نضوب بالسكان خلية معينة من قبل استنفاد تكملة

استنفاد المكملات هو طريقة سريعة وفعالة وغير مكلفة لتنقية مجموعات الخلايا المناعية. يبدأ استنفاد المكمل عند إضافة الأجسام المضادة أحادية النسيلة IGM أو IgG إلى مجموعة الخلايا ، والتي تستهدف نوعا معينا من الخلايا. في هذا المثال، سنستهدف الخلايا التائية للنضوب.

ثم تتم إضافة النظام التكميلي لبدء سلسلة محللة للبروتين ، مما يؤدي إلى موت الخلايا التائية. ثم يتم غسل الخلايا بجهاز الطرد المركزي وتصفيتها للتخلص من الخلايا الميتة والحطام. عادة ما تؤدي طريقة استنفاد المكملات هذه إلى القضاء على 95 إلى 100٪ من مجموعة الخلايا المستهدفة.

مرحبا ، أنا بوني ديتل. أنا باحث في معهد أبحاث الدم في مركز ويسكونسن الموجود في ميلووكي. سأريكم اليوم تقنية استنفاد المكملات ، وهي طريقة سريعة وغير مكلفة لاستنفاد مجموعات خلايا معينة.

نستخدم هذه التقنية في مختبري لإثراء مجموعات الخلايا المناعية التي نستخدمها بعد ذلك في عدد من المقايسات الحيوية ، بما في ذلك تلك التي تنطوي على تنشيط الخلية وتحليل تعبير البروتين. لذلك دعونا نبدأ. قبل البدء في التجربة ، قم بإعداد 0.5 أو 1 مليلتر من مكمل الأرانب وتخزينها في فريزر ناقص 20 أو 80 درجة تحت الصفر.

تأكد من معايرة المكمل إلى تخفيف مثالي بين واحد إلى 10 وواحد إلى 20. مصدر تجاري ممتاز للمكملات التي نستخدمها بشكل روتيني هو من بيولوجيات Pereze لهذا الإجراء ، والأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر والراب فعالة بشكل عام في تنشيط المكمل ، ولكن لن تكون جميع الأجسام المضادة مناسبة. الأجسام المضادة IgM هي الأكثر كفاءة بشكل عام لتحلل الخلايا المستحثة بشكل مكمل.

الأجسام المضادة IgG هي ثاني أكثر الأجسام كفاءة وتستخدم عادة لأن معظم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة هي IgG تقم بمعايرة كل جسم مضاد للاستخدام الأمثل في كثافة خلية من 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر ، والتي يتم تحديدها تجريبيا. تستخدم معظم الأجسام المضادة في حدود 0.1 إلى 10 ميكروغرام لكل ملليلتر. من أجل استنفاد الخلايا التائية الطحالية ، نستخدم جسما مضادا أحادي النسيلة خاصا ب TH.

لبدء استنفاد المكملات ، قم بتخفيف الخلايا في وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على 5٪ مصل عجل الجنين المعطل بالحرارة بحيث يكون عدد الخلايا الأولية مرتين في 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر. على سبيل المثال ، يجب تخفيف خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السابعة في 2.5 مل من المتوسط. هذا الحجم من الخلايا هو نصف الحجم النهائي ، وبالتالي ضعف تركيز الخلايا المستخدمة أثناء النضوب ، والذي سيكون واحدا في 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر.

في هذا الوقت ، وفر ما يصل إلى واحد في 10 للخلايا الست بحيث يمكن قياس النضوب في نهاية التجربة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإذابة الكمية المطلوبة من المكمل في درجة حرارة الغرفة. لقد وجدنا أن التخفيف من واحد إلى 15 مناسب عند استخدام مكمل الأرانب البيولوجية pereze لخمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السبع ، 1.5 ملليلتر Eloqua المجمدة كافية.

أضف الآن الكمية المناسبة من الجسم المضاد إلى تعليق الخلية واخلطها. من أجل تعقيم المكمل ، استخدم مرشح طرف حقنة منخفض البروتين. املأ المحقنة بواحد إلى ملليلترين من المتوسط.

قبل إضافة المكمل لخمسة في 10 إلى الخلايا السبع ، سنحتاج إلى 340 مل من المكمل للتخفيف من واحد إلى 15. ثم قم بتصفية المكمل مباشرة في الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا والجسم المضاد. الآن اضبط الحجم النهائي في الأنبوب بحيث تكون الخلايا بتركيز واحد في 10 أس الخلايا السابعة لكل مليلتر.

بعد ذلك ، اسمح للخلايا بالتحتضن عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة ساعة واحدة. تذكر أن تخلط الخلايا كل 15 دقيقة عن طريق الانعكاس اللطيف. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة لن تؤثر على الجدوى.

ثم عد إلى غطاء المحرك ، وتخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين ب 10 مل من المتوسط. لاحظ كيف يتجمع حطام الخلية مع التصاق البعض بجوانب أنابيب البوليسترين.

بعد الغسيل الأخير ، قم بتصفية الخلايا من خلال مجفف خلايا نايلون معقم 70 ميكرون. أخيرا ، تحقق من نقاء الخلية. من خلال مقارنة عدد الخلايا محل الاهتمام قبل وبعد تدفق النضوب.

القياس الخلوي والكيمياء المناعية من الطرق المفضلة المستخدمة لتحديد نقاء الخلية قبل التجريب. عند استخدام جسم مضاد أحادي النسيلة عالي الكفاءة في تنشيط المكمل ، فإن الجولة الأولى من استنفاد المكملات ستؤدي إلى استنفاد الخلايا بأكثر من 95٪ على سبيل المثال ، باستخدام قياس التدفق الخلوي لقياس النسبة المئوية لخلايا ألفا بيتا التائية في تحضير خلية الفأر ، وجدنا أنها تحتوي على 32.2٪ من خلية ألفا بيتا التائية بعد استنفاد المكمل مع مضاد خمسة واحد ، والتي يتم التعبير عنها بواسطة جميع الخلايا التائية ، ولكن ليس بواسطة الكريات البيض الأخرى. تم تخفيض مجموعة بيتا TCR بنسبة 95٪ إلى تركيز نهائي قدره 1.56٪ مرسلة.

لقد أوضحت لك للتو طريقة سريعة وفعالة لاستنفاد مجموعات خلايا معينة باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد في استنفاد المكملات. عند القيام بهذا الإجراء ، تذكر اختبار كل جسم مضاد للتأكد من فعاليته ومعايرة المكمل الخاص بك في تجربة تجريبية قبل أن تبدأ. هذا هو.

شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.