Name: الفيروسة البطيئة الإنتاج (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: تعلم إنتاج الفيروسات البطيئة لعلاج الجينات باستخدام خلايا 293T البشرية. يوضح هذا البروتوكول خطوات النقل والحصاد والتقدير بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ساندلر الربو مركز البحوث الأساسية (SABRE) مؤسسة ساندلر

الجزء 1 : ترنسفكأيشن من الخلايا لإنتاج 293 كلوة الجنين البشري Lentiviruses * قبل 24 ساعة ترنسفكأيشن ، لوحة الخلايا 2.5 X 6 10 في صحن 10cm عن confluency من 50-70 ٪ في اليوم التالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبدأ هذا البروتوكول عن طريق إعداد الحمض النووي مع أي واحد في وقت لاحق سوف transfect الخلايا واحد لجعل الفيروس. أولا ، تخفيف FuGENE الكاشف ترنسفكأيشن 6 روش ، وهو كاشف الدهون التي تجعل الخلايا بتناول الحمض النووي. في أنبوب مل 1.5 ، ماصة 30μl FuGENE 6 في مصل المتوسطة خالية 600ul (SFDMEM). توخي الحذر لعدم السماح FuGENE تلمس الجانب من الأنبوب حيث يتم تسليمها في المتوسط. ندع هذا FuGENE وخلط واحتضان SFDMEM في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الحد الأقصى من الأنبوب ، مزيج 4 ميكروغرام lentiviral البلازميد مع 4 ميكروغرام لكل جيل الثالث 3 ناقلات التعبئة الفيروسي (pMDL ، وpRSV pVSV G). والبلازميد lentiviral يحتوي على الحمض النووي للفيروس سيتم إدراج في جينوم كل ما يصيب الخلية ، في حين أن ناقلات التعبئة تحتوي على جينات البروتينات سائر المطلوب لإجراء الفيروسة البطيئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الغطاء والمزيج بواسطة أنبوب في قلب عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة المحتوى بالكامل من الأنبوب إلى 293 لوحة. المزيج بلطف لوحة مائلة ذهابا وإيابا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى الخلايا الحاضنة والسماح الانتاج الفيروسية أن يستمر لمدة 48-96 ساعة قبل الحصاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الحضانة ، فإن الخلايا 293 نسخ الحمض النووي لمصلحة من البلازميد lentiviral ، وخلق نسخ الحمض النووي الريبي لبناء lentiviral. كما أنها نسخ وترجمة الجينات في ناقلات التعبئة والتغليف في البروتينات الفيروسية. هذه البروتينات المضي قدما لجعل الفيروسات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الإصدار الخاص من بناء lentiviral ، والتي ستغير نسخ الفيروس وإدراجها في الجينوم من الخلايا في كل ما يصيب. </li></ol> الجزء 2 : حصاد Lentiviral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة ، أخذ خلايا من الحاضنة واستخدام المتاح حقنة 10ML ، لإزالة طاف ، والتي تحتوي الآن على الفيروس. وسوف يكون هناك حوالي 10ML من طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق تصفية حقنة 0.45μM إلى الطرف وتصفية الفيروس في أنبوب بيكمان نابذة فائقة السرعة. مرشح يسمح الفيروسات فقط ، وليس الخلايا بالمرور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل رميه ، احتضان كل الخلايا المنتجة للفيروس ، لوحات والثقافة ، والمحاقن والمرشحات في المبيض بنسبة 10 ٪ لمدة 45 دقيقة. </li></ol> الجزء 3 : التركيز Lentiviral عبر تنبيذ فائق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل أنابيب الطرد المركزي في 41Ti SW - SW - 28 أو الدلاء الدوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المصل خالية DMEM لتحقيق التوازن بين جميع الفيروسات التي تحتوي على أنابيب إلى داخل 0.2g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الدلاء اغلاق الدوار وربط لهم على الدوار قبل ان يضع الدوار داخل نابذة فائقة السرعة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الفيروس لمدة 90 دقيقة في نابذة فائقة السرعة في 4 درجات مئوية في 25000 دورة في الدقيقة في الدوار SW - 24000 دورة في الدقيقة أو 41Ti في الدوار SW - 28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نسيج الثقافة هود ، المقلوب رأسا على عقب أنابيب لضخ طاف في وعاء يحتوي على مواد التبييض 10 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام Kimwipe لاستيعاب فائض السيولة في جميع أنحاء بيليه وعكس الأنبوب في رفوف مريحة لمدة لا تزيد على خمس دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعادة تعليق بيليه الفيروسي ، واستخدام غيض فلتر لاضافة 100 برنامج تلفزيوني العقيمة ميكرولتر إلى أنبوب ، ثم ماصة صعودا وهبوطا بنحو 20 مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الفيروس في 4 درجات ليلا لاستكمال إعادة تعليق C. يمكن للمرء تخزين محضرات الفيروسية عند 4 درجات لنحو 1 في الأسبوع ، و-80 درجة لمدة تصل الى سنة واحدة. تذكر لعلاج جميع أنابيب فارغة مع التبييض 10 ٪ قبل رميه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان أحد ينوي استخدام الإعدادية الفيروسية لمدة أطول من الأسبوع 1 ، وجعل الحد الأدنى من aliquots 20μl - 5 لإجراء التجارب في المستقبل ، وقسامة 1 من 3 إلى 5μl للمعايرة. تجميد وتخزين aliquots في 80 تحت الصفر. </li></ol> الجزء 4 : Lentiviral المعايرة باستخدام التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوة التالية هي تحديد عيار الفيروسية التي التدفق الخلوي. هذه الطريقة لا تعمل إلا في الحالات التي يكون فيها lentiviral البلازميد يحتوي على جين مراسل الفلورسنت. والفكرة هي أنه عندما يصيب الفيروس خلية ، فإنه يدخل في الحمض النووي إلى جينوم lentiviral البلازميد تلك الخلية. سوف الخلية المصابة ثم نسخ وترجمة الجينات التي شملت في البلازميد lentiviral ، وإذا كنت تضمن جينة مراسل الفلورسنت ، وسوف يتألق الخلايا المصابة. مستوى مضان يمثل قوة ، أو عيار من الفيروس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن أن يكون لكل سهم titered الفيروسي ، وتمييع 3 ميكرولتر من الفيروس تتركز في 1.5 مل من وسائل الإعلام كاملة (DMEM ، القلم بكتيريا ، الجلوتامين ، FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الآبار 1-6 في صف واحد من 96 لوحة جيدا ، نفذ التخفيفات المتسلسلة التالية : لجميع الآبار 6 إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام DMEM كاملة. إضافة إلى الأول من وسائل الإعلام جيدا 100μl مع عدم وجود الفيروس (وهذا هو عنصر التحكم غير ملوثين) ، والثاني كذلك إضافة 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف (أي ما يعادل to1 مل من فيروس مخفف) ، إضافة إلى الثلث من 100 ميكرولترمن مزيج من البئر الثانية ، إضافة إلى الرابع على 100 مل من 3 جيدا ، الى الخامس جيدا إضافة 100μl من البئر 4 ، والسادس أيضا إضافة 100 ميكرولتر من 5 جيد. 100ul تتخذ في النهاية من أصل 6 البئر وتجاهل في التبييض. وأجري تخفيف المسلسل حيث كل بئر ونصف حجم الفيروس مقارنة مع واحد قبل ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل إجمالي حجم في جميع الآبار ل200μl. علما أن هذه التخفيفات اقترح فقط ، التي ينبغي أن تعمل بشكل جيد لtitering الفيروسات الأكثر تركيزا. اذا كان الفيروس منخفضة في عيار ، أو غير مركز واحد قد تحتاج إلى ضبط التخفيفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج أي فيروس غير المستخدمة المخفف مع التبييض 10 ٪ لمدة 45 دقيقة قبل رميه في حاوية نفايات بيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ~ 15000 صحية ، وتقسيم الخلايا بنشاط 293 إلى كل من الآبار 6. ويمكن استخدام لوحة واحدة 96 - جيدا لعيار 16 محضرات الفيروسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى الخلايا الحاضنة 37 درجة مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ (2) وتسمح للعدوى والمضي قدما على الأقل 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة ، ويتم تحليل الخلايا للتعبير مراسل (مضان في حالتنا) مع تدفق عداد الكريات. وquantitated الجسيمات الفيروسية التي كتبها في المئة من الخلايا الفلورسنت لكل بئر. </li></ol> حساب عدد من وحدات المعدية في مل مع الصيغة التالية : <div style="text-align:center;;text-align:right;direction:rtl"> (# من الخلايا لكل بئر في يوم من الخلايا العدوى الإيجابية مراسل X) X 1000 ______________________________________________________ وأضاف أن مل من ناقلات جيدا </div> الجزء 5 : نتائج الممثل : بعد ترنسفكأيشن الحضانة لمدة 48 ساعة فترة ما بعد ، ينبغي أن لوحة من 293 خلايا تكون على حوالي 90 ٪ الفلورسنت. وهناك نسبة عالية من الخلايا الفلورسنت وهذا مؤشر على نسبة عالية من الخلايا المنتجة للفيروس. بعد الطرد المركزي ، وبيليه الفيروسية بالكاد مرئية عند إعادة التعليق. هذا أمر طبيعي كما هو واضح بيليه والصغيرة جدا. عند تفسير النتائج تدفق عداد الكريات ، علما أن واحدة فقط يمكن تحقيق عيار حسابات دقيقة عند إصابتها (الفلورسنت) الخلايا لم تتلق أي أكثر من التكامل الفيروسي في الخلية. من أجل ضمان أن يكون هذا هو الحال ، مع معدل استخدام الخلايا &lt;العدوى بنسبة 15 ٪ لإجراء العمليات الحسابية. وقد تلقت الخلايا مع ارتفاع معدلات العدوى الفيروسية المرجح integrants متعددة لكل خلية. ينبغي أن التخفيفات اقترح في الخطوة 2 الغلة عينات عدة ضمن هذا النطاق للعدوى. من الناحية المثالية ، واستخدام عينات عدة لتوليد مؤامرة المعايرة (الخط خطي) التي يمكنك من خلالها حساب عيار النهائي ، ولكن يمكنك حساب عيار باستخدام عينة واحدة ، إذا لزم الأمر. يمكن للمرء أن يتوقع من عيار 1.0 × 10 7 TU / مليلتر بالنسبة لبرنامج الأمم المتحدة للتركيز الفيروس و 1.0 × 10 8 TU / مل لفيروس المركزة.

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>وسط DMEM، خلايا HEK 293T، بنسيلين-ستربتوميسين، جلوتامين، محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، مصل جنين العجل (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>كاشف ترانزفكشن FuGENE 6، pSico mCherry، pMDL، pRSV، pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مبيّض</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>أطباق زراعة خلايا 10-cm، أطباق زراعة خلايا 96 بئراً</td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>ماصة متعددة القنوات</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>رؤوس ماصة مفلترة</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>أنابيب Eppendorf سعة 1.5ml، محقنة، مرشح محقنة (0.45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>أنابيب طرد مركزي فائق</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>حضانة زراعة أنسجة بنسبة 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>دوار Beckman SW41T.I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي فائق من Beckman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مجهر فلوري</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>جهاز FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

الفيروسة البطيئة الإنتاج

Lentivirus Production

تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هو نظام لإسكات الجينات في الخلايا الحية. في رني ، في تسلسل الجينات مثلي قصيرة الرناوات التدخل (سيرنا) يتم إسكاتها في دولة ما بعد النسخي. ويمكن التعبير عن الرناوات دبوس الشعر القصير ، والسلائف لسيرنا ، وذلك باستخدام الفيروسة البطيئة ، مما يسمح لرني في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. Lentiviruses ، مثل فيروس نقص المناعة البشرية ، قادرة على اصابة كل من الانقسام وعدم تقسيم خلايا. سنقوم بشرح الإجراء الذي lentiviruses إلى الحزمة. التغليف يشير إلى إعداد الأكفاء من نواقل فيروس الحمض النووي. وتستند نظم الإنتاج Lentiviral ناقلات على نظام &quot;تقسيم&quot; ، حيث تم تقسيم الجينوم الفيروسي في البنى الطبيعية المساعد الفردية البلازميد. تقسيم هذه العناصر الفيروسية المختلفة إلى أربع ناقلات منفصلة يقلل من خطر خلق الفيروس قادر على تكرار إعادة التركيب من قبل العارض للجينوم lentiviral. هنا ، transfected عابر متجه تحتوي على shRNA من الاهتمام والتعبئة والتغليف ناقلات الثلاث (ف VSVG ، pRSV ، pMDL) في خلايا الإنسان 293. على الأقل بعد فترة حضانة لمدة 48 ساعة ، هو حصاد طاف الفيروس التي تحتوي على ومركزة. أخيرا ، يتم تحديد عيار الفيروس بواسطة مراسل (الفلورية) التعبير مع تدفق عداد الكريات.

لجعل lentiviruses ، هي ناقلات transfected الحمض النووي في الخلايا البشرية 293. بعد الحصاد ، وتركيز طاف ، يتم تحديد عيار الفيروس عن طريق التعبير مضان مع تدفق عداد الكريات.

يُعد تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNA interference - RNAi) نظاماً لإسكات الجينات في الخلايا الحية. وفي عملية تداخل الحمض النووي الريبوزي، تكون الجينات المتجانسة في التسلسل مع جزيئات الحمض النووي الريبوزي المتداخلة القصيرة (siRNA) ...

تبدأ هذه العملية بنقل العدوى إلى خلايا 2 9 3 T باستخدام الفيروسات البطيئة، والبلازميد، وناقلات التعبئة الفيروسية، حيث يتم جمع السائل الطافي للفيروس بعد فترة حضانة لا تقل عن 48 ساعة. يتم ترشيح السائل الطافي لتركيزه باستخدام جهاز طرد مركزي فائق السرعة بعد عملية الطرد المركزي الفائق. يتم إعادة تعليق الراسب الفيروسي باستخدام PBS للحصول على عيار الفيروس، أولاً يتم تخفيف الفيروس المركز في أوساط نمو كاملة، ثم يتم إجراء تخفيف تسلسلي لإصابة الخلايا بالفيروسات البطيئة.مرحباً، أنا شين وونغ من مختبر مايكل مكمانوس في مركز السكري بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو. أنا مايكل مكمانوس. سنعرض لكم اليوم إجراءً لإنتاج الفيروسات البطيئة (lentiviruses).نستخدم هذا الإجراء في المختبر لإنتاج الفيروسات البطيئة (lentiviruses) من أجل تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNA interference). لذا، لنبدأ الآن. للبدء في هذا البروتوكول، قم بتحضير الحمض النووي (DNA) الذي سيتم استخدامه في ترنسفكشن (transfect) خلايا 2 9 3 T.أولاً، قم بتخفيف كاشف تعداء FU gene six في أنبوب سعة 1.5 مل عن طريق خلط 30 µL من Fuji six مع 600 µL من وسط خالٍ من المصل. احرص على عدم ملامسة Fuji لجدار الأنبوب أثناء إضافته إلى الوسط، ثم قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، في غطاء الأنبوب، اخلط 4 µg من البلازميد اللينتي فيروسي مع 1.33 µg.كل ناقل تغليف فيروسي من الجيل الثالث. يحتوي البلازميد اللينتيفيروسي على DNA. سيقوم الفيروس بالإدماج في جينوم كل خلية يصيبها، بينما تحتوي نواقل التغليف على الجينات الخاصة بجميع البروتينات الأخرى المطلوبة لإنتاج فيروس لينتيفيروسي؛ أغلق الغطاء واخلط عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.يُحضن الحمض النووي DNA وكاشف عفن الخلايا (transfection reagent) لمدة تتراوح بين 15 و20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الآن، حان وقت عفن خلايا 293 باستخدام الحمض النووي DNA الذي قمت بتحضيره؛ استخدم الخلايا التي تم زراعتها قبل 24 ساعة والتي وصلت درجة تلاقيها (confluency) إلى 50% إلى 70% داخل غطاء زراعة الأنسجة. قم بنقل كل كمية الحمض النووي DNA المحضرة بواسطة الماصة إلى طبق خلايا 293، وامزجها بلطف عن طريق إمالة الطبق ذهاباً وإياباً، ثم أعد الخلايا إلى المحضنة واترك عملية إنتاج الفيروسات تستمر لمدة تتراوح بين 48 و96 ساعة قبل الحصاد. خلال فترة الحضن، تنتج خلايا 293 فيروسات لينتيفيروس (lentiviruses) تحتوي جينوماتها على نسخة RNA من الحمض النووي DNA المستهدف.حان الآن وقت جمع الفيروس. أخرج الخلايا من الحاضنة. قم بتجهيز مرشح حقنة بمسامية 0.4 أو 5 ميكرون، وحقنة بلاستيكية سعة 10 مل، وأنبوب طرد مركزي من نوع UltraClear Beckman داخل غطاء زراعة الأنسجة.استخدم محقنة مخصصة للاستخدام مرة واحدة لإزالة الطافي، الذي يحتوي الآن على الفيروس. قم بتركيب مرشح محقنة بمسامية 0.45 ميكرون في طرف المحقنة وقم بترشيح الفيروس في أنبوب طرد مركزي من نوع UltraClear Beckman. يسمح المرشح بمرور الفيروسات فقط دون الخلايا، وبعد التخلص من المرشح، قم بتحضين جميع الخلايا المنتجة للفيروس.نقع أطباق المزارع والمحاقن والمرشحات في محلول مبيض بتركيز 10% لمدة 45 دقيقة. الآن، وبعد جمع الفيروس وترشيحه، حان الوقت لتركيز الفيروس عن طريق الطرد المركزي الفائق أولاً. استخدم وسط DMEM الخالي من المصل لموازنة جميع الأنابيب التي تحتوي على الفيروس بحيث لا يتجاوز الفرق بينها 0.2 جرام.بعد ذلك، ضع أنابيب الطرد المركزي المتوازنة في سلال الدوار SW 41 TI أو SW 28. أغلق سلال الدوار بإحكام وثبتها في الدوار. ثم ضع الدوار داخل جهاز الطرد المركزي الفائق.قم بطرد الفيروس مركزياً لمدة 90 دقيقة تقريباً عند درجة حرارة أربع درجات مئوية وبسرعة 25,000 RPM باستخدام دوّار SW 41 TI، أو بسرعة 24,000 RPM باستخدام دوّار SW 28. بعد عملية الطرد المركزي، عد إلى غطاء زراعة الأنسجة واقلب الأنبوب لصب الـ SNAT في حاوية تحتوي على bleach بنسبة 10%. استخدم منديل Kim wipe لامتصاص السوائل الزائدة حول الراسب، ثم اقلب الأنبوب في حامل مناسب لمدة لا تزيد عن خمس دقائق حتى تكون مستعداً لإعادة تعليق الراسب.لإعادة تعليق الراسب الفيروسي، استخدم طرف مصفاة لإضافة 100 µL من محلول PBS المعقم والمصفى مسبقاً إلى الأنبوب. ثم قم بعملية السحب والدفع بالممصّة حوالي 20 مرة. اترك الفيروس عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل لإتمام عملية إعادة التعليق.يمكنك تخزين التحضيرات الفيروسية عند درجة حرارة 4 °C لمدة أسبوع تقريبًا، وعند درجة حرارة -80 °C لمدة تصل إلى عام واحد. تذكر معالجة جميع الأنابيب الفارغة بمحلول مبيض بتركيز 10% قبل التخلص منها. إذا كنت تنوي استخدام التحضير الفيروسي لمدة تزيد عن أسبوع واحد، فيمكن حفظه في الثلاجة.قم بإعداد حصص صغيرة تتراوح من 5 إلى 20 µL للتجارب المستقبلية، وحصة واحدة تتراوح من 3 إلى 5 µL لعملية معايرة التجميد، ثم قم بتخزين هذه الحصص عند درجة حرارة -80 °C تقريباً. الخطوة التالية هي تحديد عيار الفيروس. إذا كنت قد أدخلت جيناً مراسلاً فلورياً في بلازميد الفيروس البطيء، فسوف تظهر الخلايا المصابة وميضاً فلورياً، ويمكنك حينئذٍ تحديد عيار الفيروس باستخدام قياس التدفق الخلوي.للبدء، يتم تخفيف 3 µL من الفيروس المركز في 1.5 mL من الوسط الكامل في الآبار من واحد إلى ستة، وذلك في صف واحد من طبق يحتوي على 96 بئرًا. يتم إجراء التخفيفات التسلسلية التالية في جميع الآبار الستة باستخدام 100 µL من وسط DM الكامل. يُضاف إلى البئر الأول 100 µL من الوسط الخالي من الفيروس.هذه هي عينة الضبط غير المصبوغة. وفي البئر الثانية، سنضيف 100 µL من الفيروس المخفف إلى البئر الثالثة. ثم سنضيف 100 µL من الخليط الموجود في البئر الثانية إلى البئر الرابعة.سنضيف 100 µL من البئر الثالث إلى البئر الخامس. ثم سنضيف 100 µL من البئر الرابع إلى البئر السادس. وسنضيف 100 µL من البئر الخامس.وأخيراً، اسحب 100 µL من البئر السادسة وتخلص منها باستخدام المبيض، ثم اجعل الحجم الإجمالي في جميع الآبار 200 µL باستخدام DMEM. مع كل تخفيف، ينخفض التركيز الفيروسي إلى النصف. لاحظ أن هذه التخفيفات هي مجرد مقترحات، والتي من المفترض أن تعمل بشكل جيد لتقدير عيار معظم الفيروسات المركزة.إذا كان عيار الفيروس منخفضاً أو غير مركز، فقد تحتاج إلى تعديل التخفيفات. عالج أي فيروس مخفف غير مستخدم بمحلول مبيض بنسبة 10% لمدة 45 دقيقة قبل التخلص منه في حاوية نفايات المخاطر البيولوجية. أضف حوالي 15,000 من خلايا 2 9 3 T السليمة والمنقسمة بنشاط إلى كل بئر من الآبار الستة.يمكنك استخدام طبق واحد بـ 96 بئراً لتقدير عيار 16 مستحضراً فيروسياً، مع ملء الآبار حتى 200 microliters، وإعادة الخلايا إلى الحاضنة وترك العدوى تتقدم لمدة 48 ساعة على الأقل. بعد الحضن، قم بتحليل فلورة الخلايا باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي. يمكنك استخدام النسبة المئوية للخلايا الفلورية في كل بئر لتحديد العيار أو عدد الجسيمات الفيروسية المعدية لكل milliliter من الفيروس المضاف.احسب عدد الوحدات المعدية لكل ملليليتر باستخدام الصيغة التالية عند تفسير نتائج قياس التدفق الخلوي (Flow Cytometer). لاحظ أنه لا يمكن تحقيق حسابات دقيقة للعيار إلا عندما لا تتلقى الخلايا المصابة أكثر من دمج فيروسي واحد لكل خلية.ولضمان تحقيق ذلك، استخدم الخلايا التي تقل نسبة العدوى فيها عن 15% لإجراء الحسابات. فمن المرجح أن الخلايا ذات معدلات العدوى الأعلى قد استقبلت جزيئات فيروسية مدمجة متعددة في الخلية الواحدة. وينبغي أن يؤدي التخفيف المقترح في الخطوة الثانية إلى الحصول على عدة عينات ضمن هذا النطاق من العدوى.يُفضل استخدام عينات متعددة لإنشاء مخطط معايرة يمكن من خلاله حساب العيار النهائي. يمكن استخدام الصيغة المحسوبة من الخط المستقيم الموائم لحساب العيار الفيروسي، ولكن يمكنك حساب العيار باستخدام عينة واحدة إذا لزم الأمر. ومن المتوقع أن يكون العيار 1 × 10⁷ وحدة نقل لكل ملليلتر للفيروس غير المركز، و1 × 10⁸ وحدة نقل لكل ملليلتر للفيروس المركز.لقد استعرضنا للتو كيفية إنتاج الفيروسات البطيئة عند القيام بهذا الإجراء. ومن المهم الالتزام بجميع لوائح السلامة البيولوجية والتخلص من النفايات بشكل صحيح. وهذا كل شيء.شكرًا للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ناقلات التعبير Lentiviral هي الوسائل الأكثر فعالية للتعبير عن جزيئات ستابلي المستجيب مختلفة أو يبني صحافي في تقسيم وغير تقسيم خلايا الثدييات والكائنات كلها. هنا نقدم بروتوكول بشأن كيفية حزم بنيات التعبير lentivector في جزيئات pseudoviral وtransduce الخلايا المستهدفة باستخدام جزيئات pseudoviral.

التعبئة والتغليف بفيروس نقص المناعة البشرية أو FIV المستندة إلى محددات التعبير Lentivector وتنبيغ من الجزيئات VSV-G الفيروسية Pseudotyped

في هذا البروتوكول وصفنا الإنتاج، وتنقية ومعايرة ناقلات lentiviral. ونحن نقدم مثالا على lentiviral إيصال الجينات ناقلات بوساطة في الخلايا العصبية مثقف الابتدائي والنجمية. وقد طرقنا تنطبق أيضا على أنواع الخلايا...

انتاج ناقلات Lentiviral للخلايا Transducing من الجهاز العصبي المركزي

هنا، ونحن نستخدم تنبيغ فيروسات وترنسفكأيشن concatemeric لإنشاء خط الخلية التي يمكن أن تعبر عن مكونات ناقلات lentiviral (LV) في غياب التتراسيكلين. هذا LV بترميز GFP وpseudotyped مع بروتين سكري، SVGmu، والتي هي محددة لمستقبلات على الخلايا الجذعية.

خط خلية التتراسيكلين التنظيم وتنتج ناقلات lentiviral عالي عيار التي تستهدف على وجه التحديد خلايا الجذعية

نقدم هنا بروتوكولات توفر أساسا مرنا واستراتيجيا للتلاعب الفيروسي بالخلايا السليفة قليلة التغصن للإفراط في التعبير عن البروتينات ذات الأهمية من أجل استجواب دورها على وجه التحديد في الخلايا قليلة التغصن عبر النموذج المختبري لتكوين النخاع في الجهاز العصبي المركزي.

إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة إلى خلايا انتقائي تنبيغ الابتدائية دبقية قليلة التغصن السلائف ل في المختبر فحوصات تكون الميالين

نقدم هنا بروتوكولا للتحويل المباشر للأرومات الليفية الجنينية الفئران إلى خلايا جذعية للأرومة الغاذية تعمل بكامل طاقتها ومستقرة عن طريق الإفراط في التعبير لمدة عشرة أيام عن Tfap2c و Gata3 و Eomes و Ets2.

بروتوكول التحويل المباشر من الفئران الجنينية الخلايا الليفية إلى الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية

يصف لنا استراتيجية إنتاج ناقلات تفتقر إلى إينتيجراسي لينتيفيرال (إيدلفس) كوسائل إيصال كريسبر/Cas9 للخلايا. مع قدرة على التوسط من أجل تحرير سريعة وقوية من الجينات في الخلايا، إيدلفس أكثر أماناً ومنصة متجه نفس القدر من الفعالية لإيصال الجينات بالمقارنة مع نواقل إينتيجراسي المختصة.

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتعزيز التكامل التحوير وإنتاج مؤسس الفئران المحورة وراثيا بكفاءة عالية بحقنه بسيطة ناقل لينتيفيرال في الفضاء بيريفيتيليني البويضات المخصبة.

لينتيفيرال توسط إنتاج فئران المحورة وراثيا: طريقة بسيطة وذات كفاءة عالية للدراسة مباشرة من مؤسسي

واستهدفت epigenome الحمض النووي يمثل تحرير نهج علاجية قوية. يصف هذا البروتوكول إنتاج وتنقية، وتركيز ناقلات لينتيفيرال الكل في واحد إيواء التحوير كريسبر-dCas9-DNMT3A لتطبيقات تحرير ابيجينومي في الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسك)-المستمدة من الخلايا العصبية.

منهاج متجه لينتيفيرال الكفاءة في تقديم أدوات تحرير ابيجينومي إلى الإنسان الناجمة عن نماذج المرض المستمدة من الخلايا الجذعية Pluripotent

نعرض بروتوكولا خطوة بخطوة للتحقيق في وظيفة الجينات في الضامة المقيمة في الأنسجة البريتونية في الجسم الحي ، باستخدام ناقلات الفيروسات العدسية.

تحضير ناقل Lentiviral لتعديل الجينات والحمض النووي الريبي الدقيق الفعال للبلاعم المقيمة في أنسجة التجويف البريتوني في الجسم الحي في الفئران

تحدث ترنح البوليغلوتامين الشوكي المخيخي نتيجة توسعات CAG التي تنتج بروتينات عرضة للتجمع. يصف هذا البروتوكول إنتاج الناقلات، وتوصيل الإشارات المجسمة، وتحليل الشوائب وفقدان العلامات العصبية، موفرا منصة محكمة لدراسة الآليات وتقييم العلاجات المستهدفة للأمراض التنكسية العصبية.

علم الأمراض المخططة الناتج عن الفيروسات اللينتيفيرالية كنموذج ما قبل سريري لترنح الدماغ العمودي الدماغي المضحك بالبوليغلوتامين

هنا، نصف طريقة للتصور الخلوي، وتحديد المواقع تحت الخلوي، والتحليل الكمي لتركيزات البولي (ADP-ريبوز) (PAR) الغنية في الخلايا الثديية الثابتة. يتيح هذا الاختبار قياس مواقع تنشيط PARP الناتج عن تلف الحمض النووي، بما في ذلك ذلك المرتبط بإصلاح استئصال القاعدة أو إصلاح كسر السلسلة الواحدة، في أنوية الخلايا المعرضة للسم الجيني.

التصور والتحليل الكمي لتنشيط PARP1/PARP2 الناتج عن السموم الجينية في الخلايا باستخدام مراسل بروتين الاندماج الفلوري

تعلم إنتاج الفيروسات البطيئة لعلاج الجينات باستخدام خلايا 293T البشرية. يوضح هذا البروتوكول خطوات النقل والحصاد والتقدير بدقة عالية.

الفيروسة البطيئة الإنتاج

استكشف المزيد من الفيديوهات