نضوب بالسكان خلية معينة من قبل استنفاد تكملة

يعد استنفاد المتممة طريقة سريعة وفعالة وغير مكلفة لتنقية مجموعات الخلايا المناعية. يبدأ استنفاد المتممة عند إضافة أجسام مضادة أحادية النسيلة من نوع IGM أو IgG إلى مجموعة خلوية، حيث تستهدف هذه الأجسام نوعاً محدداً من الخلايا. في هذا المثال، سنستهدف الخلايا التائية (T-cells) لغرض الاستنفاد.

تتم بعد ذلك إضافة النظام المتمم لتحفيز سلسلة من التفاعلات التحللية البروتينية، مما يؤدي إلى موت الخلايا التائية. ثم يتم غسل مجتمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي وترشيحه للتخلص من الخلايا الميتة والحطام الخلوي. وعادةً ما تؤدي طريقة الاستنزاف المتمم هذه إلى التخلص من 95 إلى 100% من مجتمع الخلايا المستهدف.

مرحباً، أنا بوني ديتل، باحثة في معهد أبحاث الدم في مركز الدم في ويسكونسن بمدينة ميلووكي. سأعرض لكم اليوم تقنية استنزاف المتممة، وهي طريقة سريعة وغير مكلفة لاستنزاف مجموعات خلوية محددة.

نستخدم هذه التقنية في مختبري لإثراء مجموعات الخلايا المناعية بشكل كبير، والتي نستخدمها لاحقاً في عدد من المقايسات الحيوية، بما في ذلك تلك التي تتضمن تنشيط الخلايا وتحليل التعبير البروتيني. لذا، لنبدأ العمل. قبل البدء في التجربة، قم بتحضير حصص قدرها 0.5 أو 1 mL من المتممة الأرنبية (rabbit complement) واحفظها في مجمد عند درجة حرارة -20 أو -80 °C.

تأكد من معايرة المتمم للوصول إلى تخفيف أمثل يتراوح بين 1 إلى 10 و1 إلى 20. أحد المصادر التجارية الممتازة للمتمم التي نستخدمها بشكل روتيني في هذا الإجراء هي Pereze biologicals؛ وبشكل عام، تكون الأجسام المضادة أحادية النسيلة للفئران والأرانب فعالة في تنشيط المتمم، ولكن ليست كل الأجسام المضادة ستكون مناسبة. وتعد الأجسام المضادة من نوع IgM هي الأكثر كفاءة عموماً في تحلل الخلايا الناجم عن المتمم.

تُعد أجسام IgG المضادة هي الأكثر كفاءة في المرتبة الثانية، وعادةً ما تُستخدم لأن معظم الأجسام المضادة أحادية النسيلة من نوع IgG؛ لذا يتم معايرة كل جسم مضاد لتحقيق الاستخدام الأمثل عند كثافة خلوية تبلغ 10⁷ خلية/مل، والتي يتم تحديدها تجريبياً. وتُستخدم معظم الأجسام المضادة في نطاق يتراوح بين 0.1 إلى 10 µg/mL. أما لاستنفاد الخلايا التائية الطحالية، فإننا نستخدم جسماً مضاداً أحادي النسيلة متخصصاً لـ TH1.

لبدء عملية استنزاف المتممة، قم بتخفيف الخلايا في وسط زراعة خلايا يحتوي على 5% من مصل العجل الجنيني المعطل حرارياً، بحيث يكون تعداد الخلايا الأولي 2 × 10⁷ خلية/ملل. على سبيل المثال، يجب تخفيف 5 × 10⁷ خلية في 2.5 ملل من الوسط. يمثل هذا الحجم من الخلايا نصف الحجم النهائي، وبالتالي فهو ضعف تركيز الخلايا المستخدم أثناء الاستنزاف، والذي سيكون 1 × 10⁷ خلية/ملل.

في هذه المرحلة، يتم حفظ ما يصل إلى 1×10⁶ من الخلايا لتمكين قياس كمية النضوب في نهاية التجربة. بالإضافة إلى ذلك، يتم إذابة الكمية المطلوبة من المتممة في درجة حرارة الغرفة. وقد وجدنا أن التخفيف بنسبة 1 إلى 15 يكون مناسباً عند استخدام Pereze Biologicals rabbit complement لـ 5×10⁷ خلية، وتكفي كمية 1.5 milliliter من Eloqua المجمدة.

أضف الآن الكمية المناسبة من الجسم المضاد إلى معلق الخلايا واخلطهما. ومن أجل تعقيم المتممة، استخدم مرشح طرف حقنة منخفض الارتباط بالبروتين. املأ الحقنة بـ 1 إلى 2 ملي لتر من الوسط.

قبل إضافة المتممة إلى خمسة × 10⁷ خلية، سنحتاج إلى 340 ملليلتر من المتممة لتحقيق تخفيف بنسبة 1 إلى 15. بعد ذلك، قم بترشيح المتممة مباشرة في الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا والأجسام المضادة. الآن، اضبط الحجم النهائي في الأنبوب بحيث يكون تركيز الخلايا 1 × 10⁷ خلية/ملليلتر.

بعد ذلك، اترك الخلايا لتحضن عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة ساعة واحدة. تذكر خلط الخلايا كل 15 دقيقة عن طريق القلب اللطيف. بعد التحضين، قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة لا تؤثر على الحيوية.

بعد ذلك، قم بالتخلص من السائل الطافي داخل كبينة التدفق الصفحي. بعد ذلك، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 10 milliliters من الوسط الغذائي. لاحظ كيف تتجمع بقايا الخلايا مع التصاق بعضها بجوانب أنابيب البوليسترين.

بعد الغسلة الأخيرة، قم بترشيح الخلايا عبر مصفاة خلايا نايلونية معقمة بمسامية 70 ميكرون. وأخيرًا، تحقق من نقاء الخلايا، وذلك من خلال مقارنة مجموعة الخلايا المستهدفة قبل وبعد عملية الاستنزاف التدفقي.

تعد قياس التدفق الخلوي والكيمياء النسيجية المناعية من الطرق المفضلة المستخدمة لتحديد نقاء الخلايا قبل البدء بالتجربة. عند استخدام جسم مضاد أحادي النسيلة فعال للغاية في تنشيط المتممة، فإن الجولة الأولى من استنزاف المتممة ستؤدي إلى استنزاف الخلايا بنسبة تزيد عن 95%. على سبيل المثال، عند استخدام قياس التدفق الخلوي لقياس النسبة المئوية لخلايا alpha beta T في تحضير خلايا من طحال فأر، وجدنا أنها احتوت على 32.2% من خلايا alpha beta T بعد استنزاف المتممة باستخدام anti five one، والذي يتم التعبير عنه بواسطة جميع خلايا T، ولكن ليس بواسطة الكريات البيضاء الأخرى. وقد انخفض تعداد TCR beta بنسبة 95% ليصل إلى تركيز نهائي قدره 1.56%.

لقد عرضتُ لكم للتو طريقة سريعة وفعالة لاستنفاد مجموعات خلوية محددة باستخدام أجسام مضادة متخصصة للمستضد في عملية استنفاد المتممة. عند إجراء هذا البروتوكول، تذكر اختبار فعالية كل جسم مضاد ومعايرة المتممة في تجربة استطلاعية قبل البدء. هذا كل شيء.

شكراً لمشاهدتكم، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.