الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

مقدمة. مرحباً. نحن من معهد العلوم البيومترية في الجامعة الاتحادية في فاجا بالبرازيل. سنقوم في هذا الفيديو بتحضير فروش صبغية لخلايا جذعية جنينية بشرية للكشف عن التغيرات الصبغية المحتملة. على الرغم من أنه ثبت أن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية تمتلك نمطاً نووياً مستقراً، إلا أن العديد من الدراسات أفادت بأنها تصبح عرضة لاكتساب شذوذات صبغية، مثل إضافة صبغيات كاملة أو أجزاء منها، اعتماداً على ظروف الزرع.

يعد توصيف السلامة الجينية لخلايا HASS في المختبر أمراً بالغ الأهمية بالنظر إلى أهميتها في دراسات التكوين الجنيني واختبار الأدوية. علاوة على ذلك، تمثل التغيرات الكروموسومية مصدر قلق حقيقي بالنسبة للمقترحات العلاجية المستقبلية، كونها ترتبط غالباً بعمليات التسرطن. لذا، فلنبدأ العمل.

معالجة الخلايا باستخدام ate في هذا الإجراء، نستخدمه. تم استنبات الخلايا من ثمانية إلى تسعة في وسط F 12 المكمل بـ 20% من بديل مصل بلاويقي وبـ 80 إلى 9 g/mL من عامل نمو الخلايا الليفية. ابدأ بإخراج قارورة الزرع من الحاضنة، وتحت غطاء التدفق الصفائحي، أضف coit ليكون التركيز النهائي 0.1 µg/mL.

تؤدي إضافة Coit إلى الوسط إلى تحفيز mitoka، والراحة، والطور الاستوائي. عندما تتكثف الكروموسومات بشكل جيد ويصبح من السهل رؤيتها تحت المجهر، تأكد من استخدام التقنيات المعقمة لتجنب التلوث. بعد إضافة Coit، أغلق القارورة وأعد الخلايا إلى الحاضنة.

تثبيت الخلايا بعد فترة الحضنة؛ الخلايا ليست جاهزة للتثبيت في هذه المرحلة. ليس من الضروري العمل في ظروف معقمة. ابدأ بشفط الوسط، وعند الانتهاء من ذلك، أضف التريبسين.

أضف DTA بتركيز 0.05% إلى الدورق. تأكد من إضافة كمية كافية من التريpsin لتغطية السطح السفلي للخلايا. أغلق الدورق ورجّه برفق للتوزيع المتساوي.

يُترك التريpsin ليتفاعل مع الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد مرور خمس دقائق من الحضن في درجة حرارة الغرفة، يجب ألا تكون الخلايا ملتصقة بالجانب السفلي من القارورة، وعندها ستحتاج إلى تثبيط مفعول التريpsin إما بإضافة وسط زراعة يحتوي على المصل أو بإضافة المصل بلطف إلى الخلايا. قم بإزالة غطاء القارورة بعناية وأضف وسط الزراعة أو المصل، مع السماح للسائل بالتدفق نحو الجانب السفلي من القارورة فوق الخلايا.

استخدم الماصة لسحب معلق الخلايا ودفعه عدة مرات لتفكيك الخلايا تمامًا. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter، ولكن قبل القيام بذلك، تأكد من تفكيك الخلايا جيدًا ومن أن المعلق لا يحتوي على أي تكتلات خلوية مرئية. بمجرد إتمام عملية النقل، أغلق الأنبوب بإحكام ثم قم بالطرد المركزي.

قم بخلط المعلق عن طريق القلب لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي بسرعة 800 RPM، يجب أن تتكون كرة خلوية (cell palette) في قاع الأنبوب. احذر من زعزعة الكرة الخلوية.

قم بشفط السائل باستخدام P 1000 حتى يتبقى حوالي 200 microliters فقط. هذا الحجم متوسط لعملية Resus. قم بتعليق الراسب في محلول Resus.

قم بتعليق الرواسب. انقر على الأنبوب برفق بأصابعك عدة مرات. تأكد من تعليق الخلايا جيداً من خلال التحقق من عدم وجود تكتلات خلوية متبقية في المحلول.

في هذه المرحلة، يجب أن يكون المحلول عكراً. بعد ذلك، يجب إضافة خمسة ملليلتر من محلول كلوريد البوتاسيوم بتركيز 75 millimolar المسخن مسبقاً إلى 37 °C. يجب إضافة المحلول ناقص التوتر ببطء شديد من أسفل الأنبوب مع تدوير الأنبوب.

بعد إضافة الثلاثة مليلتر الأولى، أغلق الأنبوب بإحكام وعناية. ثم قم بتجانس معلق الخلايا باستخدام محلول ناقص التوتر عن طريق تدوير الأنبوب أفقيًا وببطء.

يتم المتابعة بإضافة المليلترين المتبقيين ببطء وبنفس الطريقة السابقة. والغرض من المحلول ناقص التوتر هو زيادة حجم الخلية للسماح للكروموسومات بالانفكاك. لذا، فإن فترة الحضانة هذه ضرورية للحصول على فروق كروموسومية جيدة؛ وعند الانتهاء من إضافة الخمسة مليلترات كاملة، يتم إغلاق الأنبوب بالغطاء وحضانة الخلايا في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة 15 دقيقة.

عند اكتمال فترة الحضانة التي تبلغ 15 minutes، أخرج الأنبوب من الحمام المائي. في هذه المرحلة، يمكنك العمل داخل خزانة استخلاص الغازات لأن الأبخرة الناتجة عن محلول التثبيت تكون سامة. إذا لم تكن خزانة استخلاص الغازات متاحة، فاحرص على العمل في منطقة جيدة التهوية.

أزل غطاء الأنبوب وأضف ثلاث قطرات من محلول التثبيت. يتكون هذا المحلول من الميثانول وحمض الأسيتيك بنسبة 3 إلى 1، ويجب تحضيره في يوم الاستخدام. أغلق الأنبوب بإحكام وأدر الأنبوب أفقياً بلطف بينما يدور ببطء، أولاً باتجاه عقارب الساعة، ثم عكس اتجاه عقارب الساعة.

قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 800 RPM دون توقف مفاجئ. من المهم جداً السماح لدورة الدوران بالتوقف ببطء لمنع فقدان المواد الناتج عن تآكل الخلايا بعد عملية الطرد المركزي. هذه الرواسب الخلوية تعيش في حوالي 200.

لتعليق الراسب، انقر على الأنبوب برفق بأصابعك عدة مرات. تأكد من تعليق الخلايا جيداً من خلال التحقق من عدم وجود أي تكتلات خلوية متبقية. أضف 3 mL من محلول التثبيت ببطء على جدار الأنبوب مع تدوير الأنبوب بعد إضافة الـ 3 mL الأولى.

أغلق الأنبوب T بإحكام وقم بتجانس معلق الخلايا بعناية عن طريق تدوير الأنبوب أفقياً بلطف وببطء. تأكد من إتمام دورة كاملة واحدة على الأقل. ولزيادة فعالية عملية الخلط هذه، أضف المزيد.

أضف ملي لترين من محلول التثبيت بجوار جدار الأنبوب لترسيب الخلايا. يُحفظ معلق الخلايا عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. يمكن تخزين هذه الخلايا المثبتة في محلول التثبيت عند درجة حرارة 4 °C لعدة أشهر.

غسل الخلايا في اليوم التالي عن طريق طرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق عند 800 RPM دون توقف. تخلص من السائل العلوي واترك حوالي 200 µL. قم بتعليق الراسب عن طريق نقر الأنبوب بالأصابع عدة مرات.

تأكد من ارتباط الخلايا جيداً ومن أن المعلق لا يحتوي على أي تكتلات خلوية مرئية. أضف خمسة ملليلترات 5 mL من محلول التثبيت الطازج ببطء عبر جدار الأنبوب. أغلق الأنبوب بإحكام وقم بتجانس الخلايا عن طريق تدوير الأنبوب أفقياً بلطف مع تدويره ببطء.

بالإضافة إلى حماية الخلايا، يعمل محلول التثبيت على إزالة الدهون ثم ترسيب البروتينات، مما يؤدي بدوره إلى تسهيل انتشار الكروموسومات. يتم إجراء طرد مركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق عند 800 RPM دون توقف. عند تحضير الشرائح في خطوة الطرد المركزي، يُترك مقدار كافٍ من المحلول لجانسة كتلة الخلايا.

قد تعتمد كمية السائل هذه على عدد الخلايا. قم بنقر الأنبوب برفق بأصابعك عدة مرات. تأكد من تجانس الخلايا جيداً عبر التحقق من عدم وجود تكتلات خلوية مرئية.

في هذه المرحلة، يجب إضافة 20 إلى 30 µL من معلق الخلايا إلى شريحة نظيفة وجافة من خلال تحريك الماصة بشكل موازٍ لسطح الشريحة. ومع تبخر محلول التثبيت، يصبح سطح الشريحة محبباً على الفور. وجه وجه الشريحة للأعلى في بخار الماء الساخن لمدة 30 ثانية لتحفيز تمدد الخلايا.

تحليل هذه الشرائح. بعد تحضير هذه الشرائح، يتم تحليلها تحت مجهر تباين الأطوار باستخدام العدسات الشيئية بقوة 10x و40x للتأكد مما إذا كانت كثافة الخلايا مناسبة لمزيد من التحليل. تُعد هذه الشريحة مثالاً على شريحة ذات تركيز عالٍ جداً.

لاحظ أن نوى الخلايا قريبة جداً من انتشارات الطور الاستوائي. إذا كان لديك شريحة تكون فيها كثافة الخلايا عالية جداً، فقم بتخفيف معلق الخلايا عن طريق إضافة المزيد من محلول التثبيت. توضح هذه الشريحة كثافة الخلايا المطلوبة.

لاحظ أن انتشارات الطور الاستوائي متباعدة ومعزولة جيداً. بمجرد الحصول على شريحة بكثافة خلوية مثالية، يمكن صبغها وتحليلها. تجنب اختيار الخلايا في الطور الاستوائي القريبة من النواة، حيث قد تكون الكروموسومات مختبئة أو محجوبة عن الرؤية.

ابحث عن صور الطور الاستوائي (metaphase) التي تبدو مستديرة، مع التأكد من عدم ابتعاد أي كروموسومات بعيداً عن لوحة الطور الاستوائي، وذلك لاختيار صور طور استوائي مستديرة ومعزولة جيداً. وكما يظهر في الشريحة التالية، حاول تجنب الإبلاغ عن حالات خلل في العدد الكروموسومي (IES) كاذبة، مثل زيادة عدد الكروموسومات الناتجة عن تداخل انتشارين أو أكثر، أو فقدان الكروموسومات الناتج عن وجود كروموسومات مستقيمة.

نأمل أن يساعدكم هذا الفيديو في تجاربكم المستقبلية. إذا كان لديكم أي استفسار، فلا تترددوا في الاتصال بنا. نتمنى لكم الاستفادة وبالتوفيق.