حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية

الفسفرة هي آلية إشارات خلوية رئيسية تحكم العمليات من توطين البروتين إلى نسخ الحمض النووي ، وتعد دراسة الفوسفو وحده عن طريق قياس الطيف الكتلي تقدما جديدا مثيرا في دراسة كل من الإشارات والبروتينات. تكمن الخلايا ذات العلامات التفاضلية عن طريق التحلل في مطحنة الكرة ، ثم يتم تقليلها وخلطها وهضمها. يتم تجزئة الببتيدات المهضومة عن طريق كروماتوغرافيا التفاعل المحبة للماء وببتيدات الفوسفو المخصبة من الكسور عن طريق تخصيب iMac.

ثم يتم تحديد الكسور المخصبة بببتيد الفوسفو بواسطة msm. السيدة مرحبا ، أنا رامزي سيلين من المجموعة E في معهد بيولوجيا المثابرة. سنعرض لكم اليوم إجراء لاستخراج ببتيدات الفوسفو المصنفة أيضيا.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة بروتين الحفرة كميا. لذلك دعونا نبدأ. يبدأ هذا الإجراء بزراعة خلايا الخميرة الخفيفة والثقيلة نظيريا.

قم أولا بتلقيح 100 مل من الوسائط الغنية بمستعمرة واحدة من خلايا الخميرة. قم بتنمية هذه الثقافة بين عشية وضحاها إلى OD 600 من 1.0. ثم استخدمه لزرع مزرعتين سعة لتر واحد من الحد الأدنى من الوسط الذي يحتوي على مجموعة كاملة من الأحماض الأمينية ومكملة ب 20 ملليغرام لكل لتر من النظائر.

الأرجينين والليسين الثقيل العادي أو النظيري ينمو على حد سواء ثقافات لتر واحد لمدة 18 ساعة إلى OD 600 من 1.8. من الأهمية بمكان أن تمر الخلايا بتسعة أجيال على الأقل لتحقيق الدمج الكامل للنظائر المصنفة. عندما تقوم الخلايا بدمج أجهزة الطرد المركزي النظيرية المسماة بالكامل ، فإن الخلايا التي نمت في الوسائط مع الأرجينين الطبيعي والليسين بشكل نظائي.

للحصول على حبيبات الخلية, اغسل الحبيبات بالماء المعقم في وسط يحتوي على أوليات مع النظائر, الأرجينين العادي والليسين وتحفز لمدة 85 دقيقة. ينتج عن هذا عينة محفزة من أوليات خفيفة نظيرية. لا يتم تحفيز الثقافة الأخرى المزروعة في الوسائط مع الأرجينين والليسين الثقيل نظيريا مع الأولات وستكون بمثابة عينة مرجعية مزروعة بالجلوكوز الثقيل نظائريا.

لجمع لتر واحد ، يتم توزيع الثقافة بين أربع زجاجات طرد مركزي سعة 250 مل. بعد تجميع خلايا الطرد المركزي في أنبوب واحد عن طريق إزالة أو ولكن 100 ملليلتر من الوسائط Resus تعليق الخلايا ونقلها إلى الأنبوب التالي. في النهاية ، يتم جمع حبيبات كبيرة واحدة في جهاز طرد مركزي أحادي الأنبوب لمدة ثلاث دقائق عند 4 ، 000 دورة في الدقيقة.

بعد إزالة الوسائط ، تتم مقارنة زجاجة الطرد المركزي ووزن الحبيبات بزجاجة طرد مركزي فارغة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الوسائط وشفط السائل الزائد من الزجاجات ، وقم بوزن الكريات ويكون العائد النموذجي بين جرام إلى جرامين. بعد ذلك ، تجميد الفلاش تضيف الكريات الموجودة في النيتروجين السائل عازلة طحن تحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتيز إلى الكريات.

يجب أن يكون حجم مخزن الطحن المضاف معادلا لوزن الحبيبات. قم بتجميد وعاء الطحن في النيتروجين السائل. عندما يتوقف النيتروجين السائل عن الغليان.

استخدم لوح الكتف لتقطيع الحبيبات ونقلها إلى وعاء الطحن الذي يحتوي على محامل كروية مجمدة. طحن الكريات في 600 دورة في الدقيقة مع دقيقة واحدة 22 دورة مع عكس الاتجاه لمدة ثلاث دقائق. أعد تجميد وعاء الطحن في النيتروجين السائل.

كرر الطحن أربع مرات أخرى لمدة 15 دقيقة. وقت الطحن عند اكتمال الطحن لكلتا العينتين. اجمع تاريخ الطحن المجمد في أنابيب صقر سعة 50 مليلتر واحتفظ به مجمدا إما في النيتروجين السائل أو في الثلج الجاف.

قم بتخزين تاريخ الطحن على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يصبح جاهزا للاستخدام. يبدأ عزل الببتيدات وتجزئتها بالألكلة. الخطوة الأولى هي إذابة العينة في محلول اليوريا.

قم بإحضار كل تاريخ طحن إلى محلول عن طريق إضافة ثلاثة أحجام من مخزن اليوريا إلى حجم واحد من تاريخ الطحن المجمد. على سبيل المثال ، تتم إضافة ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت RIA إلى حبيبات جرام واحد. مع مليلتر واحد من المخزن المؤقت PBS.

صوتنة الخليط على الفور مع المسبار. نصيحة صوتي. احتفظ بالطرف بالقرب من قاع الأنبوب لمنع رغوة المحلول.

يجب أن يدخل تاريخ الطحن على الفور في الحل. قم بمسح المحللات عن طريق الطرد المركزي عند 6 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. عند أربع درجات مئوية ، انقل السوبينات إلى أنابيب جديدة.

لبدء تفاعل الاختزال ، أضف 0.5 مولار تريس طازجا ، أو اثنين من الكربوكسيل ليتال فوسفين أو TCEP إلى كل عينة بتخفيف واحد إلى 100. لتحقيق تركيز TCEP نهائي يبلغ خمسة ملليمولات ، احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد حضانة 37 درجة مئوية ، اترك العينات تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.

ثم أضف أسيتاميد مولار محضر طازجا إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ملليمولار يحتضن في الظلام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، قم بإخماد أسيتاميد iota باستخدام 20 مللي مولار DTT. اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

المحللات المخفضة والمؤلكلة جاهزة الآن للهضم التريبسين. في هذه المرحلة ، يمكن استخدام عينات من المحللات لتحليل صفحة SDS للقياس الكمي للبروتين للتحقق من تحلل الخلية وتحليل قياس الطيف الكتلي للتحقق من صحة دمج النظائر الثقيلة. لبدء التريبسفي الهضم ، امزج كميات مكافئة من العينات الثقيلة والخفيفة نظيريا.

خفف العينة واحدا من كل أربعة ب 20٪ ميثانول وأضف التربسين عند تخفيف واحد في 200. احتضان العينة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي. بعد التحقق من الهضم الكامل عن طريق صفحة SDS وتلوين kumasi ، جفف العينة في فراغ سريع عندما تكون العينة جافة.

عند 200 ميكرولتر من الماء المقطر المصفى والدوامة حتى تدخل الحبيبات في المحلول. جفف العينة في فراغ سريع وأعد تعليقها مرة أخرى بالماء المقطر بعد تجفيف العينة ، مرة أخرى ، قم بإعادة تعليق الحبيبات في 0.1٪ حمض الخليك ثلاثي الفلور أو TFA ، تحقق من أن الرقم الهيدروجيني حوالي ثلاثة باستخدام شرائط الأس الهيدروجيني إذا لزم الأمر. تحمض مع 10٪ TFA بيليه من أي رواسب.

سيتم الآن تحلية العينة المهضومة باستخدام عبوة مجموعة مياه VAC 500 ملليغرام C 18 عمود. للبدء ، قم بترطيب العمود بخمسة ملليلتر ، وجهاز طرد مركزي أسيتو نتريل 100٪ عند حوالي 200 مرة G أو الحد الأدنى من السرعة المطلوبة للتدفق عبر العمود. بعد ذلك ، قم بموازنة العمود بخمسة ملليلتر ، 0.1٪ TFA قم بتحميل العينة.

احرص على عدم التحميل الزائد على العمود وإذا لزم الأمر ، قسم العينة بين أعمدة متعددة. اجمع التدفق في حاوية نفايات وقم بتحميل العمود مرة أخرى إذا لزم الأمر ، واغسله بخمسة ملليلتر ، 0.1٪ TFA. كرر هذا الغسيل مع ملليلترين من 60٪ Aceto Nitrile 0.1٪ TFA EEU يجب جمعها عن طريق الطرد المركزي.

جفف العينة في فراغ سريع ، وأعد تعليق العينة المجففة في 200 ميكرولتر من المذيب B. العينة المعلقة جاهزة الآن لتجزئة الببتيد. قم بتجزئة الببتيدات على عمود تحليلي لجل TSK AMIDE 80 باستخدام عمود واقي. خذ وقتك بخطوة.

قم بتشغيل العمود لمدة ساعتين عند 90٪ مذيب A ثم قم بتشغيل تدرجات فارغة قبل تحميل العينة. عادة لا نقوم بتحميل أكثر من خمسة ملليغرامات في كل شوط على عمود بهذا الحجم ، كروماتوغرافيا سائلة حديثة وحتى غير حديثة. ستسمح الآلات بتدفق جمع كسور حقن العينة الآلي ، والتحكم في المعدل ، وخلطات التدرج.

يتم تعيينها في بداية التشغيل كما هو موضح. قم بالتحميل في 90٪ A على مدار 20 دقيقة ، و 90٪ A إلى 85٪ A على مدار خمس دقائق ، و 85٪ A إلى 60٪ A على مدار 40 دقيقة ، و 60٪ A إلى 0٪ على مدى خمس دقائق و 0٪ A إلى 90٪ على مدى خمس دقائق. اضبط معدل التدفق على ملليلتر واحد في الدقيقة واجمع الكسور على فترات دقيقتين.

بدءا من 85٪ A إلى 60٪ A ، من المحتمل أن تؤدي الكسور المدمجة للتدرج لتقليل عدد الكسور إلى 10 كسور متزايدة إلى تغطية أكبر لبروتين الفوسفو. يتم إثراء ببتيدات الفوسفو بواسطة كروماتوغرافيا معدنية ثابتة. نستخدم جل تقارب الحديد phos select كراتنج iMac.

أولا Resus يعلق الكريات في 500 ميكرولتر من محلول التحميل. بعد ذلك ، أضف 15 ميكرولترا من الملاط بنسبة 50٪ إلى كل جزء واحتضن العينات لمدة 30 دقيقة مع دوران نهائي. حافظ على التدفق للتحليل.

اغسل العينة ثلاث مرات بمحلول التحميل ومرة واحدة ب 500 ميكرولتر من الماء المقطر المصفى بعد الغسيل ، قم بمسح الببتيدات لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق باستخدام 400 ميكرولتر من 50 ملليمولار من محلول فوسفات الصوديوم. انقل الببتيدات المملوءة إلى قارورة زجاجية. أضف خمسة ميكرولترات ، حمض الفورميك بنسبة 100٪ إلى الببتيدات لتحمضها إلى درجة الحموضة ثلاثة ببتيدات فوسفو معلقة في 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA وتحلية مرة أخرى باستخدام عمود C 18 كما هو موضح سابقا ، وجفف العينات المشار إليها في فراغ سريع.

أخيرا ، قم بإعادة تعليق ببتيدات الفوسفو في 20 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪. العينات جاهزة الآن للتحليل الكمي بواسطة قياس الطيف الكتلي. يظهر هنا أثر رسومي لوني من تجزئة الببتيدات الخلوية الكلية باستخدام كروماتوغرافيا H-I-L-I-C.

يمكن ملاحظة ذلك في هذا الأثر أنه بينما توجد ببتيدات الفوسفو في جميع أنحاء المظهر الجانبي الإلوسياني ، يتم الاحتفاظ بالجزء الأكبر من المخلفات الفسفرية حتى بالقرب من نهاية المظهر الجانبي الإلوسي. لقد أوضحنا لك للتو كيفية طحن الخلايا ، وهضم البروتينات ، وكسر الببتيدات أ ، وإثراء ببتيدات الفوسفو باستخدام كروماتوغرافيا تقارب المعادن المجمدة. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على الفسفرة والتحقق من محاليل البيرة الخاصة بالأس الهيدروجيني.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.