Name: استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-04T16:40:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: تعلم قياس نشاط البروتياز باستخدام أدوات الكشف الفلورية وقياس التألق لضمان جودة العينات البيولوجية في المختبرات. هذه الطريقة تكشف التلوث الدقيق بالإنزيمات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

إعداد التعليمات يتم توفير الاحتياطي الحضانة ، مخزن الفحص ، و 0.6 الحل TCA N والجاهزة للاستخدام الحلول. الركيزة FITC - الكازين -- ينصح قسامة الركيزة FITC - الكازين إلى أصغر وحدات التخزين لدى وصوله لتجنب تكرار تجميد أذاب دورات. إذا تعرض الركيزة FITC - الكازين الى دورات تجميد أذاب المتكررة ، وزيادة طفيفة في الخلفية يحدث ، وبالتالي ، خفض الحساسية. ينبغي تخزين aliquots في -20 درجة مئوية ، ومحمية من الضوء. كل عينة ، رد فعل فارغا ، أو السيطرة يتطلب 20 ميكرولتر من الركيزة FITC - الكازين. تجميد / الذوبان ، وكذلك الاختلاط أو المصافحة قوية يمكن أن يسبب FITC لفصل من الكازين مما أدى إلى ارتفاع خلفية القراءة وتسبب أقل الركيزة لتكون متاحة لتشطر البروتيني. وثيوسيانات فلوريسئين (FITC) مراقبة الحل ، ويمكن إعادة السيطرة FITC العازلة في الفحص لتركيز مناسبة. وينبغي بذل هذا الحل الطازجة ومحمية من الضوء. التحكم النهائي التربسين الحل -- أضف 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك ملي 1 إلى القارورة من التربسين ، البروتياز التحكم (رمز المنتج تي 6567). مزيج لفترة وجيزة لضمان حل التربسين. إضافة 900 ميكرولتر من الاحتياطي الحضانة وتخلط جيدا. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مخازن أخرى إذا رغبت في ذلك للمقايسة. تركيز العمل النهائية للالتربسين هو 20 ميكروغرام / ميكرولتر. عندما تصبح جاهزة لإعداد حلول التحكم التربسين ، الجمع بين قسامة من الحل التربسين الحمضية مع المبلغ الصحيح من الاحتياطي الحضانة (1 التربسين يحمض جزئيا إلى قطع عازلة 9). التربسين تخزين تحت ظروف حمضية يزيد من استقرار التربسين. الحل تحكم التربسين حساس درجة الحرارة وغير مستقر في تركيزات منخفضة. يرجى مراجعة نشرة عدة الفني للتخزين والاستقرار لهذه الحلول التي يجري اعدادها. إجراء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن الأسهل لإعداد الضوابط ، والفراغات ، وجميع العينات في وقت واحد. لكل عينة اختبار ، وإضافة 20 ميكرولتر من الاحتياطي الحضانة ، 20 ميكرولتر من FITC - الكازين الركيزة ، و 10 ميكرولتر من عينة الاختبار لأنبوب microcentrifuge. لعينات الاختبار مع ارتفاع نشاط الأنزيم البروتيني ، قد يكون مطلوبا تخفيف العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير عينات الرقابة المناسبة (انظر عينات التحكم) وذلك بإضافة 20 ميكرولتر من الاحتياطي الحضانة ، 20 ميكرولتر من FITC - الكازين الركيزة ، و 10 ميكرولتر من العينة التحكم إلى أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نموذج فارغ بإضافة 20 ميكرولتر من الاحتياطي الحضانة ، 20 ميكرولتر من FITC - الكازين الركيزة ، و 10 ميكرولتر من الماء عالى النقاء لأنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج بلطف واحتضان كل أنبوب عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 60 دقيقة. يجب الحرص على عدم خلط بقوة أيضا ، كما قد يسبب الاضطراب المفرط مضان الخلفية ، والحد من حساسية مقايسة. ملاحظة : يمكن تمديد فترة الحضانة تصل إلى 24 ساعة لزيادة الحساسية. كن حذرا لا تتجاوز 24 ساعة كما الكازين FITC ، قد تبدأ في التدهور ، مما أدى إلى ارتفاع الخلفية مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الاحتضان إضافة 150 ميكرولتر من محلول حمض حمض التريكلوروسيتيك N 0.6 على كل أنبوب microcentrifuge. TCA هو تآكل جدا ويجب التعامل معها في حين يرتدي المعدات المناسبة للحماية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج بلطف واحتضان عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في ز س 10000 وطاف يحتوي على حامض ، FITC ذوبان شظايا المسمى ، ويستخدم لقياس مضان. </li></ol> قياسات مضان يمكن تحجيم هذه الأساليب لأعلى أو إلى أسفل وفقا لمتطلبات الأجهزة المتوفرة. للمقارنة على مستوى منحنى أعدت مع عينات الرقابة المناسبة ، طرح القراءة مضان من عينة فارغة (FLUblank) من قيمة كل عينة اختبار (FLUtest). Cuvettes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ميكرولتر ماصة للطاف (الخطوة 7) و 1 مل من الاحتياطي الفحص في مناسبة وكفيت المزيج بلطف. ملاحظة : يمكن تخزين حل مؤقت طاف والفحص في الظلام عند درجة 2-8 لتصل إلى 24 ساعة قبل قياس مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل كثافة مضان مع الإثارة عند 485 نانومتر ، ومراقبة الانبعاثات الطول الموجي من 535 نانومتر. </li></ol> لوحات Multiwell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين حل مؤقت طاف والفحص في الظلام في 08/02 درجة مئوية لمدة تصل : 10 ميكرولتر ماصة للملاحظة طاف (الخطوة 7) و 1 مل من الاحتياطي الفحص في أنبوب أو قنينة مناسبة ومزيج بلطف قبل 24 ساعة قياس مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 200 ميكروليتر إلى البئر من 96 لوحة سوداء أيضا. سجل كثافة مضان مع الإثارة عند 485 نانومتر ، ومراقبة الانبعاثات الطول الموجي من 535 نانومتر. أو </li></ol><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 2 ميكرولتر من طاف (الخطوة 7) و 200 ميكرولتر من الفحص Buffer في بئر من 96 لوحة سوداء أيضا. ملاحظة : يمكن تخزين حل مؤقت طاف والفحص في الظلام عند درجة 2-8 لتصل إلى 24 ساعة قبل قياس مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل كثافة مضان مع الإثارة عند 485 نانومتر ، ومراقبة الانبعاثات الطول الموجي من 535 نانومتر. </li></ol> مراقبة عينات يمكن استخدام محلول التحكم التربسين لتأكيد الفحص يجري بشكل صحيح ، لتحديد حد الاكتشاف ، أو إنشاء منحنى العامة القياسية. لمقايسة للبروتياز مختلفة محددة ، فمن المستحسن أن يعد حل التحكم التي تحتوي على الأنزيم البروتيني محددة في المنطقة العازلة الحضانة المناسبة. الحد من الكشف عن مقايسة هي كمية الأنزيم البروتيني الذي ينتج القراءة هامة مضان فوق القيمة التي تم الحصول عليها مع نموذج فارغ. والحد من الكشف تختلف تبعا لحساسية هذه الأجهزة. ويمكن استخدام التخفيفات التسلسلي للحلول التحكم التربسين لتوليد حلول التحكم. وتعتبر المساواة القراءة إلى 120 ٪ من القيمة التي تم الحصول عليها مع نموذج فارغ كبيرة. بشكل روتيني ، وحصل على الحد من الكشف عن 5 نانوغرام من التربسين مع هذا الإجراء. فمن المستحسن أن يتم تشغيل واحد على الأقل السيطرة التربسين 5 نانوغرام مع كل تجربة. ومن شأن حل السيطرة التربسين بتركيز من 0.5 ميكروغرام / لتر ينتج 5 نانوغرام المرجوة من التربسين في مقايسة. والتخفيف من 40 ضعفا من الحل التحكم التربسين (20 ميكروغرام / مل) النتائج في محلول 0.5 السيطرة ميكروغرام / لتر ، أي جزء واحد من حلول التحكم التربسين إلى 39 أجزاء من الاحتياطي الحضانة. <img src="/files/ftp_upload/1514/figure1.jpg" alt="الشكل 1"> الشكل 1 (المنحنى القياسي النشاط التربسين) : ويمكن أيضا أن الحل التحكم التربسين (20 ميكروغرام / مل) يمكن استخدامها لتوليد منحنى القياسية من خلال جعل التخفيفات التسلسلي (انظر الشكل 1). تم تصحيح القراءة مضان من كل عينة التحكم عن طريق طرح قراءة مضان من عينة فارغة (FLUblank) من قيمة كل عينة السيطرة (FLUcontrol). منحنى معيار نموذجي لالتربسين (رمز المنتج تي 6567) باستخدام عينات من هذه المجموعة وتراوحت ما بين 0.15 ميكروغرام / لتر (1.5 نانوغرام) إلى 2.5 ميكروغرام / لتر (25 نانوغرام). تم إنشاء هذا المنحنى من خلال اتباع إجراءات وصفها ، مع فترة حضانة لمدة 30 دقيقة عن الخطوة 4. أجريت قياسات مضان في صفيحة multiwell. وتقدم فلوريسئين ثيوسيانات كعنصر تحكم لمعايرة أداة ممكنة (انظر تعليمات الشركة المصنعة المناسبة) أو تحديد نطاق الخطي للإشارة FITC.

<ol><li>Twining, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Casein+Assay+for+Proteolytic+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes.</a> Anal. Biochem. 143, 30-34 (1984).</li>
</ol>

صاحب البلاغ هو موظف من الدريتش سيغما التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

لقد أظهرنا مجرد فحص سبيل المثال باستخدام أدوات الكشف عن البروتياز نيون للكشف عن نشاط الأنزيم البروتيني في عينة بيولوجية. وقد تم تحسين هذه المجموعة للكشف عن مجموعة متنوعة من التطبيقات الموجودة في البروتياز الفسيولوجية. انها مناسبة للكشف عن السيستين ، سيرين ، فلزية ، والبروتياز الأسبارتيك ، ولكن قد تكون هناك حاجة للكشف عن بعض التعديلات البروتياز محددة.

<table><tbody><tr><td>&lt;رابط تشعبي=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=PF0100%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=منتسب-_-Jove-_-12346&quot;&gt;طقم الكشف الفلوري عن البروتياز&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;رابط تشعبي=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=H1758%7CSIGMA&amp;amp;N5=بحث_دمج_رقم_القطعة%7Cمفتاح_العلامة_التجارية&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347&quot;&gt;حمض الهيدروكلوريك&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr></tbody></table>

استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

مجموعة أدوات الكشف عن البروتياز نيون يوفر الجاهزة للاستخدام الكواشف للكشف عن وجود نشاط الأنزيم البروتيني. يستخدم هذا الاختبار المسمى الكازين بسيطة للكشف عن نشاط الأنزيم البروتيني مع ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) باعتباره الركيزة. نتائج النشاط البروتيني في الشق الركيزة الكازين FITC المسمى إلى أجزاء أصغر ، والذي لا يعجل في ظل الظروف الحمضية. بعد مرور فترة الحضانة من العينة البروتيني والركيزة ، ويحمض التفاعل مع إضافة حمض التريكلوروسيتيك حمض (TCA). ثم يتم طرد المخلوط مع الركيزة عسر الهضم تشكيل بيليه وأصغر ذوبان حمض الشظايا المتبقية في الحل. هو تحييد وطاف يقاس مضان من الشظايا FITC المسمى. ووصف الإجراء عدة بالكشف عن السيطرة البروتيني التربسين بتركيز حوالي 0.5 ميكروغرام / لتر (5 نانوغرام من التربسين إضافة إلى مقايسة). ويمكن زيادة هذه الحساسية مع وقتا أطول الحضانة ، تصل إلى 24 ساعة. يتم إجراء الفحص في أنابيب microcentrifuge وتوفير إجراءات للكشف عن مضان باستخدام إما cuvettes أو لوحات multiwell.

تم تصميم مجموعة أدوات الكشف عن البروتياز نيون لقياس نشاط الأنزيم البروتيني باستخدام قياس التألق. بل هو أيضا مناسبة للكشف عن كميات ضئيلة من التلوث البروتيني. يستند هذا الأسلوب على hydroysis بروتين من صيغة الملكية للركيزة الكازين FITC المسمى.

توفر مجموعة الكشف الفلوري عن البروتياز كواشف جاهزة للاستخدام للكشف عن وجود نشاط البروتياز. هذا المقايسة البسيطة للكشف عن...

يبدأ هذا البروتوكول بإضافة منظم الحضانة، ومحلول كازين FXI، والعينة التي تحتوي على البروتياز المراد دراسته إلى أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم المزج بلطف والحضانة عند 37 degrees Celsius لمدة 60 دقيقة في الظلام. ولإيقاف التفاعل البروتيني في نهاية فترة الحضانة، يُضاف محلول TCA مع المزج بلطف والحضانة عند 37 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة أخرى في الظلام. ستؤدي هذه الخطوة إلى ترسيب الركيزة غير المتفاعلة.قم بطرد العينة مركزياً لمدة 10 دقائق عند 10,000 Gs، ثم أزل السائل الطافي الذي يحتوي على شظايا FXI المسمى القابلة للذوبان في الحمض. انقل السائل الطافي إلى أنبوب اختبار أو طبق متعدد الفجوات، وخففه باستخدام منظم المقايسة، ثم اقرأ العينة باستخدام مقياس الفلورية.مرحباً، أنا كاري كوب فينيارد، باحثة في منشأة Sigma Aldridge DeKalb في سانت لويس، ميسوري. سأعرض لكم اليوم إجراءً لتحديد نشاط البروتياز باستخدام القياس الفلوري. نستخدم هذا الإجراء في مختبر مراقبة الجودة لدينا لتحديد نشاط البروتياز المنخفض.لنبدأ الآن. بالنسبة لهذا الإجراء، يتم توفير منظم الحضن، ومنظم المقايسة، ومحلول حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA) بتركيز 0.6 عادي كمحاليل جاهزة للاستخدام. قم بتجزئة محلول fite المسمى Cain إلى أحجام أصغر واحفظها في درجة حرارة -20 °C، مع التأكد من حمايتها من الضوء باستخدام قوارير كهرمانية أو لف الأنابيب الشفافة بورق القصدير Ali.يقلل استخدام ركيزة fite Cain من الحاجة إلى دورات التجميد والإذابة المتكررة، حيث أن دورات التجميد والإذابة المتكررة أو الرج أو الخلط القوي لـ fite Cain قد يؤدي إلى انفصال fite عن Cain، مما ينتج عنه خلفية أعلى. في حال معايرة مقياس الفلورية أو تحديد النطاق الخطي لإشارة fit، قم بتحضير محلول fit الضابط. اجعل المحلول طازجاً عن طريق إعادة التكوين في محلول منظم للمقايسة للوصول إلى التركيز المناسب.بمجرد أن يصبح المحلول جاهزاً، يجب حمايته من الضوء. وأخيراً، يتم تحضير ضابط بروتياز التريبسين بإضافة 100 µL من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 1 mM إلى قارورة التريبسين المجفف بالتجميد، مع المزج لفترة وجيزة لضمان ذوبان التريبسين. إن تخزين التريبسين في ظروف حمضية يزيد من استقراره.لاحظ أن محلول التحكم بـ Tripsin حساس لدرجة الحرارة وغير مستقر عند التركيزات المنخفضة. بعد ذلك، ابدأ في تحضير جميع عينات المقايسة، والتي تشمل عينات الاختبار وعينات التحكم والعينات الفارغة طوال فترة المقايسة. حافظ على حماية كل عينة اختبار من الضوء.اجمع في أنبوب طرد مركزي دقيق 20 µL من محلول الحضانة المنظم، و20 µL من ركيزة fit c kian و10 µL من العينة المراد اختبارها. يمكن استخدام أنبوب طرد مركزي دقيق شفاف بشرط حضانة العينة في الظلام. يرجى ملاحظة أيضاً أن العينات الاختبارية التي تظهر نشاطاً عالياً للبروتياز ستحتاج إلى التخفيف.تُستخدم عينة التحكم بالتريبسين كضابط موجب للتأكد من أن المقايسة تعمل بشكل صحيح لتحديد حد الكشف أو لإنشاء منحنى معياري عام؛ ولتحضير التحكم بالتريبسين، اخلط جزءاً واحداً من التريبسين المحمض مع تسعة أجزاء من منظم الحضن أو المنظم المستخدم للعينات المختبرة وامزجهما جيداً. يكون التركيز النهائي الفعال للتريبسين 20 µg/mL. وفي حال استخدام بروتياز محدد مختلف، يتم تحضير محلول التحكم باستخدام ذلك البروتياز المحدد مع منظم مناسب.استمر في تحضير عينة الضبط عن طريق دمج 20 microliters من محلول الحضانة المنظم، و20 microliters من ركيزة fz cain و10 microliters من ضابط trypsin في أنبوب طرد مركزي دقيق. يوصى بتشغيل عينة ضبط واحدة على الأقل تحتوي على 5 nanograms من trypsin مع كل مقايسة أو استخدام التخفيف التسلسلي. أما العينة الأخيرة فهي العينة الفارغة (blank)، ويتم تحضيرها بدمج 20 microliters من محلول الحضانة المنظم، و20 microliters من ركيزة Fitz Caine و10 microliters من الماء فائق النقاء في أنبوب طرد مركزي دقيق.بعد تجهيز الأنواع الثلاثة من العينات، اخلط كل أنبوب برفق ثم قم بالتحضين عند 37 درجة Celsius في الظلام لمدة 60 دقيقة. كن حذراً من الخلط بقوة مفرطة لأن الاضطراب الشديد قد يؤدي إلى ارتفاع خلفية الفلورة وتقليل حساسية المقايسة. يمكن التحضين لمدة تصل إلى 24 ساعة لزيادة الحساسية، ولكن لا يُوصى بفترات تحضين أطول لأن FXI casein قد يبدأ في التحلل.ومرة أخرى، لتجنب الخلفية الفلورية العالية عند اكتمال التحضين، استخدم معدات الوقاية المناسبة لإضافة 150 µL من محلول TCA إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق. عند التحضين مع TCA، يجب ملاحظة وجود غشاوة بيضاء في الأنبوب، وهي عبارة عن خليط الكازين المترسب وغير المهضوم وغير القابل للذوبان؛ اخلط بلطف وحضن عند 37 °C في الظلام لمدة 30 دقيقة. وفي نهاية التحضين مع محلول TCA، قم بطرد الأنابيب مركزياً لمدة 10 دقائق عند 10,000 Gs في درجة حرارة الغرفة.يحتوي السائل الطافي على شظايا Cain الموصومة بـ fite القابلة للذوبان في الحمض والمستخدمة في قياس الفلورة؛ لذا اسحب السائل برفق من أعلى الأنبوب لضمان عدم سحب أي من الرواسب الموجودة في الكريّة إلى طرف الماصة، حيث سيؤدي ذلك إلى قراءة إيجابية كاذبة أثناء عملية الكشف الفلوري اللاحقة. لقياس نشاط البروتياز باستخدام مقياس الفلورة، اخلط 10 µL من السائل الطافي لـ TCA مع 1 mL من محلول التخفيف الخاص بالمقايسة في أنبوب وامزجهما برفق. بالإضافة إلى ذلك، قم بتخفيف معيار FE للتحليل بإضافة 10 µL من FE إلى 1 mL من محلول التخفيف الخاص بالمقايسة. يعطي كل من ضابط FE ومعيار Tripsin مستوى فلورة يجب ألا تتجاوزه العينة. يمكن تخزين محلول السائل الطافي لـ TCA ومحلول التخفيف في الظلام عند درجة حرارة من 2 إلى 8 °C لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل قياس الفلورة.إذا كنت تستخدم cuvette للقياس، فانقل 1 mL من المحلول إلى cuvette مناسبة؛ وفي حال وجود عدد كبير من العينات، يمكن استخدام لوحة ذات 96 بئراً وجهاز قراءة اللوحات الفلورية للحصول على البيانات الفلورية. في هذا المقايسة، يتم توفير fluorescein isothiocyanate كعنصر تحكم لمعايرة الجهاز المحتملة. يظهر هنا نطاق خطي نموذجي لإشارة FS e بعد اتباع الإجراء الموصوف.يؤدي استخدام هذه المجموعة مع فترة تحضين مدتها 30 دقيقة في خطوة التحضين الأولى إلى الحصول على هذا المنحنى القياسي النموذجي لعينات التربسين والعينات الضابطة التي تتراوح من 1.5 nanograms إلى 25 nanograms. أُجريت قياسات الفلورة في طبق متعدد الآبار. حد الكشف في المقايسة هو كمية البروتياز التي تنتج قراءة فلورة معتبرة أعلى من القيمة التي تم الحصول عليها من العينة الفارغة.لقد عرضنا لكم اليوم كيفية استخدام مجموعة تحديد البروتياز من Sigma Aldridge للكشف عن نشاط البروتياز الفلوري في عينة بيولوجية. وبينما تم تحسين هذه المجموعة لاستخدامكم، فمن المهم تذكر أنكم قد تحتاجون إلى إجراء تعديلات طفيفة بما يتناسب مع البروتيازات الخاصة بكم. هذا كل شيء.شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.

use-protease-fluorescent-detection-kit-to-determine-protease

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، نقوم بإجراء تصوير الزيموغرافيا ، وهي تقنية كهربائية ، لتحليل النشاط المحلل للبروتين داخل العينات البيولوجية.

التصوير بالزيموغرافية للببتيد الفلوري: تقنية معدلة للكشف عن نشاط البروتياز باستخدام ركائز الفلورية في المواد الهلامية للزيموغرام

يوضح هذا الفيديو فحصا لفحص النشاط المحلل للبروتياز للبروتياز باستخدام الببتيدات الفلورية. يتعرف البروتياز على موقع الانقسام الخاص به على الببتيد ، ويشقه ويفصل المروي عن الفلوروفور ، مما يتيح انبعاثه الفلوري. يتم الكشف عن إشارة التألق وتحليلها للتحقق من كفاءة الانقسام لمتغيرات الببتيد المختلفة.

مقايسة انقسام الببتيد الفلوروجينيك لفحص النشاط المحلل للبروتياز

يوضح هذا الفيديو فحصا في المختبر لتحديد نشاط بروتياز العدلات سيرين في عينات البلغم. يتم تحضين العينة التي تحتوي على البروتياز المفرز بمراسل فلوري يحمل فكرة تعرف. يتيح انقسام الشكل بواسطة البروتياز انبعاث فلورة فردية من قبل المتبرع والمتقبل للمراسل ، مما يشير إلى نشاط البروتياز في العينة.

اختبار في المختبر لقياس نشاط بروتياز العدلات سيرين باستخدام مبلغ الفلورسنت

يوضح هذا الفيديو كيفية قياس نشاط البروتيازوم في مقصورات فرعية مختلفة من اللوزة الجانبية من أدمغة الفئران المكيفة بالخوف والتحكم فيها باستخدام مقايسة الببتيد الفلوري. يشق البروتيازوم ركيزة الببتيد الفلوروجينيك ، ويطلق جزيئات الفلورسنت ، والتي يتم قياسها كميا باستخدام قارئ الألواح لتقييم نشاط البروتيازوم في كسور البروتين النووي والمشبكي. يشير النشاط النووي المتزايد إلى تغييرات في التعبير الجيني ، بينما يشير انخفاض النشاط المشبكي إلى استقرار البروتين الضروري للحفاظ على الذاكرة على المدى الطويل.

قياس نشاط البروتيازوم في مقصورات مختلفة تحت الخلايا في دماغ الفئران

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحديد اتجاه وطوبولوجيا بروتينات الغشاء المتكاملة في الخلايا الحية. يعتمد هذا البروتوكول البسيط على حساسية البروتياز الانتقائية للوهم بين البروتين المعني و GFP.

تحديد غشاء طوبولوجيا البروتين عن طريق الإسفار البروتياز الحماية (FPP)

البروتياز بشكل محكم التنظيم الإنزيمات المشاركة في العمليات البيولوجية الأساسية، ومبطلات dysregulated النشاط محركات تطور الأمراض المعقدة مثل السرطان. هذا الأسلوب يهدف إلى إنشاء nanosensors التي تقيس حوزتي النشاط في فيفو بإنتاج إشارة انقسام وأن قابلاً للاكتشاف من البول المضيف وتميز المرض.

Nanosensors للكشف عن حوزتي النشاط في فيفو لتشخيص موسع

وهنا، نقدم الإجراءات المفصلة من منصة الفحص حوزتي وضعت مؤخرا الاستفادة من الطرفي ن هيكساهيستيديني/مالتوس-ملزمة البروتين ونيون ركائز المؤتلف تنصهر البروتين تعلق على سطح النيكل-نيتروتراياكتيك حمض [اغروس] المغناطيسي الخرز. ويرد أيضا تحليل العينات المقايسة مفصولة بالصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد في جل لاحقة.

استخدام البروتينات الانصهار المؤتلف في منصة فحص حوزتي فلورسنت وما ريناتوريشن في جل

ونقدم مقايسة انقسام ببتيد فلوروجينيك التي تسمح فرز سريع لنشاط البروتياز proteolytic على الببتيدات يمثل موقع الانقسام الببتيدات الانصهار الفيروسية. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب على أي فكرة من الأحماض الأمينية الأخرى ضمن تسلسل بروتين لاختبار النشاط حوزتي.

"مقايسة الانقسام الببتيد فلوروجينيك" على الشاشة "النشاط بروتيوليتيك": تطبيقات للفيروس التاجي المسبّب لارتفاع البروتين التنشيط

نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتقنية زيموجرافيك معدلة التي تستخدم الببتيدات فلوري كالركيزة القابلة للتحلل بدلاً من البروتينات الأصلية. التفريد العينات البيولوجية في الببتيد نيون زيموجرامس تمكن من كشف طائفة أوسع من البروتياز تقنيات زيموجرافيك السابقة.

الكشف عن نشاط البروتياز الببتيد نيون زيموجرافي

يصف البروتوكول الحالي طريقتين لقياس نشاط الكاسباس من خلال ركيزة فلورية باستخدام قياس التدفق الخلوي أو مقياس الطيف الفلوري.

قياس نشاط كاسباز باستخدام مقايسة الفلورومترية أو قياس التدفق الخلوي

تعلم قياس نشاط البروتياز باستخدام أدوات الكشف الفلورية وقياس التألق لضمان جودة العينات البيولوجية في المختبرات. هذه الطريقة تكشف التلوث الدقيق بالإنزيمات.

استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني

استكشف المزيد من الفيديوهات