستخدام المجس بالموجات فوق الصوتية. وجه المجس بحيث يظل قريباً من قاع الأنبوب لمنع تكون رغوة في المحلول.يجب أن تذوب المادة المطحونة فوراً في المحلول. قم بتصفية نواتج التحلل عن طريق الطرد المركزي بسرعة 6,000 RPM لمدة خمس دقائق. وعند درجة حرارة 4 °C، انقل الطافي إلى أنابيب جديدة.لبدء تفاعل الاختزال، أضف محلول tris بتركيز 0.5 molar مُحضّر حديثاً، أو TCEP أو two carboxyl LITAL PHOSPHINE إلى كل عينة بنسبة تخفيف 1 إلى 100. وللوصول إلى تركيز نهائي من TCEP يبلغ 5 millimolar، قم بحضن العينات عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة. بعد الحضن عند 37 °C، اترك العينات لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.ثم أضف iota acetamide بتركيز 1 molar مُحضّر حديثاً ليصل إلى تركيز نهائي قدره 20 millimolar، وحضّن المزيج في الظلام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد انتهاء فترة التحضين التي استمرت ساعة واحدة، قم بإيقاف تفاعل iota acetamide بإضافة DTT بتركيز 20 millimolar. اترك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.أصبحت المستخلصات المختزلة والمؤلكلة الآن جاهزة للهضم باستخدام تريبسين. في هذه المرحلة، يمكن استخدام عينات من المستخلصات لتقدير كمية البروتين وتحليل SDS page للتحقق من تحلل الخلايا، وتحليل مطياف الكتلة للتحقق من دمج النظائر الثقيلة. لبدء عملية الهضم بالتريبسين، اخلط كميات متساوية من العينات الثقيلة والخفيفة نظيرياً.خفف العينة بنسبة واحد إلى أربعة باستخدام 20% methanol وأضف trypsin بتخفيف واحد إلى 200. حضن العينة طوال الليل عند 37 °C وفي اليوم التالي، وبعد التحقق من اكتمال الهضم بواسطة SDS page وصبغة kumasi، جفف العينة في جهاز speed vac حتى تجف تماماً.أضف 200 microliters من الماء المقطر المفلتر وقم بالرج باستخدام جهاز vortex حتى تذوب الراسبة تماماً. جفف العينة باستخدام جهاز speed vac ثم أعد تعليقها مجدداً بالماء المقطر. بعد تجفيف العينة مرة أخرى، أعد تعليق الراسبة في 0.1% Tri Fluor acetic acid أو TFA، وتحقق من أن pH يقارب ثلاثة باستخدام شرائط قياس pH إذا لزم الأمر. قم بالتحميض باستخدام 10% TFA للتخلص من أي رواسب.سيتم الآن إزالة الأملاح من العينة المهضومة بواسطة التربسين باستخدام عمود C 18 من نوع water set pack VAC 500 milligram. للبدء، يتم ترطيب العمود باستخدام 5 mL من الأسيتونيتريل بتركيز 100%، مع الطرد المركزي عند حوالي 200 ×g أو الحد الأدنى من السرعة المطلوبة لتدفق السائل عبر العمود. بعد ذلك، يتم موازنة العمود باستخدام 5 mL من TFA بتركيز 0.1%، ثم تُحمَّل العينة.توخَّ الحذر لتجنب تحميل العمود بشكل زائد، وإذا لزم الأمر، قم بتقسيم العينة على عدة أعمدة. اجمع التدفق في حاوية نفايات وأعد تحميل العمود مرة أخرى إذا لزم الأمر، ثم اغسله بـ 5 mL من 0.1%TFA. كرر عملية الغسل هذه ثم استخلص المادة باستخدام 2 mL من 60%Aceto nitrile 0.1%TFA، ويجب جمع الـ EEU عن طريق الطرد المركزي.جفف العينة باستخدام جهاز التجفيف بالتفريغ السريع (speed vac)، ثم أعد تعليق العينة المجففة في 200 µL من المذيب B. أصبحت العينة المعاد تعليقها الآن جاهزة لتجزئة الببتيدات. قم بتجزئة الببتيدات باستخدام عمود تحليلي TSK gel AMIDE 80 مع عمود حماية. تأنَّ في تنفيذ هذه الخطوة.قم بتشغيل العمود لمدة ساعتين بنسبة 90% من المذيب A، ثم قم بتشغيل تدرجين فارغين قبل تحميل العينة. عادةً لا نقوم بتحميل أكثر من 5 mg لكل تشغيلة في عمود بهذا الحجم؛ حيث تتيح أجهزة الكروماتوغرافيا السائلة الحديثة، وحتى غير الحديثة، حقن العينات آلياً، وجمع الأجزاء، والتحكم في معدل التدفق، ومزيج التدرج.يتم ضبط هذه الإعدادات في بداية التشغيل كما هو موضح. يتم التحميل بنسبة 90%A على مدار 20 دقيقة، ثم من 90%A إلى 85%A على مدار خمس دقائق، ومن 85%A إلى 60%A على مدار 40 دقيقة، ومن 60%A إلى 0%a على مدار خمس دقائق، ومن 0%A إلى 90%a على مدار خمس دقائق. يتم ضبط معدل التدفق عند ملليلتر واحد في الدقيقة، مع جمع الأجزاء على فترات زمنية مدتها دقيقتان.بدءاً من التدرج من 85%A إلى 60%A، يتم دمج الأجزاء لتقليل عددها إلى 10 أجزاء، حيث إن زيادة عدد الأجزاء من المرجح أن تعطي تغطية أكبر للبروتينات المفسفرة. يتم إثراء الببتيدات المفسفرة عن طريق كروماتوغرافيا المعادن المثبتة. نستخدم هلام phos select iron affinity كراتنج iMac.أولاً، قم بتعليق الكريات في 500 µL من محلول التحميل. بعد ذلك، أضف 15 µL من ملاط بتركيز 50% إلى كل جزء، ثم قم بحضن العينات لمدة 30 دقيقة مع التدوير الشامل (end over end rotation). احتفظ بالتدفق من أجل التحليل.اغسل العينة ثلاث مرات بمحلول التحميل، ومرة واحدة بـ 500 µL من الماء المقطر المفلتر؛ وبعد عمليات الغسل، استخلص الببتيدات لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق باستخدام 400 µL من محلول صوديوم فوسفات المنظم بتركيز 50 mM. انقل الببتيدات المستخلصة إلى قارورة زجاجية. أضف 5 µL من حمض الفورميك بتركيز 100% إلى الببتيدات لخفض الرقم الهيدروجيني إلى pH 3، ثم أعد تعليق الببتيدات المفسفرة في 200 µL من TFA بتركيز 0.1% وقم بإزالة الأملاح مرة أخرى باستخدام عمود C 18 كما هو موضح سابقاً، ثم جفف العينات المستخلصة في جهاز SpeedVac.أخيراً، أعد تعليق الببتيدات المفسفرة في 20 µL من حمض الفورميك بتركيز 0.1%. وأصبحت العينات الآن جاهزة للتحليل الكمي بواسطة مطيافية الكتلة. يظهر هنا مخطط كروماتوغرافي ناتج عن تجزئة الببتيدات الخلوية الكلية باستخدام كروماتوغرافيا H-I-L-I-C.يمكن ملاحظة أن الببتيدات المفسفرة توجد على طول ملف الشطف، إلا أن معظم البقايا المفسفرة يتم الاحتفاظ بها حتى نهاية ملف الشطف تقريباً. لقد عرضنا لكم للتو كيفية طحن الخلايا، وهضم البروتينات، وتجزئة الببتيدات، وإثراء الببتيدات المفسفرة باستخدام كروماتوغرافيا الألفة للمعادن المثبتة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على الفسفرة والتحقق من pH المحاليل المنظمة.هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

quantitative-phosphoproteomics-fatty-acid-stimulated-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن هنا وصف تقنية جديدة لتحديد كمية البروتينات البروتين في المجمعات الجعوية السكيراء. في هذه الدراسة ، وقد استخدمنا أسلوب SILAC مع تنقية تقارب تليها بالترادف الطيف الكتلي لتحديد نوعية عالية مع الشركاء ملزمة للبروتين ER ، Scs2p.

تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

نحن تصف طريقة جديدة lipidomics كمي لتحديد الأنواع الدهنية عديدة في الخميرة باستخدام المسح المسح الشامل التأين مطياف electrospray (ESI / MS). هذا الأسلوب يتجاوز حاليا الأساليب المتاحة لتحديد وتقدير الدهون في القدرة على حل مختلف أشكال الجزيئية من الدهون ، والحساسية ، والسرعة.

والتقييم الكمي لاستخدام الطيف Lipidome الخميرة Electrospray قداس التأين

يتم عرض طريقتين التكميلية على أساس التدفق الخلوي والمجهري الذي تمكن من القياس الكمي، على مستوى خلية واحدة، لديناميات التعبير الجيني الناجم عن تفعيل مسار MAPK في الخميرة.

الكمي الزمانية التعبير MAPK المستحثة في خلايا الخميرة واحدة

تصف هذه المقالة مقايسة قائمة على نمو الخميرة لتحديد المتطلبات الجينية لتحلل البروتين. كما يوضح طريقة للاستخراج السريع لبروتينات الخميرة ، وهي مناسبة للنشاف الغربي لتأكيد متطلبات التحلل كيميائيا حيويا. يمكن تكييف هذه التقنيات لمراقبة تدهور مجموعة متنوعة من البروتينات.

تحديد القائم على النمو وتأكيد البيوكيميائية من متطلبات الوراثية للتدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

العديد من الليباز (الفوسفو) المتوقعة سيئة الوصف فيما يتعلق بخصوصيات الركيزة والوظائف الفسيولوجية. نقدم هنا بروتوكولا لتحسين أنشطة الإنزيم ، والبحث عن ركائز طبيعية ، واقتراح وظائف فسيولوجية لهذه الإنزيمات.

تحديد الركيزة الخصوصيات لالليباز وفسفوليباز المرشحين

ويصف هذا البروتوكول إجراء لاستخراج وإثراء فوسفوبيبتيديس من خطوط خلايا سرطان البروستاتا أو الأنسجة لإجراء تحليل فوسفوبروتيومي عبر البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي.

تخصيب فوسفوبيبتيدي مقترنة بكمية خالية من تسمية الطيف الكتلي للتحقيق في فوسفوبروتيومي في سرطان البروستاتا

نقدم بروتوكولا باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب لتحديد وقياس الدهون الخلوية الرئيسية في saccharomyces cerevisiae. الطريقة الموصوفة للتقييم الكمي لفئات الدهون الرئيسية داخل خلية الخميرة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة.

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

قدمت هنا هو نهج phosphoproteomic، وهي وقف والذهاب تلميح استخراج القائمة على phosphoproteomic، الذي يوفر إنتاجية عالية وتغطية عميقة من phosphoproteome Arabidopsis. يحدد هذا النهج نظرة عامة على إشارات الإجهاد التناضح في Arabidopsis.

استراتيجية phosphoproteomic لتوصيف الإشارات الإجهاد التناضح في arabidopsis

نقدم بروتوكول لتحديد وكمية الفئات الرئيسية من الأيض للذوبان في الماء في الخميرة Saccharomyces cerevisiae. الطريقة الموصوفة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة. فإنه يسمح فصل ايزومرات الهيكلية وأشكال ستيريويسوميريك من الأيض للذوبان في الماء من بعضها البعض.

الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

هنا، يتم تقديم بروتوكول لتسمية الأيض من الخميرة مع 14حمض الخليك C، الذي يقترن كروماتوغرافيا طبقة رقيقة لفصل الدهون محايدة.

تحليل توليف الدهون المحايدة في Saccharomyces cerevisiae بواسطة وضع العلامات الأيضية وكروماتوغرافيا طبقة رقيقة

هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخدام ركائز الخميرة المعروضة على سطح الخميرة لمقايسات التعديل الأنزيمي. تم عرض المنصة باستخدام تحليل نشاط إزالة الفسفرة من التيروزين فوسفاتيز SHP-2 ضد إحدى ركائزها كمقايسة تعديل إنزيمي تمثيلي.

التعديل الأنزيمي وتقييم قياس التدفق الخلوي للبروتينات المعروضة على سطح الخميرة

تعلم طريقة فوسفوبروتوميكس كمية لدراسة آليات الإشارة الخلوية في خميرة السكيراء الجعوية. تستخدم هذه التقنية مطيافية الكتلة لتحليل الببتيدات الفوسفوريلية المُستخرجة بدقة عالية.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية

استكشف المزيد من الفيديوهات