استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني

يبدأ هذا البروتوكول بإضافة منظم الحضانة، ومحلول كازين FXI، والعينة التي تحتوي على البروتياز المراد دراسته إلى أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم المزج بلطف والحضانة عند 37 degrees Celsius لمدة 60 دقيقة في الظلام. ولإيقاف التفاعل البروتيني في نهاية فترة الحضانة، يُضاف محلول TCA مع المزج بلطف والحضانة عند 37 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة أخرى في الظلام. ستؤدي هذه الخطوة إلى ترسيب الركيزة غير المتفاعلة.

قم بطرد العينة مركزياً لمدة 10 دقائق عند 10,000 Gs، ثم أزل السائل الطافي الذي يحتوي على شظايا FXI المسمى القابلة للذوبان في الحمض. انقل السائل الطافي إلى أنبوب اختبار أو طبق متعدد الفجوات، وخففه باستخدام منظم المقايسة، ثم اقرأ العينة باستخدام مقياس الفلورية.

مرحباً، أنا كاري كوب فينيارد، باحثة في منشأة Sigma Aldridge DeKalb في سانت لويس، ميسوري. سأعرض لكم اليوم إجراءً لتحديد نشاط البروتياز باستخدام القياس الفلوري. نستخدم هذا الإجراء في مختبر مراقبة الجودة لدينا لتحديد نشاط البروتياز المنخفض.

لنبدأ الآن. بالنسبة لهذا الإجراء، يتم توفير منظم الحضن، ومنظم المقايسة، ومحلول حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA) بتركيز 0.6 عادي كمحاليل جاهزة للاستخدام. قم بتجزئة محلول fite المسمى Cain إلى أحجام أصغر واحفظها في درجة حرارة -20 °C، مع التأكد من حمايتها من الضوء باستخدام قوارير كهرمانية أو لف الأنابيب الشفافة بورق القصدير Ali.

يقلل استخدام ركيزة fite Cain من الحاجة إلى دورات التجميد والإذابة المتكررة، حيث أن دورات التجميد والإذابة المتكررة أو الرج أو الخلط القوي لـ fite Cain قد يؤدي إلى انفصال fite عن Cain، مما ينتج عنه خلفية أعلى. في حال معايرة مقياس الفلورية أو تحديد النطاق الخطي لإشارة fit، قم بتحضير محلول fit الضابط. اجعل المحلول طازجاً عن طريق إعادة التكوين في محلول منظم للمقايسة للوصول إلى التركيز المناسب.

بمجرد أن يصبح المحلول جاهزاً، يجب حمايته من الضوء. وأخيراً، يتم تحضير ضابط بروتياز التريبسين بإضافة 100 µL من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 1 mM إلى قارورة التريبسين المجفف بالتجميد، مع المزج لفترة وجيزة لضمان ذوبان التريبسين. إن تخزين التريبسين في ظروف حمضية يزيد من استقراره.

لاحظ أن محلول التحكم بـ Tripsin حساس لدرجة الحرارة وغير مستقر عند التركيزات المنخفضة. بعد ذلك، ابدأ في تحضير جميع عينات المقايسة، والتي تشمل عينات الاختبار وعينات التحكم والعينات الفارغة طوال فترة المقايسة. حافظ على حماية كل عينة اختبار من الضوء.

اجمع في أنبوب طرد مركزي دقيق 20 µL من محلول الحضانة المنظم، و20 µL من ركيزة fit c kian و10 µL من العينة المراد اختبارها. يمكن استخدام أنبوب طرد مركزي دقيق شفاف بشرط حضانة العينة في الظلام. يرجى ملاحظة أيضاً أن العينات الاختبارية التي تظهر نشاطاً عالياً للبروتياز ستحتاج إلى التخفيف.

تُستخدم عينة التحكم بالتريبسين كضابط موجب للتأكد من أن المقايسة تعمل بشكل صحيح لتحديد حد الكشف أو لإنشاء منحنى معياري عام؛ ولتحضير التحكم بالتريبسين، اخلط جزءاً واحداً من التريبسين المحمض مع تسعة أجزاء من منظم الحضن أو المنظم المستخدم للعينات المختبرة وامزجهما جيداً. يكون التركيز النهائي الفعال للتريبسين 20 µg/mL. وفي حال استخدام بروتياز محدد مختلف، يتم تحضير محلول التحكم باستخدام ذلك البروتياز المحدد مع منظم مناسب.

استمر في تحضير عينة الضبط عن طريق دمج 20 microliters من محلول الحضانة المنظم، و20 microliters من ركيزة fz cain و10 microliters من ضابط trypsin في أنبوب طرد مركزي دقيق. يوصى بتشغيل عينة ضبط واحدة على الأقل تحتوي على 5 nanograms من trypsin مع كل مقايسة أو استخدام التخفيف التسلسلي. أما العينة الأخيرة فهي العينة الفارغة (blank)، ويتم تحضيرها بدمج 20 microliters من محلول الحضانة المنظم، و20 microliters من ركيزة Fitz Caine و10 microliters من الماء فائق النقاء في أنبوب طرد مركزي دقيق.

بعد تجهيز الأنواع الثلاثة من العينات، اخلط كل أنبوب برفق ثم قم بالتحضين عند 37 درجة Celsius في الظلام لمدة 60 دقيقة. كن حذراً من الخلط بقوة مفرطة لأن الاضطراب الشديد قد يؤدي إلى ارتفاع خلفية الفلورة وتقليل حساسية المقايسة. يمكن التحضين لمدة تصل إلى 24 ساعة لزيادة الحساسية، ولكن لا يُوصى بفترات تحضين أطول لأن FXI casein قد يبدأ في التحلل.

ومرة أخرى، لتجنب الخلفية الفلورية العالية عند اكتمال التحضين، استخدم معدات الوقاية المناسبة لإضافة 150 µL من محلول TCA إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق. عند التحضين مع TCA، يجب ملاحظة وجود غشاوة بيضاء في الأنبوب، وهي عبارة عن خليط الكازين المترسب وغير المهضوم وغير القابل للذوبان؛ اخلط بلطف وحضن عند 37 °C في الظلام لمدة 30 دقيقة. وفي نهاية التحضين مع محلول TCA، قم بطرد الأنابيب مركزياً لمدة 10 دقائق عند 10,000 Gs في درجة حرارة الغرفة.

يحتوي السائل الطافي على شظايا Cain الموصومة بـ fite القابلة للذوبان في الحمض والمستخدمة في قياس الفلورة؛ لذا اسحب السائل برفق من أعلى الأنبوب لضمان عدم سحب أي من الرواسب الموجودة في الكريّة إلى طرف الماصة، حيث سيؤدي ذلك إلى قراءة إيجابية كاذبة أثناء عملية الكشف الفلوري اللاحقة. لقياس نشاط البروتياز باستخدام مقياس الفلورة، اخلط 10 µL من السائل الطافي لـ TCA مع 1 mL من محلول التخفيف الخاص بالمقايسة في أنبوب وامزجهما برفق. بالإضافة إلى ذلك، قم بتخفيف معيار FE للتحليل بإضافة 10 µL من FE إلى 1 mL من محلول التخفيف الخاص بالمقايسة. يعطي كل من ضابط FE ومعيار Tripsin مستوى فلورة يجب ألا تتجاوزه العينة. يمكن تخزين محلول السائل الطافي لـ TCA ومحلول التخفيف في الظلام عند درجة حرارة من 2 إلى 8 °C لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل قياس الفلورة.

إذا كنت تستخدم cuvette للقياس، فانقل 1 mL من المحلول إلى cuvette مناسبة؛ وفي حال وجود عدد كبير من العينات، يمكن استخدام لوحة ذات 96 بئراً وجهاز قراءة اللوحات الفلورية للحصول على البيانات الفلورية. في هذا المقايسة، يتم توفير fluorescein isothiocyanate كعنصر تحكم لمعايرة الجهاز المحتملة. يظهر هنا نطاق خطي نموذجي لإشارة FS e بعد اتباع الإجراء الموصوف.

يؤدي استخدام هذه المجموعة مع فترة تحضين مدتها 30 دقيقة في خطوة التحضين الأولى إلى الحصول على هذا المنحنى القياسي النموذجي لعينات التربسين والعينات الضابطة التي تتراوح من 1.5 nanograms إلى 25 nanograms. أُجريت قياسات الفلورة في طبق متعدد الآبار. حد الكشف في المقايسة هو كمية البروتياز التي تنتج قراءة فلورة معتبرة أعلى من القيمة التي تم الحصول عليها من العينة الفارغة.

لقد عرضنا لكم اليوم كيفية استخدام مجموعة تحديد البروتياز من Sigma Aldridge للكشف عن نشاط البروتياز الفلوري في عينة بيولوجية. وبينما تم تحسين هذه المجموعة لاستخدامكم، فمن المهم تذكر أنكم قد تحتاجون إلى إجراء تعديلات طفيفة بما يتناسب مع البروتيازات الخاصة بكم. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.