عزل خلايا فأر التجويف البريتوني
يناير 28, 2010
التجويف البريتوني في الثدييات يحتوي على مجموعات سكانية مختلفة عن الخلايا المناعية حاسمة الاستجابات المناعية الفطرية. مطلوب وسيلة فعالة لعزلة التحليلات الكيميائية الحيوية والوظيفية لهذه الخلايا. هنا نقدم وسيلة شاملة لعزل الخلايا التجويف البريتوني في الماوس.
تبدأ عملية عزل خلايا التجويف البريتوني بتثبيت فأر تم تخديره حتى الموت على ظهره. يتم قص الجلد الخارجي للبريتون وسحبه برفق للكشف عن الجلد الداخلي، ثم يُحقن PBS مع 3% FBS في التجويف البريتوني، ويتم تدليك البريتون بلطف. بعد ذلك، يتم جمع السائل الذي يحتوي على الخلايا البريتونية ووضعه في أنبوب سعة 15 milliliter على الثلج.
تُغسل الخلايا مرة واحدة ثم تُعد باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). مرحباً، أنا أوجي من مختبر الدكتور بون في معهد أبحاث الدم بمركز الدم في ويسكونسن. سنعرض لكم اليوم إجراءً لعزل الخلايا من التجويف البريتوني للفأر.
نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا للحصول على خلايا لإجراء تحاليل نمطية وبيوكيميائية ومناعية متنوعة. ينصب اهتمامنا بشكل أساسي على مجموعات خلايا B البريتونية. لذا، فلنبدأ.
قبل البدء في عزل الخلايا المناعية من التجويف الصفاقي، قم بتجهيز جميع المواد اللازمة. ابدأ بتجميع دلو ثلج، ومحقنة سعة خمسة مليلتر مع إبرة قياس 27، ومحقنة سعة خمسة مليلتر مع إبرة قياس 25، وكتلة من الفلين (ستيروفوم)، ودبابيس لتثبيت الفأر. كما يجب تجهيز صينية لحمل كتلة التثبيت، ومقص وملاقط وأنابيب تجميع قبل البدء في عملية التشريح.
قم بتبريد محلول PBS الذي يحتوي على 3% fetal calf serum مسبقاً. احتفظ بهذا المحلول وأنابيب الجمع على الثلج طوال فترة التجربة. بعد إعطاء المخدر والقتل الرحيم المناسب، رش الفأر بـ 70% ethanol وثبته على ظهره فوق كتلة من البوليسترين أو لوحة تشريح. باستخدام الملقط والمقص، قم بقص الجلد الخارجي للبريتون.
اسحب الجلد برفق للكشف عن الجلد الداخلي الذي يبطن التجويف البريتوني. مع الحرص على عدم ثقب أي من الأعضاء، ادفع ببطء إبرة قياس 27 في البريتون. احقن 5 mL من محلول PBS المبرد بالثلج في التجويف البريتوني.
الآن، قم بتدليك الصفاق بلطف لتحفيز الخلايا على الانفصال عن جدار الصفاق والسقوط في محلول PBS. بعد ذلك، قم بتجهيز سرنجة سعة 5 مل بـإبرة مقاس 25 gauge بحيث تكون فتحة الإبرة متجهة للأعلى، ثم أدخل الإبرة في الصفاق. اجمع أكبر قدر ممكن من السائل لزيادة عدد الخلايا المستخلصة.
أثناء القيام بذلك، حرك الطرف برفق لمنع الأنسجة الدهنية أو الأعضاء الأخرى من سد الإبرة. قم بإزالة الإبرة وتفريغ معلق الخلايا في أنابيب تجميع من البولي بروبيلين. اجمع السوائل المتبقية من التجويف عن طريق إجراء شق في الجلد الداخلي للبريتون.
استخدم الملقط لإبعاد الجلد أثناء استخدام ماصة خلفية بلاستيكية لجمع أي سائل متبقٍ. وأخيرًا، قم بطرد مركّز معلق الخلايا لمدة ثماني دقائق بسرعة 1500 RPM، وتخلص من supernatant وأعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من PBS. عد الخلايا باستخدام hemo cytometer.
سيتيح استخدام استبعاد صبغة trippen blue تحديد أعداد الخلايا. عادةً ما يمكن عزل من خمسة إلى 10 ملايين خلية من التجويف البريتوني لفأر لم يتم إجراء أي تلاعب به. وستشكل خلايا B نسبة 50 إلى 60% من إجمالي تعداد الخلايا.
سيكون حوالي 40% من الخلايا عبارة عن بلاعم وخلايا حبيبية، ومن 5 إلى 10% ستكون خلايا T. لقد عرضنا لكم للتو كيفية عزل خلايا التجويف البريتوني من الفأر. عند استخدام هذا الإجراء، من المهم الحد من كمية الدم في مجتمع خلايا التجويف البريتوني عن طريق القتل الرحيم للفئران بعناية وعدم ثقب أي أعضاء في التجويف البريتوني.
تأكد من التخلص من أي عينات تتلوث بالدم. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة مفصلة لعزل خلايا التجويف البريتوني من الفئران، وهو أمر ضروري لدراسة الاستجابات المناعية. وقد صُمم هذا الإجراء لضمان سلامة المجموعات الخلوية من أجل التحليلات اللاحقة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
- الكيمياء الحيوية
خلفية علمية
- يحتوي التجويف البريتوني على أنواع مختلفة من الخلايا المناعية.
- تلعب هذه الخلايا دوراً حيوياً في الاستجابات المناعية الفطرية.
- تعد طرق العزل ضرورية للدراسات الوظيفية والكيميائية الحيوية.
- يمكن أن يساعد فهم هذه الخلايا في البحوث المناعية.
الغرض من الدراسة
- توفير طريقة موثوقة لعزل خلايا التجويف البريتوني.
- تسهيل دراسة مجموعات الخلايا المناعية في الفئران.
- تعزيز دقة المقاييس المناعية اللاحقة.
الطرق المستخدمة
- قتل الفأر رحمةً والتحضير للتشريح.
- حقن محلول PBS مع 3% FBS في التجويف البريتوني.
- جمع السائل الذي يحتوي على الخلايا البريتونية.
- طرد مركزي للخلايا المعزولة وعدّها.
النتائج الرئيسية
- عزل من 5 إلى 10 ملايين خلية من التجويف البريتوني بنجاح.
- تحديد أن 50-60% من الخلايا هي خلايا B.
- حوالي 40% هي خلايا بلعمية وخلايا محببة.
- من 5 إلى 10% من الخلايا هي خلايا T.
الاستنتاجات
- تعتبر هذه الطريقة فعالة لعزل الخلايا المناعية من التجويف البريتوني.
- يعد القتل الرحيم والتشريح الدقيقين أمرين حاسمين لتجنب التلوث بالدم.
- يمكن تطبيق هذا الإجراء في مختلف الدراسات المناعية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يتيح عزل الخلايا المناعية من التجويف البريتوني التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة من خلال توفير الوصول إلى مجموعات فرعية محددة ظاهرياً من الخلايا البائية والبلعمية. ويدعم ذلك تقليل المخاطر الميكانيكية في مسارات الاكتشاف عبر توفير مدخلات خلوية أولية قابلة للتكرار للمقايسات الوظيفية. كما تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في تحديد المركبات الرائدة من خلال الاسترداد المعياري للمجتمعات المناعية ذات الصلة بفحص الأدوية المعدلة للمناعة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استجواب المجموعات الفرعية من خلايا B1a وB1b لاختبار الفرضيات العلاجية في نماذج المناعة الذاتية والعدوى.
- القيمة العلمية: توفر بلعميات نسيجية مقيمة ساذجة لتوضيح المسارات في دراسات الاستجابة المناعية الفطرية.
- القيمة التشغيلية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال العزل المتسق لمجموعات الخلايا المناعية لفحص ارتباط الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة بيولوجية مصادق عليها للتحليل المظهري بواسطة قياس التدفق الخلوي والمقاييس البيوكيميائية.
- القيمة التشغيلية: ضمان توحيد المقاييس وقابلية تكرارها من خلال التحكم في حصيلة الخلايا (5–10 مليون خلية لكل فأر).
- القيمة التشغيلية: تمكين التقييم الموثوق للمركبات من خلال الاستعادة الكمية للخلايا البائية B cells (50–60%)، والبلعميات macrophages (40%)، والخلايا التائية T cells (5–10%).
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يدعم نمذجة الأنظمة ذات الصلة بالأمراض من خلال عزل خلايا B1 ذات التفاعل الذاتي والمجموعات الفرعية التنظيمية المنتجة لـ IL-10.
- القيمة التشغيلية: يسهل مواءمة المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال عزل خلايا B1 التي تفرز IgM الطبيعية.
- القيمة التشغيلية: يتيح الاستمرارية في الدراسات قبل السريرية من خلال توفير خلايا مناعية أولية للمتابعة الميكانيكية في نماذج الأمراض.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندمج هذه الطريقة في سير عمل الاكتشاف المبكر من خلال توفير خلايا مناعية أولية للتحقق من الهدف، وتطوير المقايسات، والدراسات الميكانيكية قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال عزل مجموعات محددة من الخلايا البائية والبلاعم.
- الفحص: تحقق الجاهزية للمقايسات عبر عزل الخلايا بشكل معياري واستعادة المجموعات المناعية القابلة للحياة.
- التحليلات: تتيح المقارنة الكمية للمجموعات الخلوية باستخدام العد بجهاز hemocytometer وطرق استبعاد الخلايا غير الحية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط مرحلة الاكتشاف بالتحقق قبل السريري من خلال عزل خلايا B1 المرتبطة بالمناعة الطبيعية والتنظيم.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس قدرة قابلة لإعادة الاستخدام لتوريد الخلايا المناعية عبر برامج اكتشاف المناعة وعلم الأورام.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: ثقة تنبؤية في التحقق من الهدف من خلال الوصول إلى مجموعات فرعية مناعية محددة ظاهرياً.
- القيمة التشغيلية: التوحيد القياسي وقابلية التكرار عبر تحديد حصيلة الخلايا وتوزيع المجموعات الفرعية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في فحص المعدلات المناعية.
- التأثير على المحفظة: تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال مدخلات خلوية أولية موثوقة للوحات المقايسة الوظيفية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تشريح الفئران والتقنيات التعقيمية لمنع ثقب الأعضاء وتلوث العينات بالدم.
- يعتمد على أدوات تشمل المحاقن، والإبر، وجهاز الطرد المركزي، ومقياس كرات الدم لغرض معالجة الخلايا وعدّها.
- يستلزم توحيد معايير تحضير PBS/FBS والتعامل مع سلسلة التبريد بين الفرق لضمان الاتساق.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند التطبيق على نماذج الأمراض التي تغير من تعداد الخلايا في التجويف البريتوني.
- يتقيد بضرورة إجراء القتل الرحيم والتشريح بدقة لتجنب التلوث بالدم، الذي من شأنه أن يؤثر على سلامة العينات.
