الفيروسة البطيئة الإنتاج

يبدأ هذا الإجراء بنقل 2 9 3 خلايا T مع ناقلات التعبئة والتغليف الفيروسي والبلازميد والفيروسية ، ويتم حصاد المادة الطافية الفيروسية بعد فترة حضانة مدتها 48 ساعة على الأقل. يتم ترشيح snat ليتم تركيزه باستخدام جهاز طرد مركزي فائق بعد الطرد المركزي الفائق. يتم إعادة تعليق الحبيبات الفيروسية باستخدام PBS للحصول على عيار الفيروس ، أولا تخفيف الفيروس المركز في وسائط كاملة ، ثم إجراء التخفيف التسلسلي لإصابة الخلايا بفيروس العدس.

مرحبا ، أنا شين وونغ من مختبر مايكل ماكمانوس في مركز السكري في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو. أنا مايكل مكمانوس. سنعرض لك اليوم إجراء لإنتاج فيروسات العدس.

نستخدم هذا الإجراء في المختبر لصنع فيروسات العدسات لتداخل الحمض النووي الريبي. لذلك دعونا نبدأ. لبدء هذا البروتوكول ، قم بإعداد الحمض النووي الذي يمكن من خلاله نقل خلايا 2 9 3 T.

أولا ، قم بتخفيف كاشف الجين FU السادس في أنبوب سعة 1.5 مليلتر عن طريق خلط 30 ميكرولتر من فوجي ستة مع 600 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل. احرص على عدم السماح لفوجي بلمس جانب الأنبوب أثناء توصيله إلى درجة حرارة الغرفة المتوسطة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، في غطاء الأنبوب ، امزج أربعة ميكروغرامات من البلازميد الفيروسي مع 1.33 ميكروغرام.

كل ناقلات تغليف فيروسية من الجيل الثالث. يحتوي البلازميد الفيروسي على الحمض النووي. سوف يدخل الفيروس في جينوم كل خلية تصيب بينما تحتوي نواقل العبوة على جينات لجميع البروتينات الأخرى المطلوبة لصنع فيروس العدس ، وإغلاق الغطاء وخلطه عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.

احتضان الحمض النووي وكاشف الإرسال لمدة 15 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حان الوقت الآن لنقل 2 9 3 خلايا باستخدام الحمض النووي الذي أعددته باستخدام الخلايا التي قمت بطلاءها قبل 24 ساعة والتي وصلت إلى 50 إلى 70٪ من الطلاقة المشتركة في ماصة غطاء المحرك لزراعة الأنسجة ، كل الحمض النووي المحضر على لوحة 2 9 3 ممزوجة برفق عن طريق إمالة اللوحة ذهابا وإيابا ، أعد الخلايا إلى الحاضنة واسمح للإنتاج الفيروسي بالاستمرار لمدة 48 إلى 96 ساعة قبل الحصاد. أثناء الحضانة ، تنتج الخلايا 2 9 3 فيروسات عدسية تحتوي جينوماتها على نسخة من الحمض النووي الريبي الخاص بك محل اهتمامك.

حان الوقت الآن لجمع الفيروس. أخرج خلاياك من الحاضنة. جهز في غطاء زراعة الأنسجة ، مرشح حقنة 0.4 أو خمسة ميكرون ، وحقنة 10 ملليلتر يمكن التخلص منها وأنبوب طرد مركزي UltraClear Beckman.

استخدم المحقنة التي تستخدم لمرة واحدة لإزالة المادة الطافية التي تحتوي الآن على الفيروس. قم بتوصيل مرشح حقنة 0.45 ميكرون بالطرف وقم بتصفية الفيروس في أنبوب الطرد المركزي UltraClear Beckman. يسمح المرشح للفيروسات فقط وليس الخلايا بالمرور قبل التخلص منها ، واحتضان جميع الخلايا المنتجة للفيروسات.

لوحات الاستزراع والمحاقن والمرشحات في مبيض 10٪ لمدة 45 دقيقة. الآن بعد أن جمعت الفيروس وقمت بتصفيته ، فقد حان الوقت لتركيز الفيروس عن طريق الطرد المركزي الفائق أولا. استخدم DMEM الخالي من المصل لموازنة جميع الأنابيب المحتوية على الفيروسات في حدود 0.2 جرام من بعضها البعض.

بعد ذلك ، قم بتحميل أنابيب الطرد المركزي المتوازنة في جرافات الدوار SW 41 TI أو SW 28. أغلق دلاء الدوار وأغلقها على الدوار. ثم ضع الدوار داخل جهاز الطرد المركزي الفائق.

قم بتدوير الفيروس لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية عند 25,000 دورة في الدقيقة في دوار SW 41 TI ، أو 24,000 دورة في الدقيقة في دوار SW 28. بعد الطرد المركزي ، ارجع إلى غطاء مزرعة الأنسجة واقلب الأنبوب لصب SNAT في وعاء يحتوي على 10٪ مبيض. استخدم مناديل كيم لامتصاص السائل الزائد حول الحبيبات وقلب الأنبوب في رف مناسب لمدة لا تزيد عن خمس دقائق حتى تكون جاهزا لإعادة تعليق الحبيبات.

لإعادة تعليق الحبيبات الفيروسية ، استخدم طرف مرشح لإضافة 100 ميكرولتر من PBS المعقم المفلتر مسبقا إلى الأنبوب. ثم الماصة لأعلى ولأسفل حوالي 20 مرة. اترك الفيروس عند أربع درجات طوال الليل لإكمال إعادة التعليق.

يمكنك تخزين الاستعدادات الفيروسية عند أربع درجات لمدة أسبوع تقريبا وعند 80 درجة تحت الصفر لمدة تصل إلى عام واحد. تذكر أن تعالج جميع الأنابيب الفارغة باستخدام 10٪ مبيض قبل التخلص منها. إذا كنت تنوي استخدام التحضير الفيروسي لمدة تزيد عن أسبوع واحد ، الاحتفاظ به في الثلاجة.

قم بعمل الحد الأدنى من الحصص من خمسة إلى 20 ميكرولترا للتجارب المستقبلية وحصة واحدة من ثلاثة إلى خمسة ميكرولترات لتجميد المعايرة بالتحليل الحجمي وقم بتخزين الحصص عند 80 تحت الصفر تقريبا. الخطوة التالية هي تحديد العيار الفيروسي. إذا قمت بتضمين جين مراسل الفلورسنت في البلازميد الفيروسي العسسي ، فسوف تتألق الخلايا المصابة بالبلازميد الفيروسي ويمكنك تحديد العيار الفيروسي باستخدام قياس التدفق الخلوي.

للبدء ، قم بتخفيف ثلاثة ميكرولترات من الفيروس المركز إلى 1.5 مل من الوسط الكامل في الآبار ، من واحد إلى ستة. في صف واحد من لوحة 96 بئر. قم بإجراء التخفيفات التسلسلية التالية لجميع الآبار الستة عند 100 ميكرولتر من DM.To الكاملة ، أضف البئر الأول 100 ميكرولتر من الوسط بدون فيروس.

هذا هو سيطرتك غير الملوثة. إلى الثانية ، أضف جيدا 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف إلى الثالث. حسنا ، أضف 100 ميكرولتر من المزيج من البئر الثاني إلى البئر الرابع.

حسنا ، أضف 100 ميكرولتر من البئر الثالث إلى الخامس. حسنا ، أضف 100 ميكرولتر من البئر الرابع وإلى السادس. حسنا ، أضف 100 ميكرولتر من الخامس.

حسنا ، أخيرا ، خذ 100 ميكرولتر من البئر السادس وتخلص منها وتبييضها ، ارفع الحجم الإجمالي في جميع الآبار إلى 200 ميكرولتر باستخدام DMEM. مع كل تخفيف ، ينخفض تركيز الفيروس بمقدار النصف. لاحظ أن هذه هي التخفيفات المقترحة فقط ، والتي يجب أن تعمل بشكل جيد لمعايرة الفيروسات الأكثر تركيزا.

إذا كان الفيروس منخفض العيار أو غير مركز، فقد تحتاج إلى ضبط التخفيفات. عالج أي فيروس مخفف غير مستخدم باستخدام مبيض بنسبة 10٪ لمدة 45 دقيقة قبل التخلص منه في حاوية نفايات بيولوجية. أضف حوالي 15،000 صحية تقسم بنشاط 2 9 3 خلايا T إلى كل من الآبار الستة.

يمكنك استخدام صفيحة واحدة من 96 بئر لمعايرة 16 إعدادا فيروسيا ، وتعبئة الآبار إلى 200 ميكرولتر ، وإعادة الخلايا إلى الحاضنة والسماح للعدوى بالاستمرار لمدة 48 ساعة على الأقل. بعد الحضانة ، قم بتحليل مضان الخلية باستخدام مقياس التدفق الخلوي. يمكنك استخدام النسبة المئوية للخلايا الفلورية لكل بئر لتحديد عيار أو عدد الجسيمات الفيروسية المعدية لكل مليلتر من الفيروس المضاف.

احسب عدد الوحدات المعدية لكل مليلتر بالصيغة التالية عند تفسير التدفق. نتائج مقياس الخلايا. لاحظ أنه لا يمكن للمرء تحقيق حسابات دقيقة للعيار إلا عندما لا تتلق الخلايا المصابة أكثر من تكامل فيروسي واحد لكل خلية.

من أجل التأكد من أن هذا هو الحال ، استخدم الخلايا التي يقل معدل الإصابة بها عن 15٪ للحسابات. من المحتمل أن تكون الخلايا ذات معدلات العدوى الأعلى قد تلقت تكاملا فيروسيا-متعدد لكل خلية. يجب أن ينتج عن التخفيف المقترح في الخطوة الثانية عدة عينات ضمن هذا النطاق من العدوى.

من الناحية المثالية، استخدم العديد من العينات لإنشاء مخطط معايرة بالتحليل الحجمي يمكنك من خلالها حساب العيار النهائي. يمكن استخدام الصيغة المحسوبة من الخط الخطي المناسب لحساب العيار الفيروسي ، ولكن يمكنك حساب العيار باستخدام عينة واحدة إذا لزم الأمر. يمكن للمرء أن يتوقع عيار واحد في 10 إلى السابع يحول وحدات لكل مليلتر للفيروس غير المركز ، وواحد في 10 إلى الثامنة تحويل وحدات لكل مليلتر للفيروس المركز.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية إنتاج فيروسات العدسات عند القيام بهذا الإجراء. من المهم الالتزام بجميع لوائح السلامة البيولوجية والتخلص من النفايات بشكل صحيح. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.